JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

أحكام الضوابط البطانة الوعائية التوظيف الكريات البيض. ويساهم التسرب الكريات البيض غير كافية أمراض التهابات البشرية. ولذلك، تبحث عن رواية العناصر التنظيمية لتفعيل غشائي ضروري لتصميم تحسين العلاج لأمراض التهابات. وهنا يصف لنا منهجية شاملة لتوصيف المنظمين غشائي الرواية التي يمكن تعديلها الكريات البيض الاتجار أثناء التهاب.

Abstract

الطبقة غشائي أمر ضروري للحفاظ على التوازن في الجسم من خلال السيطرة على العديد من الوظائف المختلفة. تنظيم استجابة التهاب الطبقة غشائي أمر حاسم لمكافحة كفاءة المدخلات الضارة والمساعدة في إنعاش المناطق المتضررة. عندما تتعرض خلايا بطانية لبيئة تحريضية، مثل العنصر الخارجي لغشاء بكتيريا سلبية الغرام، lipopolysaccharide (LPS)، أنها التعبير عن السيتوكينات برو الملتهبة القابلة للذوبان، مثل Ccl5، Cxcl1، و Cxcl10، وتؤدي تفعيل تعميم الكريات البيضاء. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن التعبير عن جزيئات التصاق سيليكتين ه، VCAM-1 والمتكاملة-1 على سطح غشائي التفاعل والتصاق الكريات البيضاء تنشيط الطبقة غشائي، وفي نهاية المطاف التسرب نحو الأنسجة الملتهبة. في هذا السيناريو، الدالة غشائي يجب أحكام تنظيم لأن التنشيط المفرط أو عيب في تجنيد الكريات البيض يمكن أن تؤدي إلى الاضطرابات المتصلة بالتهابات. نظراً للعديد من هذه الاضطرابات لم يكن علاج فعال، يجب التحقيق في استراتيجيات جديدة مع تركيز على طبقة الأوعية الدموية. ونحن نقترح فحوصات شاملة مفيدة للبحث عن المنظمين غشائي الرواية التي تعدل وظيفة الكريات البيض. نحن نحلل غشائي التنشيط باستخدام تعبير محددة الأهداف المتورطين في تجنيد الكريات البيض (مثل، السيتوكينات، المستقطبات، وجزيئات الالتصاق) مع العديد من التقنيات، بما في ذلك: (سلسلة من ردود الفعل بوليميريز الكمية في الوقت الحقيقي رتقبكر)، ووصمة عار الغربية، تدفق فحوصات الخلوي والالتصاق. تحديد وظيفة غشائي في سياق التهاب هذه النهج وهي مفيدة جداً لإجراء فحوصات الكشف لتوصيف المنظمين التهاب غشائي الرواية التي يحتمل أن تكون قيماً لتصميم استراتيجيات علاجية جديدة.

Introduction

الالتهاب استجابة بيولوجية مفيدة ضد العوامل المعدية, مع الهدف الرئيسي للقضاء على مسببات المرض وإصلاح الأنسجة التالفة. تحت ظروف معينة، مثل الالتهابات المزمنة أو أمراض المناعة الذاتية، لا حل التهاب. بدلاً من ذلك، هناك فعل شاذة مع استمرار تسلل الكريات البيضاء، أدى استجابة مناعية مطول الذي يؤدي إلى تلف الأنسجة، التليف، وفقدان الوظيفة، وعموما، والعجز، وفي بعض الحالات وفاة المريض. هذه الاضطرابات البشرية، نشرة مصورة كأمراض التهابات، كلها تنطوي على الأوعية الدموية للسيطرة على التسرب الكريات البيض1،2.

خلايا بطانية تلعب دوراً أساسيا في تنظيم الاستجابة الالتهابية بمراقبة الاتجار الكريات البيض. عندما يتعرض الطبقة البطانية لوسطاء التهابات مثل لبس، البطانة يستريح ينشط وتعرب عن السيتوكينات الموالية التحريضية (Cxcl10، Cxcl5، Cxcl1، إلخ) وجزيئات الالتصاق (سيليكتين ه، VCAM-1 والمتكاملة-1) أن صالح التجنيد لتعميم الكريات البيضاء إلى موقع العدوى. الكريات البيضاء أعدادا من السيتوكينات أطلق سراحهم ثم التوسط المتداول والتفاعل مع الطبقة غشائي من خلال النظراء لاصقة مراسل: بسجل-1 إلى سيليكتين إنتغرين α4β1 VCAM-1 و αLβ2 إنتغرين المتكاملة-1. أخيرا، الكريات البيضاء ترحيل عبر المفرج نحو تركيز التهاب3.

قد تجلى الدور الأساسي الذي تؤديه البطانة في تنظيم الاستجابة الالتهابية في الفئران التي تم تعديلها وراثيا للتعبير عن مستقبلات لبس، مثل عدد القتلى مستقبلات 4 (TLR4)، فقط في خلايا بطانية. كانت هذه الحيوانات غشائي TLR4 قادرة على الاستجابة لالتهاب بوساطة لبس والكشف عن العدوى التي تم إنشاؤها بعد تلقيح البكتيريا، وتحقيق وبناء على ذلك القرار العدوى وبقاء مستويات مماثلة ك الفئران البرية نوع4 , 5.

