Saggi per caratterizzare nuovi endoteliale regolatori coinvolti nella risposta infiammatoria di screening

Riepilogo

Endotelio vascolare controlla strettamente reclutamento leucocitario. Diapedesi inadeguata contribuiscono a malattie infiammatorie umane. Di conseguenza, alla ricerca di nuovi elementi regolatori dell'attivazione endoteliale è necessaria ideare terapie migliori per disordini infiammatori. Qui, descriviamo una metodologia globale per caratterizzare nuovi regolatori endoteliale che possono modificare del leucocita traffico durante l'infiammazione.

Abstract

Lo strato endoteliale è essenziale per il mantenimento dell'omeostasi nel corpo controllando molte funzioni diverse. Regolamento della risposta infiammatoria dallo strato endoteliale è fondamentale per combattere efficientemente ingressi è nocivi e aiuto nel recupero di aree danneggiate. Quando le cellule endoteliali sono esposti a un ambiente infiammatorio, ad esempio il componente esterno della membrana di batteri gram-negativi, lipopolisaccaride (LPS), esprimono solubile citochine pro-infiammatorie, quali Ccl5, Cxcl1 e Cxcl10 e innescare il attivazione dei leucociti circolanti. Inoltre, l'espressione di molecole di adesione sulla superficie endoteliale E-selectina, VCAM-1 e ICAM-1 consente l'interazione e l'adesione dei leucociti attivati per lo strato endoteliale e alla fine lo stravaso verso il tessuto infiammato. In questo scenario, la funzione endoteliale debba essere strettamente regolata perché attivazione eccessiva o difettosa nel reclutamento dei leucociti potrebbe portare a patologie infiammatorie. Poiché molti di questi disordini non hanno un trattamento efficace, è necessario studiare nuove strategie con un focus sullo strato vascolare. Vi proponiamo le analisi complete che sono utili per la ricerca di nuovi regolatori endoteliale che modificano la funzione del leucocita. Analizziamo l'attivazione endoteliale tramite le destinazioni di espressione specifici coinvolti nel reclutamento leucocitario (ad esempio, citochine, chemochine e molecole di adesione) con diverse tecniche, tra cui: (reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale RT-qPCR), western-blot, saggi di adesione e citometria di flusso. Questi approcci determinano la funzione endoteliale in contesto infiammatorio e sono molto utili per eseguire analisi di selezione per caratterizzare nuovi regolatori infiammatori endoteliale che sono potenzialmente utili per la progettazione di nuove strategie terapeutiche.

Introduzione

L'infiammazione è una risposta biologica benefica contro agenti infettivi, con lo scopo principale di eliminare il patogeno e riparare il tessuto danneggiato. In determinate condizioni, come le infezioni croniche o malattie autoimmuni, l'infiammazione non si risolve. Invece, c'è una reazione anomala con continua infiltrazione dei leucociti, conseguente a una risposta immunitaria prolungata che porta al danno tissutale, fibrosi, perdita della funzione e nel complesso, disabilità e in alcuni morte casi del paziente. Questi disordini umani, catalogati come malattie infiammatorie, tutti coinvolgono i vasi sanguigni per il controllo di stravaso del leucocita^1,2.

Le cellule endoteliali gioca un ruolo fondamentale nella regolazione della risposta infiammatoria controllando il traffico del leucocita. Quando lo strato endoteliale è esposto a mediatori infiammatori quali LPS, l'endotelio che riposa attiva ed esprime le citochine pro-infiammatorie (Cxcl10, Cxcl5, Cxcl1, ecc.) e molecole di adesione (E-selectina, VCAM-1 e ICAM-1) quel favore reclutamento dei leucociti nel sito di infezione circolanti. I leucociti innescati dalle citochine rilasciate quindi mediano rotolamento e l'interazione con lo strato endoteliale attraverso le controparti adesive corrispondente: PSGL-1-selectina, integrina α4β1 VCAM-1 e αLβ2 integrina di ICAM-1. Infine, i leucociti migrano attraverso il sistema vascolare verso la messa a fuoco di infiammazione³.

