JoVE Logo
저자
연락처

로그인

JoVE 비디오를 활용하시려면 도서관을 통한 기관 구독이 필요합니다. 전체 비디오를 보시려면 로그인하거나 무료 트라이얼을 시작하세요.

기사 소개

  • 요약
  • 초록
  • 서문
  • 프로토콜
  • 결과
  • 토론
  • 공개
  • 감사의 말
  • 자료
  • 참고문헌
  • 재인쇄 및 허가

요약

혈관 내 피는 단단히 백혈구 신규 모집을 제어합니다. 부적당 한 백혈구 넘쳐 흐름 인간의 염증 성 질병에 기여 한다. 따라서, 내 피 활성화의 새로운 규제 요소에 대 한 검색은 염증 성 질환에 대 한 향상 된 치료를 디자인 해야 합니다. 여기, 우리는 포괄적인 방법론 소설 내 피 레 귤 레이 터 백혈구 중 염증 매매 하는 것을 수정할 수 있는 특성을 설명 합니다.

초록

내 피 층은 여러 가지 기능을 제어 하 여 신체의 항상성 유지 하기 위한 필수적입니다. 내 피 층에 의해 염증 반응의 규칙은 효율적으로 유해한 입력에 대 한 싸움과 손상 된 지역의 복구에 도움이 중요 합니다. 내 피 세포는 선 동적인 환경, 그람 음성 세균 막, lipopolysaccharide (LPS)의 외부 구성 요소에 노출 되 면 그들은 Ccl5, Cxcl1 등 Cxcl10, 수용 성 프로 염증 성 cytokines를 표현 하 고 방 아 쇠는 순환 하는 백혈구의 활성화입니다. 또한, 내 피 표면에 접착 분자 전자 selectin VCAM-1, ICAM-1의 식 상호 작용 및 접착 내 피 레이어, 그리고 결국 염증된 조직 향해 넘쳐 흐름을 활성화 된 백혈구의 수 있습니다. 이 시나리오에서는 내 피 기능 해야 합니다 엄격 하 게 규제 되어야 백혈구 신규 모집에 과도 한 또는 결함이 활성화 염증 관련 질환으로 이어질 수 있기 때문에. 이후 많은 이러한 장애의 효과적인 치료를 하지 않아도, 혈관 층에 초점을 맞춘 새로운 전략을 조사 해야 합니다. 우리 소설 내 피 레 귤 레이 터 백혈구 기능을 수정 하는 검색에 유용한 종합적인 분석 제안 합니다. 우리를 포함 한 여러 가지 기술로 특정 식 대상 (예: cytokines, 발산, 및 접착 분자) 백혈구 신규 모집에 참여를 사용 하 여 내 피 활성화 분석: 실시간 정량 중 합 효소 연쇄 반응 ( RT-qPCR), 서쪽 오 점, cytometry 및 접착 분석 흐름. 이러한 접근 염증 맥락에서 내 피 기능을 결정 하 고 소설 내 피 염증 성 레 귤 레이 터 설계 새로운 치료 전략에 대 한 잠재적으로 가치 있는 특징을 심사 분석을 수행 하는 매우 유용 합니다.

서문

염증은 병원 체를 제거 하 고 손상 된 조직을 복구 하는 주요 목적으로 전염 성 요원에 대 한 유익한 생물학 응답 이다. 만성 감염 또는 면역 질환과 같은 특정 조건에서 염증이 해결 되지 않습니다. 대신, 백혈구, 조직 손상, 섬유 증, 기능, 및 전반적인 손실, 장애 및 환자 일부의 경우 죽음에 리드 장기간된 면역 반응의 결과로의 지속적인 침투와 탈 선 반응이입니다. 이러한 인간의 장애, 염증 성 질환으로 카탈로그 모든 백혈구 넘쳐 흐름1,2의 컨트롤에 대 한 혈관 포함.

내 피 세포 백혈구 밀매를 제어 하 여 염증 반응의 규칙에 있는 근본적인 역할을 재생 합니다. 내 피 레이어 LPS 등 염증 성 중재자에 노출은, 휴식 endothelium 활성화 하 고 프로 염증 성 cytokines (Cxcl10 Cxcl5, Cxcl1, 등)와 접착 분자 (전자 selectin VCAM-1, ICAM-1)를 표현 하 고 그 은혜 순환 하는 백혈구는 감염의 사이트에 모집 다음 릴리스 cytokines에 의해 액 백혈구 중재 압 연 및 특 파 원 접착제 대응을 통해 내 피 레이어와 상호 작용: selectin, α4β1 integrin VCAM-1 및 αLβ2 integrin ICAM-1 PSGL-1. 마지막으로, 백혈구는 염증3의 초점으로 맥 관 구조에 걸쳐 마이그레이션합니다.