لمسار البطانة-وينظم الاستجابة الالتهابية، قد تم افترض أن تثبيط التفاعل البطانة الكريات البيض في بعض المراحل سيؤدي إلى الحد من الهجرة عبر-غشائي وتنبؤ أفضل الأمراض المرتبطة بالالتهابات. في الواقع، قد صممت عدة استراتيجيات تستهدف التفاعل التنشيط والكريات البيض-البطانة غشائي تعوق التسرب خلايا المناعية لعلاج أمراض التهابات6،7.

وفي هذا التقرير، يصف لنا مجموعة شاملة من تقنيات في المختبر لتوصيف كامل النشاط غشائي ردا على لبس التحفيز التحريضية ودورها في تنشيط الكريات البيض والانضمام إلى طبقة الأوعية الدموية. نموذج غشائي الخلايا المستخدمة في هذه المخطوطة كان خط الخلية غشائي الرئة الماوس (القانون النموذجي-04)، كما وصفها هورتيلانو et al. 8-تم التحقق من خط الخلية القانون النموذجي-04 في الأدب أن يكون نظاما مناسباً لدراسة تفعيل غشائي9،10. استناداً إلى الاهتمامات البحثية، هذه النهج يمكن أن تكون بسهولة استقراء أي بطانية أو نظم الكريات البيض والشخصية المثيرة. حالما يتم تعريف المعلمات غشائي في الشروط المحددة، يمكن اختبار النظام أدوية جديدة في التجربة المقترحة لتقييم تنشيط الأوعية الدموية. وفي هذا السياق التحريضية، خلايا البطانة اختبارها مع مجمع الفائدة يمكن مقارنتها بشروط مراقبة الخلايا، وأي الفروق الناتجة عن ذلك يجوز إبلاغ نتائج تشخيصية للمخدرات على التنمية والتقدم من التهاب. في الختام، نحن نقترح نظام ذات صلة لتوصيف الأهداف المخدرات الجديدة إلى خلايا بطانية، التي يمكن أن تؤثر في تصميم رواية العلاجات الخاصة بالأوعية الدموية ضد الأمراض المرتبطة بالالتهابات.

Protocol

1-"غشائي خلية ثقافة"

  1. زراعة الأنسجة تعامل لوحات
    1. معطف 100 ملم زراعة الأنسجة لوحات مع الجيلاتين 2.5 مل الحل (يعقم، 0.1% الجيلاتين في الماء المقطر) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية؛ وهذا يمكن أن يطبق بالشكل المطلوب تماما. نضح الحل الجيلاتين وترك لوحات أيردري في هود زراعة الأنسجة.
  2. ظروف زراعة الأنسجة
    1. زراعة الخلايا القانون النموذجي-04 داخل حاضنة بيولوجية (37 درجة مئوية، ورطوبة 95%، 5% CO 2). تنمو الخلايا الموجودة في وسائل الإعلام كاملة من دولبيكو ' s التعديل النسر المتوسطة: "مزيج المغذيات" F-12 (دميم/و-12) وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) و 100 وحدة/مل البنسلين و 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين (P/S).
    2. عد الخلايا بطريقة الدائرة نويباور القياسية، وإضافة الخلايا القانون النموذجي-04 إلى لوحات الجيلاتين تعامل 100 ملم في وسائل الإعلام كاملة 10 مل، في كثافة منخفضة من 2-11 × 10 4 خلايا/سم 2. تقسيم الخلايا 1:3 عندما تصل إلى التقاء.
      ملاحظة: هذا يحدث عادة بعد يومين أو ثلاثة أيام في الثقافة-
    3. ثقافة فرعية الخلايا بغسالة الأطباق مع 10 مل العقيمة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) متبوعاً بإضافة 2 مل يدتا التربسين الحل (0.25% التربسين، 5 ملم يدتا) واحتضان لمدة 3 دقائق في 37 درجة مئوية.
      4. التوقف عن رد فعل يدتا التربسين
    4. واستعادة الخلايا المعلقة بإضافة 10 مل كاملة وسائط الإعلام. زيادة ونقصان لأسفل الخلايا (300 x ز، 5 دقيقة)، وتجاهل المادة طافية، ريسوسبيند بيليه الخلوية في وسائل الإعلام كاملة وثقافة فرعية على النحو الملائم.