Il ruolo essenziale dell'endotelio nella regolazione della risposta infiammatoria è stato dimostrato sui topi che sono stati geneticamente modificati per esprimere il LPS recettore, il recettore toll-like 4 (TLR4), solo sulle cellule endoteliali. Questi animali endoteliale TLR4 sono stati in grado di rispondere ad un'infiammazione LPS-mediata e per rilevare l'infezione generata dopo l'inoculo di batteri e di conseguenza ottenere un infezione risoluzione e sopravvivenza a livelli simili come i topi wild-type^{4 , 5}.

Per raggiungere la risposta infiammatoria dell'endotelio-regolato, è stato postulato che l'inibizione in alcune fasi dell'interazione leucocita-endotelio comporterebbe la riduzione della migrazione trans-endoteliale e una migliore prognosi per malattie infiammatorie legate. In realtà, diverse strategie di targeting per l'interazione di attivazione e del leucocita-endotelio endoteliale sono state progettate per ostacolare lo stravaso delle cellule immuni come un trattamento per i disordini infiammatori^6,7.

In questo rapporto, descriviamo un gruppo approfondito di tecniche in vitro per caratterizzare l'attività endoteliale in risposta a stimolo infiammatorio LPS e suo ruolo nella attivazione del leucocita e adesione allo strato vascolare. Il modello delle cellule endoteliali utilizzato in questo manoscritto era la linea di mouse del polmone delle cellule endoteliali (MLEC-04), come descritto da Hortelano et al. ⁸. linea cellulare il MLEC-04 è stato convalidato nella letteratura per essere un sistema adeguato per studiare l'attivazione endoteliale^9,10. Basato su interessi di ricerca, questi approcci possono essere facilmente estrapolati per ogni endoteliale o sistemi del leucocita e profilo infiammatorio. Una volta definiti i parametri endoteliali in condizioni selezionate, il sistema può testare nuovi farmaci sulla sperimentazione proposta di valutare l'attivazione vascolare. In questo contesto infiammatorio, le cellule di endotelio testate con il composto di interesse possono essere paragonate per le condizioni di controllo delle cellule, ed eventuali differenze risultanti possono informare il risultato prognostico della droga per lo sviluppo e la progressione dell'infiammazione. Per concludere, vi proponiamo un sistema pertinente per caratterizzare nuovi bersagli farmacologici per le cellule endoteliali, che possono influenzare la progettazione di nuove terapie vascolari specifici contro le malattie infiammatorie legate.

Protocollo

1. coltura di cellule endoteliali

1. di coltura del tessuto trattato piastre
   1. piastre di coltura del tessuto cappotto 100 mm con gelatina di 2,5 mL soluzione (in autoclave, gelatina di 0,1% in acqua distillata) per 30 min a 37 ° C; questo possono essere estrapolati al formato richiesto ben. Aspirare la soluzione di gelatina e lasciare piatti asciugare all'aria nella cappa di coltura del tessuto.
2. Condizioni di coltura del tessuto
   1. coltivare le cellule MLEC-04 all'interno di un incubatore biologico (37 ° C, umidità 95%, 5% CO ₂). Crescere le cellule in multimediale completo di Dulbecco ' s Modified Eagle Medium: miscela nutriente F-12 (DMEM/F-12) completati con 10% siero bovino fetale (FBS) e 100 unità/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina (P/S).
   2. Contare le celle con il metodo standard della camera Neubauer e aggiungere le cellule MLEC-04 le piastre di gelatina-trattati di 100 mm in media completa da 10 mL, a una bassa densità di 2-11 x 10 ⁴ cellule/cm ². Quando raggiungono la confluenza di dividere le celle 1:3.
      Nota: Questo si verifica in genere dopo due o tre giorni nella cultura.
   3. Sottocultura le cellule lavando i piatti con 10 mL sterili Phosphate Buffered Saline (PBS) seguita con l'aggiunta di 2 mL di soluzione di tripsina-EDTA (0,25% tripsina, 5mm EDTA) e incubare per 3 min a 37 ° C.
   4. Fermare la reazione di tripsina-EDTA e recuperare le cellule sospese aggiungendo multimediale completo di 10 mL. Rotazione verso il basso le cellule (300 x g, 5 min), eliminare il supernatante, risospendere il pellet cellulare in media completi e sottocultura opportunamente.