염증 반응 조절에 피 내 막의 필수적인 역할 유전자 LPS 수용 체, 통행세 같이 수용 체 4 (TLR4), 내 피 세포에만 표현 하기 위해 수정 된 쥐에 증명 되었습니다. 이 내 피 TLR4 동물 LPS 중재 염증 박테리아 접종 후 발생 하는 감염을 감지 하 고 대응 하 고 따라서 감염 확인 및 강포한 유형 쥐4 으로 비슷한 수준에서 생존을 달성할 수 있었다 , 5.

피 규제 염증 반응 통로 대 한 그것은 되었습니다 가정 하는 백혈구 내 피 상호 작용의 어떤 단계에서 저해 트랜스 내 피 마이그레이션에 대 한 더 나은 예 지의 감소 귀 착될 것입니다. 염증 관련 된 질병입니다. 사실, 내 피 활성화 및 백혈구 endothelium 상호 작용을 대상으로 하는 여러 전략 염증 성 장애6,7에 대 한 치료로 면역 세포의 넘쳐 흐름을 방해 하기 위하여 설계 되었습니다.

이 보고서에서 우리는 생체 외에서 기술 완벽 하 게 특성화 염증 성 자극 LPS에 내 피 활동 및 백혈구 활성화 및 혈관 층에 접착의 역할의 철저 한 그룹을 설명 합니다. 이 원고에 사용 되는 내 피 세포 모델은 마우스 폐 내 피 세포 라인 (MLEC-04), Hortelano 그 외 여러분 에 의해 설명 된 대로 8. 내 피 활성화9,10공부 하는 적절 한 시스템 문학에는 MLEC-04 셀 라인 검증 되었습니다. 연구 관심 분야에 따라, 이러한 접근 수 있습니다 쉽게 추정 될 어떤 내 피에 백혈구 시스템 및 염증 성 프로필 또는. 선택한 조건에 내 피 매개 변수를 정의한 후 시스템 혈관 활성화를 평가 하기 위해 제안 된 실험에 대 한 새로운 약물을 테스트할 수 있습니다. 이 염증 성 맥락에서 관심의 화합물과 테스트 내 피 세포는 세포의 제어 조건에 비교 될 수 있다 하 고 결과 차이 약물의 개발 및 염증의 진행에 전조 결과 알릴 수 있습니다. 결론, 우리는 염증 관련 질병에 대 한 소설 관련 혈관 치료의 디자인에 영향을 미칠 수 있는 내 피 세포에 새로운 약물 표적을 특성화 하기 위해 관련 시스템을 제안 합니다.

프로토콜

1. 내 피 세포 배양

    1. 코트 100 m m 조직 문화 접시 2.5 mL 젤라틴을 조직 배양 플레이트 취급
    2. 솔루션 (증류수에 압력가 마로 소독, 0.1% 젤라틴) 37 ° C에서 30 분 동안,이 필요한 잘 형식으로 추정 될 수 있습니다. 발음 젤라틴 솔루션 및 조직 문화 후드에 건조를 접시에 두고.
  1. 조직 배양 조건
    1. (37 ° C, 습도 95%, 5% CO 2) 생물 인큐베이터 안에 MLEC 04 세포 배양. Dulbecco의 완전 한 미디어에 셀 성장 ' s 수정이 글 매체: 영양소 혼합 F-12 (DMEM/F-12) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 및 100 단위/mL 페니실린과 100 µ g/mL 스 (P/S)와 보충.
    2. 표준 Neubauer 챔버 메서드에서 셀의 개수 고 2-11 x 10 4 셀/c m 2의 낮은 밀도에서 완전 한 미디어 10 mL에서에서 100 m m 젤라틴 처리 번호판 MLEC 04 셀을 추가 합니다. 합류를 도달할 때 셀 1: 3을 분할.
      참고: 일반적으로이 2 ~ 3 일 후에 문화 발생.
    3. Subculture 멸 균 인산 염 버퍼 염 분 (PBS) 2 mL 트립 신-EDTA 솔루션 (0.25 %trypsin, 5 mM EDTA)를 추가 하 여 다음와 37에 3 분 동안 품 어 10 mL와 함께 접시를 세척 하 여 셀 ° c.
    4. 트립 신-EDTA 반응 중지 하 고 10 mL 전체 미디어를 추가 하 여 일시 중단 된 세포를 복구. 스핀 다운 셀 (300 x g, 5 분)는 상쾌한, 적절 하 게 완전 한 미디어와 subculture에 셀룰러 펠 릿 resuspend.