2. العلاج لبس والوسطاء

  1. لوحة الخلايا القانون النموذجي-04 في وسائل الإعلام كاملة في التقاء الفرعية في شكل جيد التالية: 7 × 10 5 خلايا/بئر على لوحات 6-جيدا و 2.5 × 10 5 خلايا/بئر على ألواح 96-جيدا.
  2. احتضان ثقافة ح 6 في حاضنة خلية (37 درجة مئوية، ورطوبة 95%، 5% CO 2). تبديل الخلايا إلى وسائل الإعلام غير مكتملة (دميم-F12، P/S) وترك بين عشية وضحاها (على) لمزامنة والحد من نشاط الخلية.
    3. قم بإزالة الوسائط
  3. واختبار المركبات الدوائية الرواية التي تفرخ الخلايا البطانية مع (أو بدون) المخدرات في السؤال (مثلاً DT 10) المخفف في وسائط الإعلام غير مكتملة (30 دقيقة، 37 درجة مئوية)؛ وإضافة 1.4 مل/حسنا للوحة 6-جيدا أو 0.14 مل/أيضا لوحات 96-جيدا)-
    4. تحدي
  4. الخلايا عن طريق إضافة لبس لوسائط الإعلام الحضانة (100 نانوغرام/مل، وتركيز النهائي) للفترة الوقت المحدد في كل فحص. استخدم برنامج تلفزيوني كعنصر تحكم-

3. تقييم "الشخصية النسخي" على "تنشيط البطانة" قبل RT-قبكر

  1. خلايا البذور القانون النموذجي-04 في التقاء الفرعية في الثقافة 6-جيدا لوحات (7 × 10 5 خلايا/جيد). احتضانها ح 6 (37 درجة مئوية، ورطوبة 95%، 5% CO 2) وبعد ذلك انتقل إلى المجاعة المصل (احتضان ON).
  2. قم بإزالة الوسائط وعلاج الخلية غشائي الثقافات مع المخدرات لمصلحة المخفف في وسائط الإعلام غير مكتملة (احتضان 30 دقيقة, 37 درجة مئوية)؛ وإضافة 1.4 مل/حسنا للوحة 6-جيدا (30 دقيقة، 37 درجة مئوية) (أو لا تعامل).
  3. تحدي الخلايا بإضافة 100 نانوغرام/مليلتر لبس لوسائط الإعلام المحتضنة (كما هو موضح في الخطوة 2، 3) واحتضانها لوقف 6 h. رد الفعل بالغسيل مرتين مع برنامج تلفزيوني الباردة وتبقى لوحات في-80 درجة مئوية حتى تجهيز العينة.
    4. ذوبان الجليد اللوحات
  4. استخراج الحمض النووي الريبي
    1. وإضافة 1 مل/بئر الحمض النووي الريبي استخراج العازلة (الفينول 38% و 0.8 م جوانيدينيوم isothiocyanate؛ انظر الجدول للمواد). يترك لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) تحت هوموجيناتي الانفعالات وجمع في أنابيب 1.5 مل.
    2. إضافة 200 ميليلتر كلوروفورم وتحرض برفق إينكوباتي س. 15 دقيقة 3 RT وجهاز الطرد المركزي (11,600 س ز، 15 دقيقة، 4 درجة مئوية)-
    3. مرحلة نقل مائي إلى آخر 1.5 مل الأنبوبة. يعجل بالجيش الملكي النيبالي بإضافة 500 ميليلتر الايزوبروبانول متبوعاً حضانة 10 دقيقة في الرايت ثم الطرد المركزي (11,600 س ز، 4 درجة مئوية)-
    4. تجاهل المادة طافية وتغسل بيليه مع الإيثانول 75% من دوامة الانفعالات والطرد المركزي ثم (7,500 س ز، 4 درجة مئوية)-
    5. أيردري بيليه، وجعل الجيش الملكي النيبالي في 25 ميليلتر نقي ح 2 س بحضانة لمدة 10 دقائق في 55 ° C. إبقاء الجيش الملكي النيبالي في-80 درجة مئوية حتى تجهيز العينة.
  5. الكمية والنقاء من الجيش الملكي النيبالي
    1. قياس تركيز الحمض النووي الريبي عن طريق قياس امتصاص العينة في 260 nm في جهاز المطياف الضوئي (انظر الجدول للمواد).
      2. نانومتر
    2. التدبير في 230 و 280 نيوتن متر لتحديد نقاء الحمض النووي الريبي.
      ملاحظة: تشير النسبة في 260/280 إلى تلوث البروتين أو الفينول. مقبول بنسبة ما يقرب من 2. النسبة في 260/230 يشير إلى يدتا أو الكربوهيدرات أو الملوثات الفينول. القيم بين 2.0-2.2 مقبولة.
  6. سلامة "فحص الحمض النووي الريبي"
    1. تشغيل 2 ميكروغرام من مجموع الجيش الملكي النيبالي، والجيش الملكي النيبالي سلم على نسبة 1.5 ٪ يشوه [اغروس] هلام؛ وتصور على نظام توثيق هلام (انظر الجدول للمواد)-
      ملاحظة: تبين نسبة 2:1 من العصابات الرنا الريباسي 28S و 18S واضحة وحادة الحمض النووي الريبي سليمة. جزئيا للتدهور يحل الجيش الملكي النيبالي كظهور بقع.
  7. RT-قبكر
    1. توليف الحمض النووي التكميلية (كدنا) من الحمض النووي الريبي واحد الذين تقطعت بهم السبل عقب القياسية البروتوكول (انظر الجدول للمواد) 11-
  8. تقييم التعبير الجيني ب RT-قبكر
    1. إعداد الخليط رد فعل لكل عينة: كدنا ميليلتر مزيج 2 و 7 ميليلتر نيون مجمع، 300 نانومتر التمهيدي إلى الأمام و 300 نانومتر عكس التمهيدي (الجدول 1) في الحجم النهائي ميليلتر 13، وإضافة إلى لوحة الرد 96-جيدا (انظر الجدول للمواد)-
    2. ختم اللوحة الغطاء لاصق ضوئية، أجهزة الطرد المركزي (300 x ز، 1 دقيقة)، وتشغيل رد فعل على "نظام PCR الوقت الحقيقي" (بداية ساخنة 95 درجة مئوية 20 s متبوعاً بدورات 40: 95 درجة مئوية 3 s و 60 درجة مئوية لمدة 30 ق) (انظر الجدول للمواد).
    3. تحليل النتائج التي كوانتيتاتيون النسبية باستخدام الأسلوب المقارن 2 -ΔΔCt مع التدبير المنزلي الجينات جليسيرالديهيدي-3-الفوسفات نازعة (جابده) أو فوسفوبروتين ريبوسومال الحمضية P0 (36B4) 12 .