2. Trattamento dei LPS e mediatori

1. le cellule MLEC-04 nel multimediale completo Sub-confluenza nel seguente ben formato del piatto: 7 x 10 ⁵ cellule/pozzetto in piastre da 6 pozzetti e 2.5 x 10 ⁵ cellule/pozzetto in piastre da 96 pozzetti.
2. Incubare la cultura per 6 h in un'incubatrice di cellulare (37 ° C, umidità 95%, 5% CO ₂). Passare le cellule ai media incompleta (DMEM-F12, P/S) e lasciare durante la notte (il) per sincronizzare e per ridurre l'attività delle cellule.
3. Rimuovere i supporti e testare nuovi composti farmacologici incubando le cellule endoteliali con (o senza) il farmaco in questione (ad es. DT ¹⁰) diluito nei mezzi di comunicazione incompleta (30 min, 37 ° C); aggiungere 1,4 mL/bene per piastra a 6 pozzetti o 0,14 mL/pozzetto per piastre da 96 pozzetti).
4. Sfida le cellule aggiungendo LPS ai media incubazione (100 ng/mL, concentrazione finale) per il periodo di tempo specificato in ogni analisi. Utilizzare PBS come controllo.

3. Valutazione del profilo trascrizionale sull'endotelio attivato da RT-qPCR

1. cellule di seme MLEC-04 Sub-confluenza nella cultura 6 pozzetti piastre (7 x 10 ⁵ cellule/pozzetto). Incubare per 6 h (37 ° C, umidità 95%, 5% CO ₂) e successivamente procedere alla deprivazione di siero (Incubare ON).
2. Rimuovere i supporti e trattare (o non trattata) la cellula endoteliale culture con il farmaco di interesse diluito nei media incompleti (Incubare per 30 minuti, 37 ° C); aggiungere 1,4 mL/bene per piastra a 6 pozzetti (30 min, 37 ° C).
3. Sfidare le cellule con l'aggiunta di 100 ng/mL LPS ai media incubati (come descritto al punto 2.3) e incubare per 6 h. fermare la reazione di lavaggio due volte con PBS freddo e mantenere piastre a-80 ° C fino al trattamento del campione.
4. Estrazione di RNA
   1. scongelare le piastre e aggiungere 1 mL/pozzetto RNA tampone di estrazione (38% fenolo e 0,8 M guanidinio isotiocianato; Vedi tabella materiali). Lasciare per 30 min a temperatura ambiente (TA) sotto agitazione e raccogliere omogeneato in provette da 1,5 mL.
   2. Aggiungere cloroformio di 200 µ l e frizionare delicatamente per 15 s. Incubare per 3 min a RT e centrifugare (11.600 x g, 15 min, 4 ° C).
   3. Fase acquosa di trasferimento in un'altra provetta da 1,5 mL. Precipitare il RNA aggiungendo 500 µ l isopropanolo, seguita da un'incubazione di 10 min a RT e quindi centrifugazione (11.600 x g, 4 ° C).
   4. Scartare il surnatante e lavare il precipitato con etanolo al 75% da vortice agitazione e poi centrifugazione (7.500 x g, 4 ° C).
   5. Asciugare il pellet e solubilizzare RNA in 25 µ l puro H ₂ O incubando per 10 minuti a 55 ° C. Keep RNA a-80 ° C fino al trattamento del campione.
5. Quantità e la purezza del RNA
   1. quantificare la concentrazione di RNA misurando l'assorbanza del campione a 260 nm in uno spettrofotometro (Vedi Tabella materiali).
   2. Misura a 230 nm e 280 nm per determinare la purezza RNA.
      Nota: Il rapporto a 260/280 indica contaminazione della proteina o fenolo. Un rapporto vicino 2 è accettabile. Il rapporto di 260/230 indica EDTA, carboidrati o contaminanti di fenolo. Valori tra 2.0-2.2 sono accettabili.