2. LPS 치료 및 중재자

  1. 접시 완전 한 미디어 다음 잘 형식으로 하위 합류 MLEC-04 셀: 셀/잘에 6-잘 접시와 2.5 10 5 셀/96 잘 접시에 잘 x 7 x 10 5.
  2. 셀 인큐베이터 (37 ° C, 습도 95%, 5% CO 2)에서 6 h에 대 한 문화를 품 어. 셀 불완전 한 미디어 (DMEM F12, P/S)에 전환 하 고 동기화 하 고 세포의 활동을 줄일 (에) 하룻밤 두고.
  3. 미디어를 제거 하 고 (또는 없이) 내 피 세포를 배양 하 여 새로운 약물 화합물을 테스트 마약 문제 (예: DT 10) 불완전 한 미디어 (30 분, 37 ° C)에 희석; 추가 1.4 mL/6 잘 플레이트 또는 0.14 잘 mL/잘 96 잘 접시).
  4. 각 분석 결과에 지정 된 시간 동안 LPS 인큐베이션 미디어 (100 ng/mL, 최종 농도)를 추가 하 여 셀을 도전 한다. PBS를 사용 하 여 컨트롤.

3. 실시간 정량 Pcr에 의해 활성화 Endothelium에 Transcriptional 프로필의 평가

  1. 6 잘 문화에서 하위 합류에 시드 MLEC-04 셀 접시 (7 x 10 5 셀/잘). 6 h (37 ° C, 습도 95%, 5% CO 2)에 대 한 품 어 고 이후에 혈 청 기아 (에 품 어).
  2. 미디어를 제거 하 고 치료 (또는) 내 피 세포의 약 문화 (30 분, 37 ° C를 품 어) 불완전 한 미디어에 희석; 1.4 mL을 추가/6 잘 플레이트 (30 분, 37 ° C)에 대 한 잘 취급 하지 않습니다.
  3. (2.3 단계에서 설명) 하는 대로 100 ng/mL LPS incubated 미디어를 추가 하 여 셀을 도전 6 h. 차가운 PBS로 두번 세척 하 여 반응을 중지에 품 어 하 고 샘플 처리까지-80 ° C에서 번호판을 유지.
  4. RNA 추출
    1. 판 해 동 고 1 mL/잘 RNA 추출 버퍼 (38% 페 놀 및 0.8 M guanidinium isothiocyanate; 자료의 표 참조)를 추가 합니다. 1.5 mL 튜브에 동요와 수집 homogenate에서 실 온 (RT)에서 30 분 두고.
    2. 200 µ L 클로 프롬을 추가 하 고 부드럽게 RT 및 분리기 (11,600 g, 15 분, 4 ° C)에서 3 분 15 미 품에 대 한 선동.
    3. 다른 1.5 mL 튜브에 수성 단계를 전송. 500 µ L 소 프로 파 놀 RT 한 다음 원심 분리 (11600 x g, 4 ° C)에서 10 분 부 화 뒤를 추가 하 여 RNA를 침전.
    4. 는 상쾌한 삭제 하 고 소용돌이 동요와 다음 원심 분리 (7500 x g, 4 ° C)에 의해 75% 에탄올과 펠 릿을 세척.
    5. 펠 릿 건조 하 고 25 µ L 순수한 H 2 O 샘플 처리까지-80 ° C에 55 ° C. 유지 RNA에서 10 분 동안 배양 하 여 RNA를 solubilize.
  5. 수량 및 RNA의 순도
    1. 260에서 샘플의 흡 광도 측정 하 여 RNA 농도 계량 한 분 광 광도 계에 nm (재료의 표 참조).
    2. 측정 230 nm 및 280 nm RNA의 순도 확인.
      참고: 260/280에 비율은 단백질 또는 페 놀 오염을 나타냅니다. 2 가까운 비율 허용 됩니다. 260/230에서 비율 EDTA, 탄수화물 또는 페 놀 오염 물질을 나타냅니다. 2.0-2.2 사이의 값을 사용할 수 있습니다.
  6. 검사 RNA 무결성
    1. 총 RNA는 RNA의 실행 2 µ g 1.5 %agarose 젤을 변성 시키기에 사다리, 젤 설명서 시스템에 시각화 (재료의 표 참조).
      참고: 명확 하 고 날카로운 28S와 18S rRNA 밴드의 2:1 비율 그대로 RNA를 나타냅니다. 듯한 모양으로 RNA 해결을 부분적으로 저하.
  7. 실시간 정량
    1. 보완 DNA (cDNA) 표준에 따라 단일 좌초 RNA에서 합성 프로토콜 (참조 테이블의 재료) 11.
  8. 실시간 정량 평가 진 식
    1. 각 샘플에 대 한 반응 혼합물 준비: 믹스 2 µ L cDNA, 7 µ L 형광 화합물, 300 nM 앞으로 뇌관, 및 300 nM 역방향 뇌관 (표 1)는 13 µ L의 최종 볼륨 96-잘 반응 접시에 추가 하 고 (재료의 표 참조).
    2. 광학 접착제 커버, 원심 분리기 (300 x g, 1 분)와 함께 접시를 봉인 하 고 실시간 PCR 시스템에 반응 실행 (뜨거운 시작 20 95 ° C s 40 주기 다음: 95 ° C 3 s와 30에 대 한 60 ° C에 대 한 s) (재료의 표 참조).
    3. 상대적인 정량 비교 방법 2를 사용 하 여 결과 분석 -ΔΔCt 내부 관리 유전자 glyceraldehyde-3-인산 효소 (GAPDH) 또는 산 성 ribosomal phosphoprotein P0 (36B4) 12 .