4. تقييم "غشائي التنشيط" واسطة "التدفق الخلوي"

  1. علاج الخلايا القانون النموذجي-04 بعد الشروط الموضحة في القسم 2 وتقييم التغييرات في البروتينات السطحية غشائي بالتدفق الخلوي-
  2. فصل الخلايا بعد ح 6 من التحفيز لبس مع التربسين يدتا الطريقة الموضحة في الخطوة 1.2.3، وتغسل مع وسائط الإعلام غير مكتملة في 4 ° C.
    3. عد الخلايا باستخدام الأسلوب دائرة نويباور
  3. ووضع 10 × 10 4 خلايا في أسفل يو 96-جيدا لوحات. أجهزة الطرد المركزي (300 x ز، 5 دقيقة) وتجاهل طافية 180 ° المفاجئة من المعصم من أعلى إلى أسفل والانتعاش السريع للموقف الأصلي-
  4. إضافة 50 ميليلتر من الأجسام المضادة المحددة المخفف في وسائط الإعلام غير مكتملة (10 ميكروغرام/مل، وتركيز النهائي) إلى الخلايا واحتضان (30 دقيقة، 4 درجة مئوية)-
    5. أغسل
  5. الخلايا مرتين wايث وسائط الإعلام غير مكتملة بعد الإجراء الموضح في الخطوة 4، 3، واحتضان مع 50 ميليلتر في 10 ميكروغرام/مل من جسم الثانوية المقابلة بالإضافة إلى فيتك أو المتقارن مماثلة (30 دقيقة، 4 درجة مئوية في مساحة الظلام).
  6. تغسل الخلايا مرة واحدة مع وسائط الإعلام غير مكتملة تليها يغسل PBS. استعادة الخلايا مع ميليلتر 300 برنامج تلفزيوني استخدام تلميحات ماصة 1 مل ووضع في أنابيب الخلوي-
  7. تقييم العينات في نظام التدفق الخلوي (انظر الجدول للمواد). ضبط السكان خلية من الأمام والجانب نثر المعلمات. بوابة سكان الفائدة. ضبط بوابات استناداً إلى عنصر التحكم السلبي من الخلايا المحتضنة مع التحكم ايستب. تحليل النتائج بالنسبة المئوية للخلايا إيجابية أو يعني fluorescence كثافة 8-

5. تقييم "غشائي التنشيط" واسطة "لطخة الغربية"