6. RNA controllo integrità
   1. Run 2 µ g di RNA totale e un RNA scaletta su un 1,5% denaturante del gel dell'agarosi; visualizzare su un sistema di documentazione del gel (Vedi Tabella materiali).
      Nota: Un rapporto di 2:1 di chiare e nitide bande di rRNA 28S e 18S indica un RNA intatto. Parzialmente degradata RNA si risolve come un aspetto spalmato.
7. RT-qPCR
   1. sintetizzano il DNA complementare (cDNA) da un singolo RNA incagliato seguendo lo standard protocollo (Vedi Tabella materiali) ¹¹.
8. Valutare l'espressione genica di RT-qPCR
   1. preparare la miscela di reazione per ogni campione: Mix 2 µ l cDNA, composto fluorescente di 7 µ l, 300 nM forward primer e primer reverse 300 nM (tabella 1) in un volume finale di 13 µ l e aggiungere alla piastra 96 pozzetti di reazione (Vedi Tabella materiali).
   2. Sigillare la piastra con un coperchio adesivo ottico, centrifuga (300 x g, 1 min) ed eseguire la reazione su un sistema di PCR in tempo reale (avviamento a caldo 95 ° C per 20 s seguiti da 40 cicli: 95 ° C per 3 s e 60 ° C per 30 s) (Vedi Tabella materiali).
   3. Analizzare i risultati di quantificazione relativa utilizzando il metodo comparativo 2 ^-ΔΔCt con le pulizie geni gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) o acida ribosomal fosfoproteina P0 (36B4) ¹² .

4. Valutare l'attivazione endoteliale tramite flusso Cytometry

1. trattare le cellule MLEC-04 seguendo le condizioni descritte nella sezione 2 e valutare i cambiamenti delle proteine di superficie endoteliale tramite flusso cytometry.
2. Staccare le cellule dopo 6 h di stimolazione dei LPS con il metodo di tripsina-EDTA descritto in passaggio 1.2.3 e lavare con i mezzi di comunicazione incompleta a 4 ° C.
3. Contare le celle utilizzando il metodo della camera Neubauer e inserire 10x10 ⁴ cellule in piastre da 96 pozzetti fondo u. Centrifuga (300 x g, 5 min) e gettare il surnatante di un 180° a scatto del polso dall'alto verso il basso e il recupero rapido alla posizione originale.
4. Aggiungere 50 µ l dell'anticorpo selezionato diluito nei mezzi di comunicazione incompleta (10 µ g/mL, concentrazione finale) per le cellule e incubare (30 min, 4 ° C).
5. Lavare le cellule due volte with media incompleti seguendo la procedura descritta nel passaggio 4.3 e incubare con 50 µ l a 10 µ g/mL di anticorpo secondario corrispondente accoppiato al FITC o un simile coniugato (30 min, 4 ° C in uno spazio buio).
6. Lavare le cellule una volta con i mezzi di comunicazione incompleta seguita da un lavaggio con PBS. Recuperare le cellule con 300 µ l PBS utilizzando puntali per pipette da 1 mL e posto in tubi di citometria.
7. Valutare i campioni nel sistema di citometria a flusso (Vedi Tabella materiali). Regolare la popolazione delle cellule dall'avanti e parametri di scattering di lato. Cancello della popolazione di interesse. Regolare cancelli basate sul controllo negativo da cellule incubate con controllo di isotipo. Analizzare i risultati come la percentuale di cellule positive o dire fluorescenza intensità ⁸.