4. Cytometry 내 피 정품 인증 평가

  1. 2 절에서 설명한 조건에 따라 MLEC 04 셀 고 cytometry에 의해 내 피 표면 단백질의 변화를 평가.
  2. 분리 후 트립 신-EDTA 방법에 설명 된 LPS 자극의 6 h 셀 1.2.3, 단계 그리고 4 불완전 한 미디어와 함께 씻어 ° c.
  3. 는 Neubauer 챔버 메서드를 사용 하 여 셀 고 10 x 10 4의 세포 u-하단 96 잘 접시 합니다. 원래 위치로 빠른 복구에 위에서 손목의 스냅 원심 분리기 (300 x g, 5 분) 및 180 °에 의해 표면에 뜨는 폐기.
  4. 셀에 불완전 한 미디어 (10 µ g/mL, 최종 농도)에 희석 된 항 체의 50 µ L을 추가 하 고 (30 분, 4 ° C)를 품 어.
  5. 씻어 두 번 w 셀ith에 설명 된 절차를 수행 하는 불완전 한 미디어 4.3, 단계 및 해당 이차 항 체의 10 µ g/mL에서 50 µ L로 품 어 결합 FITC 또는 유사한 켤레 (30 분, 어두운 공간에서 4 ° C).
  6. 씻어 셀 한 번 PBS 세척 뒤 불완전 한 미디어. 1 mL 피 펫 팁을 사용 하 여 300 µ L PBS를 가진 세포를 복구 하 고 cytometry 튜브에.
  7. 흐름 cytometry 시스템에 샘플을 평가 (재료의 표 참조). 앞으로 및 측면 산란 매개 변수 셀 인구를 조정 합니다. 게이트의 인구입니다. 게이츠 세포 isotype 컨트롤과 incubated에서 부정적인 컨트롤에 따라 조정 합니다. 분석 결과 긍정적인 세포의 백분율 또는 형광 강도 8 뜻.