  1. البذور البطانة في التقاء الفرعية في الثقافة 6-جيدا لوحات (7 × 10 5 خلايا/جيد) وتعامل مع لبس كما هو موضح في المقطع 2. تحليل التعبير البروتين الملتهبة بالتالي بروتوكول لطخة غربية-
  2. وقف التحفيز لبس في نقاط زمنية مختلفة توضيح الجوانب المختلفة للاستجابة غشائي:
    1. التأكد من التشكيل الجانبي للبروتينات التحريضية بعد ح 6 من لبس التحفيز.
    2. تحديد الخلية إشارات كل 15 دقيقة خلال فترة 60 دقيقة-
  3. وفي كلتا الحالتين، وقف رد الفعل بالغسيل مرتين مع برنامج تلفزيوني الباردة وتخزين العينات في-80 درجة مئوية حتى تجهيز العينة.
    4. المخزن المؤقت
  4. ليس الخلايا واستخراج البروتين
    1. إضافة 200 ميليلتر تحلل لكل بئر (1% الفاعل غير الأيونية، 10 مم تريس-HCl، 1 مم يدتا، كلوريد الصوديوم 150 مم، بيروفوسفات صوديوم 30 ملم، وفلوريد الصوديوم 50 مم، أورثوفاناداتي الصوديوم 2.1 ملم في درجة الحموضة 7.6، تستكمل مع مثبط البروتياز كوكتيل) (انظر الجدول للمواد)-
    2. احتضانها لتتخلص من الآبار مع تلميح ماصة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية تحت الانفعال، وجمع هوموجيناتي في أنابيب 1.5 مل.
    3. الطرد المركزي هذه الأنابيب في 11,600 س ز 4 ° C.
    4. تخزين المادة طافية في أنابيب نظيفة 1.5 مل في-80 درجة مئوية حتى التجهيز.
  5. قياس تركيز البروتين بمقايسة حمض بيسينتشونينيك عقب القياسية البروتوكول (انظر الجدول للمواد) 13-
  6. حل ميكروغرام 30 من مجموع البروتين لكل عينة بالأسلوب القياسي من 0.1% الصوديوم دوديسيل كبريتات، 10% polyacrylamide هلام استشراد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) 14. تشغيل عينات مع 10 ملم β-mercaptoethanol (شروط الحد) أو بدون (الحد من غير شروط) اعتماداً على جسم المستخدمة للكشف عن بروتين الفائدة.
  7. نقل البروتينات المنفصلين عن ذويهم من جل polyacrylamide لغشاء نقل ثنائي الفلوريد (PVDF) الفينيليدن مع 0.45 ميكرومتر حجم المسام باستخدام الإجراء القياسي.
  8. بعد انتقال، يغسل الغشاء مرتين مع برنامج تلفزيوني، بوليسوربيت 0.1%-20 (برنامج تلفزيوني-T) وحظر مواقع الربط غير محدد عن طريق إضافة 20 مل 2% جيش صرب البوسنة تضعف في برنامج تلفزيوني-T للكشف عن فوسفوبروتين أو 5% غير الدسم الحليب الجاف في برنامج تلفزيوني-T لمجموع البروتينات، تحت التحريض (90 دقيقة، RT).
  9. تضعف جسم المحدد في 10 مل من المخزن المؤقت حظر المناسبة في تركيز الموصى بها واحتضان الغشاء تحت التحريض (على، 4 درجة مئوية). وبدلاً من ذلك، وضع الغشاء في أكياس بلاستيكية محكمة الإغلاق وتستخدم 5 مل جسم المخفف.
  10. في اليوم التالي يغسل الغشاء ثلاث مرات (الزائدة في برنامج تلفزيوني-T، 15 دقيقة، الرايت).
  11. إينكوباتي الغشاء تحت التحريض (30 دقيقة, RT) مع 10 مل من جسم الثانوي مراسل منضمة إلى الفجل البيروكسيديز (HRP) المخفف في المضيفين في المخزن المؤقت لحظر المناسبة.
  12. يغسل الغشاء ثلاث مرات تحت التحريض (الزائدة في برنامج تلفزيوني-T، 15 دقيقة، الرايت).
  13. احتضان الغشاء لمدة 1 دقيقة مع 0.1 مل/سم 2 من تشيميلومينيسسينسي تعزيز الركيزة البيروكسيديز (القامة). ضع الغشاء استنزفت بين ورقتين من البلاستيك الشفاف، وإدراجها في نظام الكشف عن تشيميلومينيسسينسي الذي يتضمن كاميرا "الجهاز تشارجيدكوبليد" (CCD).
    1. استخدام الكاميرا CCD للكشف عن الإشارات والبرامج الخاصة به لتسجيل الصور مع البرنامج التراكمي (صور عرض الإشارات المتراكمة في كل 30 ثانية التعرض لفترة إجمالية 15 دقيقة)-
  14. قياس كثافة الفرقة بقياس كثافة استخدام البرمجيات إيماجيج بعد البروتوكول، المذكورة في دليل المستخدم 15-
    1. فتح النموذج في البرنامج إيماجيج وحدد الفرقة الاهتمام باستخدام أداة التحديد المستطيلة.
    2. حدد كلين والصحافة الأول مؤامرة الممرات للحصول على قطع الأراضي الشخصية.
    3. تحديد مجال القمم مع اختيار الخط المستقيم.
    4. قياس حجم كل الفرقة بالنقر داخل كل ذروة.
    5. تمثل النتائج فيما يتعلق بتحميل عنصر التحكم البروتين (β-أكتين، توبولين، إلخ).

6. تقييم "عامل غشائي صدر" من "تنشيط الكريات البيض" "فحوصات التصاق"