5. Valutare l'attivazione endoteliale mediante Western Blot

1. seme l'endotelio Sub-confluenza in piastre di coltura 6 pozzetti (7 x 10 ⁵ cellule/pozzetto) e trattare con LPS come descritto nella sezione 2. Analizzare l'espressione di proteina infiammatoria dal seguente protocollo occidentale della macchia.
2. Interrompere la stimolazione dei LPS in diversi momenti per chiarire diversi aspetti della risposta endoteliale:
   1. accertare il profilo di proteine infiammatorie dopo 6 h di stimolazione dei LPS.
   2. Determinare la cella segnalazione ogni 15 minuti attraverso un periodo di 60 min.
3. In entrambi i casi, è necessario arrestare la reazione di lavaggio due volte con PBS freddo e conservare i campioni a-80 ° C fino al trattamento del campione.
Buffer di
4. Lyse le cellule e l'estrazione della proteina
   1. lisi di aggiungere 200 µ l in ogni pozzetto (1% tensioattivi non ionici, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 150 mM di cloruro di sodio, pirofosfato di sodio 30 mM, 50 mM sodio fluoruro, 2,1 mM sodio ortovanadato presso pH 7,6, completati con l'inibitore della proteasi cocktail) (Vedi tabella dei materiali).
   2. Incubare per 15 min a 4 ° C sotto agitazione, raschiare pozzi con una pipetta e raccogliere l'omogenato in provette da 1,5 mL.
   3. Centrifugare le provette a 11.600 x g a 4 ° C.
   4. Conservare il supernatante in provette pulite 1,5 mL a-80 ° C fino a elaborazione.
5. Misura la concentrazione di proteina dall'analisi di acido bicinconinico seguendo lo standard di protocollo (Vedi tabella materiali) ¹³.
6. Risolvere il 30 µ g di proteina totale lysata per ogni campione, la tecnica standard di laurilsolfato di sodio 0,1%, 10% gel di poliacrilammide elettroforesi (SDS-PAGE) ¹⁴. Eseguire i campioni con 10mm β-mercaptoetanolo (condizioni riducenti) o senza (condizioni non riducenti) a seconda dell'anticorpo utilizzato per rilevare la proteina di interesse.
7. Trasferire le proteine separate da gel di poliacrilammide ad una membrana di polivinilidene difluoruro (PVDF) trasferimento con 0,45 µm pori utilizzando la procedura standard.
8. Dopo transfert, lavare la membrana due volte con PBS, 0,1% polisorbato-20 (PBS-T) e bloccare i siti di legame non specifico aggiungendo 20 mL 2% BSA diluito in PBS-T per fosfoproteine rilevati o latte in polvere senza grassi 5% in PBS-T per proteine totali, sotto agitazione (90 min, RT).
9. Diluire l'anticorpo selezionato in 10 mL di buffer blocco appropriato presso la concentrazione consigliata e incubare la membrana sotto agitazione (ON, 4 ° C). In alternativa, posizionare la membrana in sacchetti di plastica sigillati e usato 5 mL di anticorpo diluito.
10. Giorno successivo, lavare la membrana tre volte (in eccesso PBS-T, 15 min, RT).
11. Incubare la membrana sotto agitazione (30 min, RT) con 10 mL di anticorpo secondario corrispondente associata alla perossidasi di rafano (HRP) diluito a 1: 10.000 nell'appropriato tampone bloccante.
12. Lavare la membrana tre volte sotto agitazione (PBS-T in eccesso, 15 min, RT).
13. Incubare la membrana per 1 min con 0,1 mL/cm ² di chemiluminescenza di substrato migliorato la perossidasi (ECL). Posizionare la membrana drenata tra due fogli di plastica trasparente e inserire il sistema di rilevazione di chemiluminescenza che include una fotocamera Charged-Coupled Device (CCD).
    1. Utilizzare la telecamera CCD per rilevare il segnale e il relativo software per registrare le immagini con il programma accumulativo (immagini visualizzare il segnale accumulato presso ogni 30 s esposizione per un periodo di totale 15 min).
14. Quantificare l'intensità di banda da densitometria utilizzando il software ImageJ seguendo il protocollo descritto nella Guida utente ¹⁵.
    1. Aprire l'esempio nel software ImageJ e selezionare la banda di interesse con lo strumento selezione rettangolare.
    2. Selezionare come prima corsia e premere trama corsie per ottenere le trame profilo.
    3. Delimitare l'area dei picchi con la linea retta selezione.
    4. Misurare la dimensione di ciascuna banda facendo clic all'interno di ogni picco.
    5. Rappresentano i risultati rispetto al caricamento di controllo proteine (β-actina, tubulina, ecc.).