5. 서쪽 오 점 내 피 정품 인증 평가

  1. 씨앗 6-잘 배양 배지 (7 x 10 5 셀/잘) 하위 합류에 있는 피 고 2에 설명 된 대로 LPS와 치료. 다음 서쪽 오 점 프로토콜에 의해 염증 성 단백질 표정 분석.
  2. 내 피 응답의 다양 한 측면을 명료 하 게 다른 시간 지점에서 LPS 자극을 중지:
    1. LPS 자극의 6 h 후 염증 성 단백질 프로필 확인.
    2. 60 분 기간을 통해 매 15 분을 신호 하는 셀을 결정.
  3. 두 경우 모두, 차가운 PBS로 두번 세척 하 여 반응을 중지 하 고 샘플 처리까지-80 ° C에서 샘플을 저장할.
  4. Lyse 세포 및 단백질 추출
    1. 추가 200 µ L 세포의 용 해 버퍼 각 잘 (1% 비 이온 계면 활성, 10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, 염화 나트륨 150 m m, 30mm 나트륨 파이 인산, 50mm 나트륨 불 화물에서 2.1 m m 나트륨 orthovanadate를 pH 7.6, 프로 테아 제 억제 물 칵테일 보충) (자료의 표 참조).
    2. 동요에서 4 ° C에서 15 분 웰 스 피 펫 팁을 긁 고 1.5 mL 튜브에 homogenate 수집을 품 어.
    3. 11600 x g에서 튜브 4 원심 ° c.
    4. 처리까지-80 ° C에서 깨끗 한 1.5 mL 튜브에는 상쾌한 저장.
  5. 측정 bicinchoninic 산 분석 결과 표준 다음에 의해 단백질 농도 프로토콜 (재료의 표 참조) 13.
  6. 는 0.1% 나트륨 라우릴 황산 염, 10 %polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS-PAGE) 14의 표준 기술에 의해 총 단백질 각 샘플에 대 한 lysate의 30 µ g을 해결. 샘플 10 m m β-mercaptoethanol (줄이는 조건)와 함께 또는 없이 실행 (조건 비 감소) 관심사의 단백질을 검출 하는 데 사용 하는 항 체에 따라.
  7. 표준 절차를 사용 하 여 0.45 µ m 기 공 크기와 polyvinylidene difluoride (PVDF) 전송 막 polyacrylamide 젤에서 분리 된 단백질 전송.
  8. 전이, 후 막 PBS, 0.1% 폴-20 (PBS-T)로 두 번 세척 하 고 추가 20 mL 2% BSA PBS-T 검색된 phosphoproteins 또는 PBS-T 아래 동요 (90 분, 총 단백질에에서 5% 비 지방 건조 우유에에서 희석 하 여 불특정 바인딩 사이트 차단 RT).
  9. 권장된 농도에서 적절 한 차단 버퍼의 10 mL에 선택 된 항 체를 희석 하 고 동요 (ON, 4 ° C)에서 막 품 어. 또는 막 밀폐 비닐 봉지에 놓고 희석된 항 체의 5 mL을 사용.
  10. 다음 날 씻어 3 막 (초과 PBS-T, 15 분, RT) 번.
  11. 동요 (30 분, RT) 10 mL와 함께 특 파 원 이차 항 체의 아래 막 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)는 적절 한 차단 버퍼에서 1:10,000에 희석에 바인딩된 품.
  12. 동요 (초과 PBS-T, 15 분, RT) 아래 세 번 막 세척.
  13. 과산화 효소 기질 강화 화학 (ECL)의 0.1 mL/c m 2으로 1 분 동안 막 품 어. 두 개의 투명 한 플라스틱 시트, 사이 물기 막 놓고 Charged-Coupled 장치 카메라 (CCD)를 포함 하는 화학 탐지 시스템에 삽입.
    1. CCD 카메라를 사용 하 여 신호 및 누적 프로그램과 이미지를 기록 하는 소프트웨어 검색 (이미지 표시 누적된 신호 마다 30 s 노출에서 총 15 분 동안).
  14. Densitometry 15 사용자 가이드 설명 된 프로토콜을 따르고 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 밴드 강도 계량.
    1. ImageJ 소프트웨어에서 샘플을 열고 사각형 선택 도구와 관심의 밴드를 선택 합니다.
    2. 첫 번째 레인과 언론 플롯 프로필 음모를 차선으로 선택.
    3. 직선 선택과 봉우리의 영역 구분.
    4. 각 피크의 내부를 클릭 하 여 각 밴드의 크기를 측정.
    5. 단백질 제어 (β-말라, tubulin, 등)를 로드 관련 결과 나타냅니다.

6. 내 피 요소 접착 분석 실험에 의해 백혈구 활성화에서 발표 평가

  1. 내 피 조절된 미디어 얻기.
    1. 섹션 2에에서 표시 된 대로 MLEC-04 세포를 치료 하 고 LPS 24 시간 자극 후 표면에 뜨는 문화 수집 (100 ng/mL).
    2. 대우 MLEC-04 세포 분리기 (600 x g)에서 바른된 미디어를 수집합니다. 사용까지-80 ° C에서 0.5 mL aliquots에는 상쾌한 유지.
  2. 백혈구 접착 분석 결과
    1. 50 µ L/잘 선택 된 세포 외 기질 단백질 (콜라겐, 0.1 m M 초 산에 희석)를 제외 하 고 PBS에 희석의 96 잘 접시 코트: fibronectin (1-10 µ g/mL ), laminin (1-10 µ g/mL)와 교원 질 유형 I (10-40 µ g/mL). 4 ° c.에 두고 ON
    2. 코팅된 미디어를 삭제 하 고 150 µ L PBS, 1 %BSA 열 비활성화 (1 분, 100 ° C) 실시간에서 90 분으로 우물에 난다 바인딩 사이트 차단
    3. PBS로 두 번 우물을 세척 하 고 우물에 100 µ L 이전 수집의 내 피 조절 미디어 (6.1 단원)을 추가.
      참고: 판 접착 시험을 수행 하기 위한 준비가.
    4. 문화 (37 ° C, 습도 95%, 5% CO 2) 생물 인큐베이터에서 마우스 monocyte macrophage 셀 라인 J774와 로스웰 파크 기념 연구소 매체 (RPMI), 10 %FBS, 1 %P / s.
      참고: J774 세포 성장 정지에서.
    5. 15 mL 튜브 및 원심 분리기 (300 x g, 5 분)로 J774 셀을 수집합니다. 삭제는 상쾌한 고 10 mL 혈 청 자유로운 미디어와 셀룰러 펠 릿 resuspend. Neubauer 챔버에 세포를 계산 합니다. (300 x g, 5 분) 세포를 원심, 삭제는 상쾌한 고 50 µ L 미디어 당 15 x 10 4 J774 세포에서 혈 청 자유로운 미디어에 셀 resuspend.
    6. 추가 15 x 10 4 J774 셀 각 50 µ L 세럼 무료 미디어에서 잘 하 고 CO 2 셀 인큐베이터에서 37 ° C에서 1 h 뒤에 4 ° C에서 15 분 동안 품 어.
    7. 따뜻한 PBS를 추가 하 여 우물을 두 번, 부드럽게 씻어; 원심 (300 x g, 5 분) 하 고 원래 위치로 빠른 복구에 탑에서 손목의 180 ° 스냅 하 여 상쾌한 삭제. 연결 된 셀을 수정PBS에서 100 µ L/4 %paraformaldehyde (PFA)의 음을 추가 하 여 s (10 분, RT)을 품 어와.
    8. 부드럽게 미디어를 삭제 하 고 부드럽게 실시간 삭제 미디어에서 2 분에 대 한 PBS에 2% 메탄올을 가진 세포를 permeabilize 90에 대 한 20% 메탄올에서 50 µ L / 0.5% 크리스탈 바이올렛의 우물을 추가 하 여 셀을 얼룩 실시간에 s
    9. 풍부한 실행 물과 함께 접시를 세척, 초과 액체를 삭제 하 고 건조를 두고. 디지털 카메라는 가벼운 현미경에 결합에 의해 연결 된 셀을 보고.
    10. 셀 100 µ L/0.1 M 나트륨 구 연산 염, 50% 에탄올의 우물을 추가 하 여 얼룩을 희석. 더 높은 리간드 농도와 코팅 545 nm 및 흡 광도 또는 세포 접착으로 100% 고려 하 여 접착의 비율의 임의의 단위로 결과 도달 우물에서 흡 광도 측정

7. 백혈구 Endothelium 공동 접착 분석 결과 내 피 정품 인증 테스트

  1. 96 잘 접시에 MLEC-04 셀 섹션 2에에서 설명 된 대로 고 LPS (6, 37 ° C)와 품 어.
  2. J774 셀 Carboxyfluorescein Succinimidyl 에스테 르 (CSFE)와 라벨을 붙일. 6.2.5에서 절차를 수행 하는 PBS에
    1. 워시는 J774 셀. 수는 Neubauer에 의해 셀 방법 챔버 1 x 10 6 셀/mL PBS, 0.1 %BSA resuspend.
    2. 37 ° C. 추가 5 mL 불완전 한 미디어에서 20 분 (5 µ M, 최종 농도) CFSE와 셀을 품 어 고 (5 분, 4 ° C)를 품 어.
    3. 6.2.5에 설명 된 대로 불완전 한 미디어로 한 번 씻어. 15 x 10 4 셀/100 µ L에서 resuspend, 공동 접착 시험 진행.
  3. Endothelium 치료 후 씻어 3 배 불완전 한 미디어와 우물. 내 피-코팅 잘 각 CFSE J774 셀 (15 x 10 4 셀/100 µ L)를 추가 합니다. 37에서 60 분 다음 4 ° C에서 10 분 동안 접시를 품 어 ° c.
  4. 우물 6.2.7에 설명 된 대로, 부드럽게 세척., 따뜻하게 PBS를 사용 하 여 및 다음 두 가지 방법으로 내 피 레이어 J774 접착을 보고:
    1. 0.1 M Tris HCl pH 8.8, 1 %SDS에서 세포를 Lyse (100 µ L/잘) 측정 하 고는 CFSE J774 신호 fluorometry (여기/방출 = 492 nm/517 nm). 형광 강렬의 임의 단위 또는 긍정적인 통제에 관하여 접착의 비율 결과 나타냅니다 (추가 총 세포에서 신호에 각 잘).
    2. 형광 현미경 시각화 하 여 4 %PFA 및 보고서에 셀 endothelium CFSE J774 셀의 첨부 파일을 수정 (여기/방출 = 492 nm/517 nm).

결과

실시간 정량 Pcr에 의해 LPS 유발 내 피 세포 활성화의 평가

굶 어 혈 청 MLEC-04 셀 100 ng/mL LPS의 6 h에 의해 자극 되었다 그리고 내 피 유전자 발현 비교 활성화 마커 휴식 상태를 표현 하 여 실시간 정량 Pcr를 사용 하 여 평가 했다. 그림 1A같이 LPS incubated MLEC-04 세포 염증 반응 (전자 selectin VCAM-1, ICAM-1) 동안 백혈?...

토론

이 내 피 프로토콜 탐험 소설 메커니즘 염증 반응의 조절에 관여에 대 한 기초를 설정 하는 단계적 기술을 설명 합니다. 이러한 방식을 내 피 활동 LPS에 의해 자극된의 연구에 기초 하 고 특히 백혈구 신규 모집 선 동적인 응답 동안에 관련 된 중요 한 단계를 평가: cytokines 내 피, 내 피 접착 분자 표정 및 백혈구 접착 혈관 층에. 내 피 매개 변수가 설정 되 면 시스템 내 피 기능의 규정에 관련 된 소?...

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

이 작품은 정부의 드 Economía y Competitividad (MINECO) 및 Instituto de에 의해 지원 되었다 건배 카를로스 3 세 (ISCIII) (보조금 번호 IERPY 1149/16 앨 러 배 마; MPY 1410/09 S. Hortelano에); 의해 Fondo 드 Investigación en 건배 (FIS) (S. Hortelano PI11.0036-PI14.0055 번호 부여)을 통해 MINECO. S. Herranz IERPY 1149/16 ISCIII에서 지원 되었다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
GelatinSigmaG9391
DMEM-F12LonzaBE12-719F
Fetal Bovine SerumSigmaA4503
Penicillin streptomycinLonzaDE17-602E
TrypsineLonzaBE17-160E
EDTASigmaED2SS
LPSSigmaL2880
TrizolSigmaT9424RNA extraction buffer
IsopropanolSigma33539
Ethanol absolutoPanreac1,310,861,612
Pure H2OQiagen1017979RNAse free
AgarosePronadisa8020
Stain for agarose gelsInvitrogens33102
SuperScript III First-Strand SynthInvitrogen18080051Reagents for RT-PCR
Fast SYBR Green Master MixApplied Biosystems4385610Fluorescent stain for qPCR
MicroAmp Fast Optical 96-WellApplied Biosystems4346906Plates for qPCR
U-bottom 96 well platesFalcon353072
Cytometry tubesFalcon352054
TX100Panreac212314Non-ionic surfactant
Tris-HClPanreac1,319,401,211
Sodium chlorideMerck1,064,041,000
Sodium pyrophosphateSigma221368
Sodium fluorideSigmaS7920
Sodium orthovanadatesigma13721-39-6
Protease inhibitor cocktailsigmaP8340
Pierce BCA Protein Assay KitPierce23225Reagents for bicinchoninic acid assay
β-mercaptoethanolmerck805,740
PVDF Transfer Membrane, 0.45 µmThermo Scientific88518
Tween-20Panreac1,623,121,611Polysorbate 20
PBSLonzaBE17-515Q
ECLMilliporeWBKLS0500
FibronectinSigmaF1141
LamininSigmaL2020
Collagen type ISigmac8919
Acetic acidPanreac1,310,081,611
Trypan blueSigmaT8154
ParaformaldehydeSigmaP6148
MethanolPanreac1,310,911,612
Crystal violetSigmaHT90132
Sodium citrateSigmaC7254
Ethanol 96%Panreac1,410,851,212
CFSESigma21888
RPMILonzaBE12-115F
SDSBio-Rad161-0418
Infinite M200TecanM200Multi mode microplate reader
Gel Doc 2000Bio-Rad2000Gel documentation system
StepOnePlusApplied BiosystemsStepOnePlusqPCR system
MACSQuant Analyzer 10Miltenyi BiotecAnalyzer 10Cytometry equipment
ChemiDoc MPBio-RadMPChemiluminescence detection system
NameCompanyCatalog NumberComments
Antibodies
PECAM-1BD Biosciences553370Use at 10 µg/mL
ICAM-2Biolegend1054602Use at 10 µg/mL
E-selectinBD Biosciences553749Use at 10 µg/mL
VCAM-1BD Biosciences553330Use at 10 µg/mL
ICAM-1Becton Dickinson553250Use at 10 µg/mL
anti-rat IgG-FITCJackson Immuno Research112-095-006Use at 10 µg/mL
anti armenian hamster-FITCJackson Immuno Research127-095-160Use at 10 µg/mL
Rat IgG isotyope controlInvitrogen10700Use at 10 µg/mL
Armenian hamster IgG isotype controlInvitrogenPA5-33220Use at 10 µg/mL
P-IκΒ-αCell Signaling2859Use at 10 µg/mL
β-ActinSigmaA5441Use at 10 µg/mL
P-ERKCell Signaling9101Use at 10 µg/mL
anti-mouse HRPGE HealthcareLNXA931/AEUse at 1:10,000
anti-rabbit HRPGE HealthcareLNA934V/AGUse at 1:10,000
anti-rat HRPSanta CruzSc-3823Use at 1:10,000

참고문헌

  1. Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn's disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
  2. Skeoch, S., Bruce, I. N. Atherosclerosis in rheumatoid arthritis: is it all about inflammation?. Nat Rev Rheumatol. 11 (7), 390-400 (2015).
  3. Gerhardt, T., Ley, K. Monocyte trafficking across the vessel wall. Cardiovasc Res. 107 (3), 321-330 (2015).
  4. Andonegui, G., et al. Mice that exclusively express TLR4 on endothelial cells can efficiently clear a lethal systemic Gram-negative bacterial infection. J Clin Invest. 119 (7), 1921-1930 (2009).
  5. McDonald, B., Jenne, C. N., Zhuo, L., Kimata, K., Kubes, P. Kupffer cells and activation of endothelial TLR4 coordinate neutrophil adhesion within liver sinusoids during endotoxemia. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (11), G797-G806 (2013).
  6. Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat Rev Immunol. 7 (10), 803-815 (2007).
  7. Chamorro, &. #. 1. 9. 3. ;., Dirnagl, U., Urra, X., Planas, A. M. Neuroprotection in acute stroke: targeting excitotoxicity, oxidative and nitrosative stress, and inflammation. Lancet Neurol. 15 (8), 869-881 (2016).
  8. Hortelano, S. ILK mediates LPS-induced vascular adhesion receptor expression and subsequent leucocyte trans-endothelial migration. Cardiovasc Res. 86 (2), 283-292 (2010).
  9. Palazón, A. Agonist anti-CD137 mAb act on tumor endothelial cells to enhance recruitment of activated T lymphocytes. Cancer Res. 71 (3), 801-811 (2011).
  10. Jiménez-García, L. 8,9-Dehydrohispanolone-15,16-lactol diterpene prevents LPS-triggered inflammatory responses by inhibiting endothelial activation. Biochem J. 473 (14), 2061-2071 (2016).
  11. . SuperScript® III First-Strand Synthesis System for RT-PCR Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/superscriptIIIfirststrand_pps.pdf (2013)
  12. Livak, K. J., Schmittge, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  13. . Pierce BCA Protein Assay Kit Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf (2017)
  14. He, F. Laemmli-SDS-PAGE. BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).
  15. . ImageJ User Guide Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/user-guide-USbooklet.pdf (2017)
  16. Hohsfield, L. A., Humpel, C. Intravenous infusion of monocytes isolated from 2-week-old mice enhances clearance of Beta-amyloid plaques in an Alzheimer mouse model. PloS One. 10 (4), e0121930 (2015).
  17. Hofland, R. W., Thijsen, S. F. T., Verhagen, M. A. M. T., Schenk, Y., Bossink, A. W. J. Tuberculosis during TNF-α inhibitor therapy, despite screening. Thorax. 68 (11), 1079-1080 (2013).
  18. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
  19. Tedgui, A., Mallat, Z. Anti-inflammatory mechanisms in the vascular wall. Circ Res. 88 (9), 877-887 (2001).
  20. Zheng, Y., Humphry, M., Maguire, J. J., Bennett, M. R., Clarke, M. C. H. Intracellular interleukin-1 receptor 2 binding prevents cleavage and activity of interleukin-1α, controlling necrosis-induced sterile inflammation. Immunity. 38 (2), 285-295 (2013).
  21. Pripp, A. H., Stanišić, M. The correlation between pro- and anti-inflammatory cytokines in chronic subdural hematoma patients assessed with factor analysis. PloS One. 9 (2), e90149 (2014).
  22. Guha, M., Mackman, N. LPS induction of gene expression in human monocytes. Cell Signal. 13 (2), 85-94 (2001).
  23. Tabas, I., Glass, C. K. Anti-inflammatory therapy in chronic disease: challenges and opportunities. Science. 339 (6116), 166-172 (2013).

재인쇄 및 허가

JoVE'article의 텍스트 или 그림을 다시 사용하시려면 허가 살펴보기

허가 살펴보기

더 많은 기사 탐색

127LPS lipopolysaccharidecytokines

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

개인 정보 보호

이용 약관

정책

연락처

사서에게 추천하기

JoVE 뉴스레터

연구

교육

저자

사서

JoVE 소개

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. 판권 소유