  1. الحصول على وسائط الإعلام مكيفة غشائي.
    1. علاج الخلايا القانون النموذجي-04 كما هو مبين في الباب 2 وجمع ثقافة طافية بعد التحفيز 24 ساعة مع لبس (100 نانوغرام/ملليلتر).
    2. جمع وسائل الإعلام مكيفة من تعامل القانون النموذجي-04 خلايا وأجهزة الطرد المركزي (600 x ز). تبقى المادة طافية في مختبرين 0.5 مل في-80 درجة مئوية حتى استخدام.
  2. المقايسة التصاق الكريات البيض
    1. معطف لوحات 96-جيدا مع 50 ميليلتر/جيدا من البروتينات المصفوفة خارج الخلية المحددة المخفف في برنامج تلفزيوني (باستثناء الكولاجين، الذي هو المخفف في حمض الخليك 0.1 M): فيبرونيكتين (1-10 ميكروغرام/مل )، لامينين (1-10 ميكروغرام/مل) والكولاجين النوع الأول (10-40 ميكروغرام/مل). على إجازة في 4 درجات مئوية.
    2. تجاهل وسائل الإعلام المغلفة وحظر مواقع الربط غير محدد على الآبار مع 150 ميليلتر برنامج تلفزيوني، 1% جيش صرب البوسنة إبطال الحرارة (1 دقيقة، 100 درجة مئوية) لمدة 90 دقيقة في الرايت
    3. غسل الآبار مرتين مع برنامج تلفزيوني وإضافة 100 ميليلتر من التي تم جمعها سابقا غشائي مكيفة الوسائط (القسم 6.1) إلى الآبار.
      ملاحظة: لوحات جاهزة لأداء الفحص الالتصاق.
    4. الثقافة الماوس بلعم الوحيدات الخلية خط J774 في حاضنة بيولوجية (37 درجة مئوية، ورطوبة 95%، 5% CO 2) مع روزويل بارك التذكاري المعهد المتوسط (ربمي)، 10% FBS، 1% P/س.
      ملاحظة: الخلايا J774 تنمو في تعليق-
    5. جمع الخلايا J774 إلى أنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي (300 x ز، 5 دقيقة). تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلوية مع وسائل الإعلام الحرة المصل 10 مل. عد الخلايا في دائرة نويباور. الطرد المركزي الخلايا (300 x ز، 5 دقيقة) وتجاهل المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في وسائل الإعلام خالية من المصل في خلايا 15 × 10 4 J774 الواحدة 50 ميليلتر الوسائط.
    6. إضافة 15 × 10 4 J774 الخلايا لكل جيدا في وسائل الإعلام 50 خالية من المصل ميليلتر واحتضان لمدة 15 دقيقة عند درجة 4 مئوية تليها ح 1 في 37 درجة مئوية في الحاضنة الخلية 2 CO.
    7. غسل الآبار مرتين، بلطف بإضافة برنامج تلفزيوني الحارة؛ والطرد المركزي (300 x ز، 5 دقيقة) وتجاهل المادة طافية بواسطة الخاطف 180° من المعصم من أعلى إلى أسفل والانتعاش السريع إلى الموقع الأصلي. إصلاح الخلية المرفقةs بإضافة 100 ميليلتر/بئر بارافورمالدهيد 4% (PFA) في برنامج تلفزيوني واحتضان (10 دقيقة، RT).
    8. تجاهل وسائل الإعلام بلطف وبيرميبيليزي في الخلايا التي تحتوي على الميثانول 2% في برنامج تلفزيوني لمدة 2 دقيقة في الرايت تجاهل وسائل الإعلام بلطف ووصمة عار الخلايا بإضافة 50 ميليلتر/جيدا من 0.5% الكريستال البنفسجي في الميثانول 20% ل 90 ثانية في الرايت
    9. أغسل اللوحة مع وفرة المياه الجارية وتجاهل السائل الزائد وترك الأمر أيردري. تقرير الخلايا المرفقة بالكاميرا الرقمية بالإضافة إلى مجهر خفيفة-
    10. يضعف الخلية تلطيخ بإضافة 100 ميليلتر/جيدا من سترات الصوديوم 0.1 M، الإيثانول 50%. مقياس امتصاص 545 نانومتر ويمثل التوصل إلى النتائج كوحدات التعسفي لامتصاص أو النسبة المئوية للالتصاق بالنظر في 100 ٪ كالتصاق الخلية للآبار المغلفة بتركيز أعلى من يجند

7. اختبار "غشائي التنشيط" واسطة "الإنزيم" المشارك التصاق الكريات البيض-البطانة

  1. علاج الخلايا القانون النموذجي-04 على لوحات 96-جيدا كما هو موضح في القسم 2 واحتضان مع لبس (ح 6، 37 درجة مئوية)-
  2. فلوريسسينتلي تسمية الخلايا J774 مع إستر سوكسينيميديل كاربوكسيفلوريسسين (كسفي)- الخلايا
    1. المياه والصرف الصحي J774 في برنامج تلفزيوني عقب الإجراء في 6.2.5. عدد الخلايا التي نويباور دائرة الأسلوب وريسوسبيند في 1 × 10 6 خلايا/مل في برنامج تلفزيوني، جيش صرب البوسنة 0.1%-
    2. احتضان الخلايا مع كفسي (5 ميكرون، وتركيز النهائي) لمدة 20 دقيقة في 37 درجة جيم إضافة 5 مل وسائط الإعلام غير مكتملة، واحتضان (5 دقائق، 4 درجة مئوية)-
    3. يغسل مرة واحدة مع وسائل الإعلام غير كاملة كما هو موضح في 6.2.5.، ريسوسبيند في 15 × 10 4 خلايا/100 ميليلتر والمضي قدما للانزيم المشارك الالتصاق.
  3. بعد العلاج البطانة، غسل الآبار ثلاث مرات مع وسائل الإعلام غير مكتملة. إضافة خلايا كفسي-J774 (15 × 10 4 خلايا/100 ميليلتر) لكل بطانية المغلفة بشكل جيد. احتضان لوحة لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية تليها 60 دقيقة في 37 درجة مئوية.
  4. غسل الآبار بلطف، كما هو موضح في 6.2.7. واستخدام برنامج تلفزيوني دافئة وتقرير انضمام J774 إلى الطبقة غشائي بالطريقتين التاليتين:
    1. الخلايا في 0.1 M تريس-HCl الأس الهيدروجيني 8.8، الحزب الديمقراطي الصربي 1% (100 ميليلتر في البئر) وقياس إشارة كفسي-J774 من فلوروميتري (الإثارة/الانبعاثات = 492 نانومتر nm/517). وتمثل النتائج كوحدات التعسفي من شدة الأسفار أو النسبة المئوية للانضمام فيما يتعلق بمراقبة إيجابية (إشارة من مجموع الخلايا إضافة لكل بئر).
    2. إصلاح الخلايا 4% منهاج العمل والتقرير ربط الخلايا كفسي-J774 بالبطانة التي تصور تحت مجهر الأسفار (الإثارة/الانبعاثات = 492 نانومتر nm/517)-