6. Valutare endoteliale fattore rilasciato dall'attivazione del leucocita di analisi di adesione

1. ottenere il media condizionati endoteliali.
   1. Trattare le cellule MLEC-04 come indicato nella sezione 2 e raccogliere il surnatante della cultura dopo stimolazione h 24 con LPS (100 ng/mL).
   2. Raccogliere il media condizionati dalle cellule trattate MLEC-04 e centrifugare (600 x g). Mantenere il supernatante in aliquote di 0,5 mL a-80 ° C fino all'utilizzo.
2. Analisi di adesione del leucocita
   1. cappotto le piastre da 96 pozzetti con 50 µ l/pozzetto di proteine della matrice extracellulare selezionato diluito in PBS (ad eccezione di collagene, che è diluito in acido acetico 0,1 M): fibronectina (1-10 µ g/mL ), laminina (1-10 µ g/mL) e collagene di tipo I (10-40 µ g/mL). Lasciare ON a 4 ° C.
   2. Scartare il supporto rivestito e bloccare i siti di legame aspecifici su pozzi con 150 µ l di PBS, BSA 1% inattivati (1 min, 100 ° C) per 90 minuti a TA.
   3. Lavare i pozzetti due volte con PBS e aggiungere 100 µ l di raccolti in precedenza endoteliale condizionata media (sezione 6.1) ai pozzetti.
      Nota: Le piastre sono pronte per eseguire il dosaggio di adesione.
   4. Cultura la linea di cellulare di monociti-macrofagi J774 topo in un incubatore biologico (37 ° C, umidità 95%, 5% CO ₂) con Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI), 10% FBS, 1% P/S.
      Nota: Le cellule J774 crescono in sospensione.
   5. Raccogliere le cellule J774 in una provetta da 15 mL e centrifugare (300 x g, 5 min). Eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare con media privo di siero di 10 mL. Contare le celle in una camera di Neubauer. Centrifugare le cellule (300 x g, 5 min), scartare il surnatante e risospendere le cellule in media senza siero alle cellule di 15 x 10 ⁴ J774 per media di 50 µ l.
   6. Aggiungi 15 x 10 ⁴ J774 cellule a ciascuno in media di siero senza 50 µ l ed incubare per 15 min a 4 ° C, seguita da 1 h a 37 ° C nell'incubatore CO ₂ cell.
   7. Lavare i pozzetti per due volte, delicatamente aggiungendo PBS caldo; centrifugare (5 min a 300 x g) e scartare il surnatante di un attimo di 180° del polso dall'alto verso il basso e il recupero rapido alla posizione originale. Difficoltà la cella collegatas aggiungendo 100 µ l/pozzetto di paraformaldeide al 4% (PFA) in PBS e incubare (10 min, RT).
   8. Scartare i media delicatamente e permeabilize le cellule con metanolo al 2% in PBS per 2 min a RT. scartare i media delicatamente e macchiare le cellule aggiungendo 50 µ l/pozzetto di cristalvioletto di 0,5% a 20% metanolo per 90 s a RT.
   9. Lavare la piastra con abbondante acqua corrente, eliminare il liquido in eccesso e lasciare asciugare all'aria. Segnalazione le cellule allegate da fotocamera digitale accoppiata ad un microscopio chiaro.
   10. Diluire aggiungendo 100 µ l/pozzetto di citrato di sodio 0,1 M, 50% di etanolo di colorazione cellulare. Misura l'assorbanza a 545 nm e rappresentano i risultati come unità arbitrarie di assorbanza o percentuale di adesione considerando 100% come adesione cellulare raggiungono pozzetti rivestito con maggiore concentrazione di ligando

7. Testare l'attivazione endoteliale da analisi di co-adesione del leucocita-endotelio

1. trattare le cellule MLEC-04 su piastre a 96 pozzetti, come descritto nella sezione 2 e incubare con LPS (6 h, 37 ° C).
2. Fluorescente marcare le cellule J774 con Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CSFE).
   1. Lavare il J774 cellule in PBS seguendo la procedura punto 6.2.5. Conteggio celle dalla Neubauer metodo da camera e risospendere a 1 x 10 ⁶ cellule/mL in PBS, 0.1% BSA.
   2. Incubare le cellule con CFSE (5 µM, concentrazione finale) per 20 min a diluitore incompleta di 37 ° C. aggiungere 5 mL e incubare (5 min, 4 ° C).
   3. Lavare una volta con media incompleta, come spiegato nel 6.2.5., risospendere a 15 x 10 ⁴ cellule/100 µ l e procedere con l'analisi di co-adesione.
3. Dopo il trattamento di endotelio, lavare i pozzetti tre volte con media incompleta. Aggiungere le cellule J774 CFSE (15 x 10 ⁴ cellule/100 µ l) a ogni endothelial-rivestite bene. Incubare la piastra per 10 min a 4 ° C, seguita da 60 min a 37 ° C.
4. Lavare i pozzetti con delicatezza, come descritto in 6.2.7., usando riscaldato PBS e riferire l'adesione J774 lo strato endoteliale con i seguenti due metodi:
   1. lisare le cellule in 0.1 M Tris-HCl pH 8,8, 1% SDS (100 µ l/pozzetto) e misurare la Segnale di CFSE-J774 dalla fluorometria (eccitazione/emissione = 492 nm/517 nm). Rappresentare i risultati come unità arbitrarie di intensità di fluorescenza o la percentuale di adesione rispetto al controllo positivo (segnale da cellule totali aggiunta ad ogni pozzetto).
   2. Fissare le cellule nel 4% PFA e report l'allegato delle cellule J774 CFSE all'endotelio visualizzando sotto un microscopio a fluorescenza (eccitazione/emissione = 492 nm nm/517).

Risultati

Valutazione dell'attivazione delle cellule endoteliali indotta da LPS da RT-qPCR

Le cellule di MLEC-04 siero morto di fame sono state stimolate da 100 ng/mL di LPS per 6 h, e l'espressione genica endoteliale è stata valutata mediante RT-qPCR confrontando l'espressione di marcatori di attivazione alla condizione di riposo. Come mostrato in Figura 1A, le cellule incubate LPS MLEC-04 ha indotto l'espress...

Discussione

Questo protocollo endothelial descrive una tecnologia graduale che costituisce le basi per esplorare nuovi meccanismi coinvolti nella regolazione della risposta infiammatoria. Questi approcci sono basati sullo studio dell'attività endoteliale stimolata da LPS e valutare i passaggi critici coinvolti nel reclutamento dei leucociti durante la risposta infiammatoria, in particolare: liberazione di citochine endoteliale, adesione endoteliale adesione di molecole del leucocita e l'espressione a livello vascolare. Una volta st...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gelatin	Sigma	G9391
DMEM-F12	Lonza	BE12-719F
Fetal Bovine Serum	Sigma	A4503
Penicillin streptomycin	Lonza	DE17-602E
Trypsine	Lonza	BE17-160E
EDTA	Sigma	ED2SS
LPS	Sigma	L2880
Trizol	Sigma	T9424	RNA extraction buffer
Isopropanol	Sigma	33539
Ethanol absoluto	Panreac	1,310,861,612
Pure H2O	Qiagen	1017979	RNAse free
Agarose	Pronadisa	8020
Stain for agarose gels	Invitrogen	s33102
SuperScript III First-Strand Synth	Invitrogen	18080051	Reagents for RT-PCR
Fast SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	4385610	Fluorescent stain for qPCR
MicroAmp Fast Optical 96-Well	Applied Biosystems	4346906	Plates for qPCR
U-bottom 96 well plates	Falcon	353072
Cytometry tubes	Falcon	352054
TX100	Panreac	212314	Non-ionic surfactant
Tris-HCl	Panreac	1,319,401,211
Sodium chloride	Merck	1,064,041,000
Sodium pyrophosphate	Sigma	221368
Sodium fluoride	Sigma	S7920
Sodium orthovanadate	sigma	13721-39-6
Protease inhibitor cocktail	sigma	P8340
Pierce BCA Protein Assay Kit	Pierce	23225	Reagents for bicinchoninic acid assay
β-mercaptoethanol	merck	805,740
PVDF Transfer Membrane, 0.45 µm	Thermo Scientific	88518
Tween-20	Panreac	1,623,121,611	Polysorbate 20
PBS	Lonza	BE17-515Q
ECL	Millipore	WBKLS0500
Fibronectin	Sigma	F1141
Laminin	Sigma	L2020
Collagen type I	Sigma	c8919
Acetic acid	Panreac	1,310,081,611
Trypan blue	Sigma	T8154
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Methanol	Panreac	1,310,911,612
Crystal violet	Sigma	HT90132
Sodium citrate	Sigma	C7254
Ethanol 96%	Panreac	1,410,851,212
CFSE	Sigma	21888
RPMI	Lonza	BE12-115F
SDS	Bio-Rad	161-0418
Infinite M200	Tecan	M200	Multi mode microplate reader
Gel Doc 2000	Bio-Rad	2000	Gel documentation system
StepOnePlus	Applied Biosystems	StepOnePlus	qPCR system
MACSQuant Analyzer 10	Miltenyi Biotec	Analyzer 10	Cytometry equipment
ChemiDoc MP	Bio-Rad	MP	Chemiluminescence detection system
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
PECAM-1	BD Biosciences	553370	Use at 10 µg/mL
ICAM-2	Biolegend	1054602	Use at 10 µg/mL
E-selectin	BD Biosciences	553749	Use at 10 µg/mL
VCAM-1	BD Biosciences	553330	Use at 10 µg/mL
ICAM-1	Becton Dickinson	553250	Use at 10 µg/mL
anti-rat IgG-FITC	Jackson Immuno Research	112-095-006	Use at 10 µg/mL
anti armenian hamster-FITC	Jackson Immuno Research	127-095-160	Use at 10 µg/mL
Rat IgG isotyope control	Invitrogen	10700	Use at 10 µg/mL
Armenian hamster IgG isotype control	Invitrogen	PA5-33220	Use at 10 µg/mL
P-IκΒ-α	Cell Signaling	2859	Use at 10 µg/mL
β-Actin	Sigma	A5441	Use at 10 µg/mL
P-ERK	Cell Signaling	9101	Use at 10 µg/mL
anti-mouse HRP	GE Healthcare	LNXA931/AE	Use at 1:10,000
anti-rabbit HRP	GE Healthcare	LNA934V/AG	Use at 1:10,000
anti-rat HRP	Santa Cruz	Sc-3823	Use at 1:10,000