النتائج

تقييم المستحثة بلبس غشائي خلية التنشيط بواسطة RT-قبكر

الخلايا القانون النموذجي-04 المصل جوعاً كانت تحفزها 100 نانوغرام/مليلتر من لبس ح 6، وتم تقييم التعبير الجيني غشائي استخدام الرايت قبكر بمقارنة التعبير عن علامات التنشيط إلى حالة الراحة. كم...

Discussion

ويصف هذا البروتوكول غشائي تكنولوجيا التدرجي الذي يرسي الأساس لاستكشاف الآليات الرواية التي تشارك في تنظيم الاستجابة الالتهابية. تستند إلى دراسة النشاط غشائي تحفزها لبس هذه النهج وتقييم الخطوات الحاسمة التي تشارك في تجنيد الكريات البيض خلال الاستجابة الالتهابية، على وجه التحديد: إطلاق ?...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

وأيده هذا العمل y وزارة الاقتصاد دي كومبيتيتيفيداد (مينيكو) ومعهد الصحة كارلوس الثالث (إيسسييي) (منحة رقم 1149/16 إييربي للجامعة؛ مبي 1410/09 إلى س. هورتيلانو)؛ قبل مينيكو عن طريق أون فوندو لبحوث الصحة (الجبهة الإسلامية للإنقاذ) (المنح الأرقام PI11.0036 و PI14.0055 إلى هورتيلانو س.). وأيد هيرانز س. إييربي 1149/16 من إيسسييي.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
GelatinSigmaG9391
DMEM-F12LonzaBE12-719F
Fetal Bovine SerumSigmaA4503
Penicillin streptomycinLonzaDE17-602E
TrypsineLonzaBE17-160E
EDTASigmaED2SS
LPSSigmaL2880
TrizolSigmaT9424RNA extraction buffer
IsopropanolSigma33539
Ethanol absolutoPanreac1,310,861,612
Pure H2OQiagen1017979RNAse free
AgarosePronadisa8020
Stain for agarose gelsInvitrogens33102
SuperScript III First-Strand SynthInvitrogen18080051Reagents for RT-PCR
Fast SYBR Green Master MixApplied Biosystems4385610Fluorescent stain for qPCR
MicroAmp Fast Optical 96-WellApplied Biosystems4346906Plates for qPCR
U-bottom 96 well platesFalcon353072
Cytometry tubesFalcon352054
TX100Panreac212314Non-ionic surfactant
Tris-HClPanreac1,319,401,211
Sodium chlorideMerck1,064,041,000
Sodium pyrophosphateSigma221368
Sodium fluorideSigmaS7920
Sodium orthovanadatesigma13721-39-6
Protease inhibitor cocktailsigmaP8340
Pierce BCA Protein Assay KitPierce23225Reagents for bicinchoninic acid assay
β-mercaptoethanolmerck805,740
PVDF Transfer Membrane, 0.45 µmThermo Scientific88518
Tween-20Panreac1,623,121,611Polysorbate 20
PBSLonzaBE17-515Q
ECLMilliporeWBKLS0500
FibronectinSigmaF1141
LamininSigmaL2020
Collagen type ISigmac8919
Acetic acidPanreac1,310,081,611
Trypan blueSigmaT8154
ParaformaldehydeSigmaP6148
MethanolPanreac1,310,911,612
Crystal violetSigmaHT90132
Sodium citrateSigmaC7254
Ethanol 96%Panreac1,410,851,212
CFSESigma21888
RPMILonzaBE12-115F
SDSBio-Rad161-0418
Infinite M200TecanM200Multi mode microplate reader
Gel Doc 2000Bio-Rad2000Gel documentation system
StepOnePlusApplied BiosystemsStepOnePlusqPCR system
MACSQuant Analyzer 10Miltenyi BiotecAnalyzer 10Cytometry equipment
ChemiDoc MPBio-RadMPChemiluminescence detection system
NameCompanyCatalog NumberComments
Antibodies
PECAM-1BD Biosciences553370Use at 10 µg/mL
ICAM-2Biolegend1054602Use at 10 µg/mL
E-selectinBD Biosciences553749Use at 10 µg/mL
VCAM-1BD Biosciences553330Use at 10 µg/mL
ICAM-1Becton Dickinson553250Use at 10 µg/mL
anti-rat IgG-FITCJackson Immuno Research112-095-006Use at 10 µg/mL
anti armenian hamster-FITCJackson Immuno Research127-095-160Use at 10 µg/mL
Rat IgG isotyope controlInvitrogen10700Use at 10 µg/mL
Armenian hamster IgG isotype controlInvitrogenPA5-33220Use at 10 µg/mL
P-IκΒ-αCell Signaling2859Use at 10 µg/mL
β-ActinSigmaA5441Use at 10 µg/mL
P-ERKCell Signaling9101Use at 10 µg/mL
anti-mouse HRPGE HealthcareLNXA931/AEUse at 1:10,000
anti-rabbit HRPGE HealthcareLNA934V/AGUse at 1:10,000
anti-rat HRPSanta CruzSc-3823Use at 1:10,000

References

  1. Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn's disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
  2. Skeoch, S., Bruce, I. N. Atherosclerosis in rheumatoid arthritis: is it all about inflammation?. Nat Rev Rheumatol. 11 (7), 390-400 (2015).
  3. Gerhardt, T., Ley, K. Monocyte trafficking across the vessel wall. Cardiovasc Res. 107 (3), 321-330 (2015).
  4. Andonegui, G., et al. Mice that exclusively express TLR4 on endothelial cells can efficiently clear a lethal systemic Gram-negative bacterial infection. J Clin Invest. 119 (7), 1921-1930 (2009).
  5. McDonald, B., Jenne, C. N., Zhuo, L., Kimata, K., Kubes, P. Kupffer cells and activation of endothelial TLR4 coordinate neutrophil adhesion within liver sinusoids during endotoxemia. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (11), G797-G806 (2013).
  6. Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat Rev Immunol. 7 (10), 803-815 (2007).
  7. Chamorro, &. #. 1. 9. 3. ;., Dirnagl, U., Urra, X., Planas, A. M. Neuroprotection in acute stroke: targeting excitotoxicity, oxidative and nitrosative stress, and inflammation. Lancet Neurol. 15 (8), 869-881 (2016).
  8. Hortelano, S. ILK mediates LPS-induced vascular adhesion receptor expression and subsequent leucocyte trans-endothelial migration. Cardiovasc Res. 86 (2), 283-292 (2010).
  9. Palazón, A. Agonist anti-CD137 mAb act on tumor endothelial cells to enhance recruitment of activated T lymphocytes. Cancer Res. 71 (3), 801-811 (2011).
  10. Jiménez-García, L. 8,9-Dehydrohispanolone-15,16-lactol diterpene prevents LPS-triggered inflammatory responses by inhibiting endothelial activation. Biochem J. 473 (14), 2061-2071 (2016).
  11. . SuperScript® III First-Strand Synthesis System for RT-PCR Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/superscriptIIIfirststrand_pps.pdf (2013)
  12. Livak, K. J., Schmittge, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  13. . Pierce BCA Protein Assay Kit Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf (2017)
  14. He, F. Laemmli-SDS-PAGE. BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).
  15. . ImageJ User Guide Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/user-guide-USbooklet.pdf (2017)
  16. Hohsfield, L. A., Humpel, C. Intravenous infusion of monocytes isolated from 2-week-old mice enhances clearance of Beta-amyloid plaques in an Alzheimer mouse model. PloS One. 10 (4), e0121930 (2015).
  17. Hofland, R. W., Thijsen, S. F. T., Verhagen, M. A. M. T., Schenk, Y., Bossink, A. W. J. Tuberculosis during TNF-α inhibitor therapy, despite screening. Thorax. 68 (11), 1079-1080 (2013).
  18. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
  19. Tedgui, A., Mallat, Z. Anti-inflammatory mechanisms in the vascular wall. Circ Res. 88 (9), 877-887 (2001).
  20. Zheng, Y., Humphry, M., Maguire, J. J., Bennett, M. R., Clarke, M. C. H. Intracellular interleukin-1 receptor 2 binding prevents cleavage and activity of interleukin-1α, controlling necrosis-induced sterile inflammation. Immunity. 38 (2), 285-295 (2013).
  21. Pripp, A. H., Stanišić, M. The correlation between pro- and anti-inflammatory cytokines in chronic subdural hematoma patients assessed with factor analysis. PloS One. 9 (2), e90149 (2014).
  22. Guha, M., Mackman, N. LPS induction of gene expression in human monocytes. Cell Signal. 13 (2), 85-94 (2001).
  23. Tabas, I., Glass, C. K. Anti-inflammatory therapy in chronic disease: challenges and opportunities. Science. 339 (6116), 166-172 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

127 lipopolysaccharide

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved