Ensaios de caracterização de romance endoteliais reguladores envolvidos na resposta inflamatória de triagem

Resumo

Endotélio vascular controla firmemente o recrutamento de leucócitos. Extravasamento de leucócitos inadequado contribui para doenças inflamatórias humanas. Portanto, à procura de novos elementos reguladores de ativação endotelial é necessária projetar terapias melhoradas para desordens inflamatórias. Aqui, descrevemos uma metodologia abrangente para caracterizar o romance reguladores endoteliais que podem modificar leucócitos tráfico durante a inflamação.

Resumo

A camada endotelial é essencial para manter a homeostase do corpo, controlando muitas funções diferentes. Regulação da resposta inflamatória pela camada endotelial é crucial para lutar eficientemente contra entradas prejudiciais e ajuda na recuperação de áreas danificadas. Quando as células endoteliais são expostas a um ambiente inflamatório, tais como o componente exterior da membrana de bactérias Gram-negativas, lipopolissacarídeo (LPS), eles expressam solúveis citocinas pró-inflamatórias, como Ccl5, Cxcl1 e Cxcl10 e acionar o ativação de leucócitos em circulação. Além disso, a expressão de moléculas de adesão E-selectina, VCAM-1 e ICAM-1 na superfície endotelial permite a interação e a adesão de leucócitos ativados para a camada endotelial e eventualmente o extravasamento para o tecido inflamado. Nesse cenário, a função endotelial deve ser fortemente regulamentada porque ativação excessiva ou com defeito no recrutamento de leucócitos pode levar a desordens inflamatórias-relacionadas. Desde que muitos destes transtornos não têm um tratamento eficaz, novas estratégias com foco na camada vascular devem ser investigadas. Propomos a ensaios abrangentes que são úteis para a busca de novos reguladores endoteliais que modificar a função dos leucócitos. Analisamos a ativação endotelial usando alvos específicos expressão envolvidos no recrutamento de leucócitos (por exemplo, citocinas, quimiocinas e moléculas de adesão) com várias técnicas, incluindo: (reação em cadeia de polimerase quantitativo em tempo real RT-qPCR), western-blot, ensaios de aderência e citometria de fluxo. Essas abordagens determinar função endotelial no contexto inflamatório e são muito úteis para realizar ensaios de triagem para caracterizar o romance reguladores inflamatórios endoteliais que são potencialmente valiosos para a concepção de novas estratégias terapêuticas.

Introdução

A inflamação é uma resposta biológica benéfica contra agentes infecciosos, com o objectivo principal de eliminar o patógeno e reparar o tecido danificado. Sob certas condições, tais como infecções crônicas ou doenças auto-imunes, inflamação não resolve. Em vez disso, há uma reação anormal com a contínua infiltração de leucócitos, resultando em uma resposta imune prolongada que leva a danos nos tecidos, fibrose, perda de função e em geral, deficiência e em alguma morte de casos do paciente. Estes distúrbios humanos, catalogados como doenças inflamatórias, todos envolvem os vasos sanguíneos para o controle de extravasamento de leucócitos^1,2.

As células endoteliais desempenham um papel fundamental na regulação da resposta inflamatória, controlando o tráfico de leucócitos. Quando a camada endotelial é exposta aos mediadores inflamatórios tais como LPS, o endotélio descanso ativa e expressa as citocinas pró-inflamatórias (Cxcl10 Cxcl5, Cxcl1, etc) e moléculas de adesão (E-selectina, VCAM-1 e ICAM-1) esse favor recrutamento de leucócitos para o local de infecção em circulação. Leucócitos aprontados pelas citocinas lançadas depois mediam rolando e interação com a camada endotelial através as contrapartes adesivas correspondentes: PSGL-1 e selectina α4β1 integrina a VCAM-1 e αLβ2 integrina a ICAM-1. Finalmente, os leucócitos migram da vasculatura para o foco da inflamação³.

O papel essencial do endotélio na regulação da resposta inflamatória tem sido demonstrado em ratos que foram geneticamente modificados para expressar o receptor de LPS, receptores do tipo toll 4 (TLR4), apenas sobre as células endoteliais. Estes animais endotelial-TLR4 foram capazes de responder a uma inflamação mediada por LPS e detectar a infecção gerada após a inoculação de bactérias e, consequentemente, alcançar a resolução de infecção e sobrevivência a níveis semelhantes, como o tipo selvagem ratos^{4 , 5}.

Para o caminho de resposta inflamatória endotélio-regulado, foi postulado que a inibição em algumas fases da interação leucócito-endotélio resultaria na redução da migração trans-endotelial e um prognóstico melhor para doenças inflamatórias-relacionados. Na verdade, várias estratégias visando a interação de ativação e leucócito-endotélio endotelial foram projetadas para impedir o extravasamento de células do sistema imunológico como um tratamento para disorders inflammatory^6,7.

Neste relatório, descrevemos um grupo completo de técnicas em vitro para caracterizar plenamente a atividade endotelial em resposta para os estímulo inflamatório LPS e seu papel na ativação de leucócitos e adesão à camada vascular. O modelo de célula endotelial usado neste manuscrito foi a linha de endothelial da pilha do pulmão de rato (MLEC-04), conforme descrito por Hortelano et al ⁸. o MLEC-04 linha de celular foi validada na literatura para ser um sistema adequado para estudar a ativação endotelial^9,10. Com base em interesses de pesquisa, essas abordagens podem ser facilmente extrapoladas para qualquer endoteliais ou sistemas de leucócitos e perfil inflamatório. Uma vez que são definidos os parâmetros endoteliais nas condições selecionados, o sistema pode testar novos medicamentos sobre a experimentação proposto para avaliar a ativação vascular. Neste contexto inflamatório, as células do endotélio testadas com o composto de interesse podem ser comparadas com as condições de controle das células, e quaisquer diferenças resultantes podem informar resultado de prognóstico da droga no desenvolvimento e progressão da inflamação. Para concluir, propomos um sistema relevante para caracterizar novos alvos de drogas às células endoteliais, que podem influenciar a concepção de romance vasculares específicas terapias contra doenças inflamatórias relacionadas.

Protocolo

1. cultura de células endoteliais

1. cultura de tecido Tratado placas
   1. placas de cultura de tecido casaco 100 mm com gelatina de 2,5 mL de solução (autoclavados, 0,1% de gelatina em água destilada) por 30 min a 37 ° C; esse pode ser extrapolada para o formato exigido bem. Aspirar a solução de gelatina e deixe placas para secar ao ar livre do bairro de cultura de tecidos.
2. As condições de cultura de tecido
   1. cultivar as MLEC-04 células dentro de uma incubadora biológica (37 ° C, umidade de 95%, 5% CO ₂). Crescem as células em mídia completa de Dulbecco ' s Modified Eagle Medium: mistura de nutrientes F-12 (DMEM/F-12) suplementado com 10% de soro Fetal bovino (FBS) e 100 unidades/mL penicilina e estreptomicina 100 µ g/mL (P/S).
   2. Contar as células pelo método padrão para a câmara de Neubauer e adicionar as MLEC-04 células para as placas de gelatina-Tratado de 100mm na mídia completa 10 mL, com uma densidade baixa de 2-11 x 10 ⁴ células/cm ². Dividir as células 1:3 quando eles alcançam a confluência.
      Nota: Normalmente, isso ocorre após dois ou três dias em cultura.
   3. Subcultura das células lavando os pratos com 10 mL de fosfato Buffered Saline (PBS estéril) seguido pela adição de 2 mL de solução de tripsina-EDTA (tripsina 0,25%, 5 mM EDTA) e incube por 3 min a 37 ° C.
   4. Parar a reação do trypsin-EDTA e recuperar as células suspensas adicionando mídia completa 10 mL. Gire para baixo as células (300 x g, 5 min), desprezar o sobrenadante, resuspenda o pellet celular na mídia completa e subcultura adequadamente.

2. Tratamento de LPS e mediadores

1. as MLEC-04 células na mídia completa sub confluência no seguinte formato bem da placa: 7 x 10 ⁵ células/poço em placas 6 boas e 2,5 x 10 ⁵ células/poço em placas de 96 poços.
2. Incubar a cultura para 6 h em uma incubadora de célula (37 ° C, umidade de 95%, 5% CO ₂). Alterne as células para mídia incompleta (DMEM-F12, P/S) e deixar durante a noite (ON) para sincronizar e reduzir a atividade celular.
3. Remover a mídia e testar novos compostos farmacológicos incubando as células endoteliais com (ou sem) a droga em questão (por exemplo, DT ¹⁰) diluído na mídia incompleta (30 min, a 37 ° C); adicionar 1,4 mL/bem para placa de 6 ou 0,14 mL/bem para placas de 96 poços).
4. Desafiar as células adicionando LPS para a mídia de incubação (100 ng/mL, concentração final) para o período de tempo especificado em cada ensaio. Usar o PBS como um controle.

3. Avaliação do perfil transcricional no endotélio ativado por RT-qPCR

1. células de semente o MLEC-04 sub confluência na cultura 6-poços chapas (7 x 10 ⁵ células/poço). Incubar durante 6 h (37 ° C, umidade de 95%, 5% CO ₂) e depois proceder à fome de soro (incubar ON).
2. Remover a mídia e trata (ou não tratar) a célula endotelial culturas com essa droga de interesse diluído na mídia incompleta (Incubar 30 min, a 37 ° C); adicionam 1,4 mL/bem para placa de 6 (30 min, a 37 ° C).
3. Desafiar as células, adicionando 100 ng/mL LPS para a mídia incubada (conforme descrito na etapa 2.3) e incube por 6 h. parar a reacção por lavar duas vezes com PBS frio e manter as placas a-80 ° C até o processamento da amostra.
4. Extração de RNA
   1. descongela as placas e adiciona 1 mL/poço RNA solução tampão (38% de fenol e 0,8 M guanidínio isotiocianato; ver tabela de materiais). Deixe por 30 min à temperatura ambiente (RT) sob agitação e coletar homogeneizado em tubos de 1,5 mL.
   2. Adicionar 200 clorofórmio µ l e agitar suavemente durante 15 s. Incubar por 3 min em RT e centrífuga (11.600 x g, 15 min, 4 ° C).
   3. Transferir a fase aquosa para um outro tubo de 1,5 mL. Precipitar o RNA adicionando 500 µ l isopropanol, seguido de uma incubação de 10 min a RT e, em seguida, centrifugação (11.600 x g, 4 ° C).
   4. Desprezar o sobrenadante e lavar o sedimento com 75% de etanol pelo vórtice agitação e centrifugação em seguida (7.500 x g, 4 ° C).
   5. Secar ao ar livre a pelota e solubilizar RNA em 25 µ l pura H ₂ O, incubando durante 10 minutos a 55 ° C. Mantenha RNA a-80 ° C até o processamento da amostra.
5. Quantidade e pureza do RNA
   1. quantificar a concentração de RNA medindo-se a absorvância da amostra em 260 nm num espectrofotómetro (ver Tabela de materiais).
   2. Medida em 230 nm e 280 nm para determinar a pureza de RNA.
      Nota: A relação no 260/280 indica contaminação de proteína ou fenol. Uma relação de perto 2 é aceitável. A relação no 260/230 indica EDTA, hidratos de carbono ou contaminantes de fenol. Valores entre 2.0-2.2 são aceitáveis.
6. RNA de verificação de integridade
   1. Run 2 µ g de RNA total e RNA um escada em um gel de agarose de desnaturação de 1,5%; Visualizar sobre um sistema de documentação do gel (ver Tabela de materiais).
      Nota: Uma proporção de 2:1 clara e nítida bandas de rRNA 28S e 18S indica um RNA intacto. Parcialmente degradadas RNA resolve como uma aparência borrada.
7. RT-qPCR
   1. sintetizar o DNA complementar (cDNA) a partir de um único RNA encalhado, seguindo o padrão do protocolo (ver Tabela de materiais) ¹¹.
8. Avaliar expressão gênica por RT-qPCR
   1. preparar a mistura de reação para cada amostra: Misture 2 µ l do cDNA, composto fluorescente de 7 µ l, primeira demão para a frente de 300 nM e 300 nM inversa da primeira demão (tabela 1) em um volume final de 13 µ l e adicionar à placa de 96 poços de reação (ver Tabela de materiais).
   2. Selar a placa com uma capa de adesivo óptica, centrífuga (300 x g, 1 min) e executar a reação em um sistema de PCR em tempo real (começo quente 95 ° C por 20 s seguido de 40 ciclos: 95 ° C por 3 s e 60 ° C por 30 s) (ver Tabela de materiais).
   3. Analisar os resultados por quantificação relativa usando o método comparativo 2 ^-ΔΔCt com o housekeeping genes gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) ou ácido phosphoprotein ribosomal P0 (36B4) ¹² .

4. Avaliar a ativação endotelial por citometria de fluxo

1. tratar as células MLEC-04 seguindo as condições descritas na seção 2 e avaliar as alterações das proteínas de superfície endoteliais por citometria de fluxo.
2. Detach as células após 6 h de estimulação de LPS com o método do trypsin-EDTA descrito no passo 1.2.3 e lavagem com os meios de comunicação incompletos em 4 ° C.
3. Contar as células usando o método de câmara de Neubauer e coloque 10 x 10 ⁴ células em placas de 96 poços de fundo-u. Centrífuga (300 x g, 5 min) e descartar o sobrenadante por um 180° snap do pulso de cima para baixo e recuperação rápida para a posição original.
4. Adicionar 50 μl do anticorpo selecionado diluído na mídia incompleta (10 µ g/mL, concentração final) para as células e incubar (30 min, 4 ° C).
5. Lavar as células w duas vezesIth a mídia incompleta, seguindo o procedimento descrito no passo 4.3 e incuba com 50 µ l de 10 µ g/ml de anticorpo secundário correspondente acoplado ao FITC ou um conjugado semelhante (30 min, 4 ° C, em um espaço escuro).
6. Lavar as células de uma vez com a mídia incompleta, seguida por uma lavagem de PBS. Recuperar as células com 300 µ l PBS usando pontas de pipetas de 1 mL e colocar em tubos de citometria.
7. Avaliar as amostras no sistema de citometria de fluxo (ver Tabela de materiais). Ajuste a população celular pela frente e parâmetros de dispersão de lado. Portão da população de interesse. Ajuste o gates baseados no controle negativo de células incubadas do isotipo controle. Analisar os resultados em percentagem de células positivas ou dizer a intensidade de fluorescência ⁸.

5. Avaliar a ativação endotelial por Western Blot

1. semente do endotélio na confluência sub em placas de cultura 6-poços (7 x 10 ⁵ células/poço) e tratar com LPS, conforme descrito na seção 2. Analisar a expressão da proteína inflamatória pelo seguinte protocolo de borrão ocidental.
2. Pare a estimulação de LPS em pontos de tempo diferente para elucidar aspectos diferentes da resposta endotelial:
   1. determinar o perfil de proteínas inflamatórias após 6 h de estimulação de LPS.
   2. Determinar a célula sinalizando a cada 15 min por um período de 60 min.
3. Em ambos os casos, parar a reacção por lavar duas vezes com PBS frio e armazenar as amostras a-80 ° C até o processamento da amostra.
Buffer de
4. Lyse pilhas e extração da proteína
   1. lise de adicionar 200 µ l de cada poço (1% não iónico, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 150 mM de cloreto de sódio, pirofosfato de sódio de 30mm, fluoreto de sódio a 50 milímetros ortovanadato de sódio 2,1 mM no pH 7,6, suplementado com coquetel de inibidor de protease) (ver tabela de materiais).
   2. Incubar por 15 min a 4 ° C, sob agitação, poços com uma ponta de pipeta de raspar e coletar o homogeneizado em tubos de 1,5 mL.
   3. Centrifugar os tubos a 11.600 x g a 4 ° C.
   4. Armazenar o sobrenadante em tubos limpos 1,5 mL a-80 ° C até o processamento.
5. Medida que a concentração de proteína pelo ensaio de ácido bicinchoninic, seguindo o padrão do protocolo (ver tabela de materiais) ¹³.
6. Resolver a 30 µ g de proteína total lisada para cada amostra, a técnica padrão de 0,1% Dodecil sulfato de sódio, 10% gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) de electroforese ¹⁴. Executar amostras com 10 mM de β-mercaptoetanol (condições redutoras) ou sem (condições não-redução) dependendo o anticorpo usado para detectar a proteína de interesse.
7. Transferir as proteínas separadas do polyacrylamide gel para uma membrana de transferência do polyvinylidene difluoreto (PVDF) com 0,45 µm poro tamanho usando o procedimento padrão.
8. Após a transferência, lave a membrana duas vezes com PBS, polisorbato-20 de 0,1% (PBS-T) e bloquear sites de ligação inespecífica, adicionando 20 mL 2% BSA, diluído em PBS-T para fosfoproteínas detectadas ou 5% leite desnatado em PBS-T para proteínas totais, sob agitação (90 min, RT).
9. Diluir o anticorpo selecionado em 10 mL de tampão de bloqueio de apropriado na concentração recomendada e incubar a membrana sob agitação (ON, 4 ° C). Alternativamente, colocar a membrana em sacos plásticos fechados e usado 5 mL de anticorpo diluído.
10. No dia seguinte, lave a membrana três vezes (excesso PBS-T, 15 min, RT).
11. Incubar a membrana sob agitação (30 min, RT) com 10 mL de anticorpo secundário correspondente limite a peroxidase de rábano (HRP) diluído na 1:10,000 no buffer de bloqueio apropriado.
12. Lavar a membrana três vezes sob agitação (excesso PBS-T, 15 min, RT).
13. Incuba a membrana por 1 min com 0,1 mL/cm ² de quimioluminescência de carcaça reforçada a peroxidase (ECL). Coloque a membrana drenada entre duas folhas de plástico transparentes e insira-o sistema de detecção de quimioluminescência que inclui uma câmera de Charged-Coupled dispositivo (CCD).
    1. Usar a câmera do CCD para detectar o sinal e seu software para gravar imagens com o programa acumulativo (imagens exibir sinal acumulada em cada exposição s 30 por um período total de 15 min).
14. Quantificar a intensidade da banda por densitometria usando o software ImageJ seguindo o protocolo descrito na guia usuário ¹⁵.
    1. Aberto a amostra no software ImageJ e selecione a banda de interesse com a ferramenta de seleção retangular.
    2. Selecione a primeira pista e imprensa enredo pistas para obter as perfil parcelas.
    3. Delimitar a área dos picos com a seleção linear.
    4. Medir o tamanho de cada banda clicando-se no interior de cada pico.
    5. Representam os resultados em relação ao carregar o controle de proteínas (β-actina, tubulina, etc.).

6. Avaliar endotelial fator liberado da ativação dos leucócitos pelos ensaios de adesão

1. obter os meios condicionados endoteliais.
   1. Tratar as células MLEC-04, conforme indicado no ponto 2 e recolher a sobrenadante de cultura após estimulação de 24 h com LPS (100 ng/mL).
   2. Coletar os meios condicionados dos células tratadas MLEC-04 e centrífuga (600 x g). Manter o sobrenadante em alíquotas de 0,5 mL a-80 ° C até o uso.
2. Ensaio de adesão de leucócitos
   1. revestir as placas de 96 poços com 50 µ l/poço de proteínas da matriz extracelular selecionado diluído em PBS (exceto para o colágeno, que é diluído em 0,1 M de ácido acético): fibronectina (1-10 µ g/mL ), (1-10 µ g/mL) de laminina e colágeno tipo I (10-40 µ g/mL). Deixe ON a 4 ° C.
   2. Descartar a mídia revestida e bloquear sites de ligação inespecíficas em poços com 150 µ l PBS, 1% BSA inactivados por calor (1 min, 100 ° C) por 90 min no RT.
   3. Lavar os poços duas vezes com PBS e adicionar 100 µ l de previamente coletados endotelial condicionado mídia (seção 6.1) aos poços.
      Nota: As placas estão prontas para realizar o ensaio de adesão.
   4. Cultura do mouse monócito-macrófago linhagem celular J774 numa incubadora biológica (37 ° C, umidade de 95%, 5% CO ₂) com Roswell Park Memorial Institute médio (RPMI), 10% FBS, 1% P/S.
      Nota: As células de J774 crescem em suspensão.
   5. Coletar as células J774 em um tubo de 15 mL e centrífuga (300 x g, 5 min). Desprezar o sobrenadante e ressuspender o celular com media 10 mL de soro-free. Conte as células em uma câmara de Neubauer. Centrifugar as células (300 x g, 5 min), desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em media serum-free em 15 x 10 ⁴ J774 células por meios de comunicação 50 social µ l.
   6. Adicionar 15 x 10 ⁴ J774 células a cada bem em 50 µ l soro livre de meios de comunicação e incube por 15 min a 4 ° C, seguido de 1 h a 37 ° C, a incubadora de célula ₂ CO.
   7. Lavar os poços duas vezes, delicadamente adicionando PBS quente; centrifugar (300 x g, 5 min) e descartar o sobrenadante por uma pressão de 180° do pulso de cima para baixo e recuperação rápida para a posição original. Corrigir a célula anexadas, adicionando-se 100 µ l/poço de paraformaldeído 4% (PFA) em PBS e incubar (10 min, RT).
   8. Descartar a mídia suavemente e permeabilize as células com 2% de metanol em PBS por 2 min em RT. Discard a mídia suavemente e manchar as células pela adição de 50 µ l/poço de violeta de cristal de 0,5% em 20% de metanol para 90 s no RT.
   9. Lavar a placa com água corrente abundante, elimine o excesso de líquido e deixe-o secar ao ar livre. Relatório das células anexadas por câmera digital acoplada a um microscópio de luz.
   10. Diluir a célula coloração adicionando-se 100 µ l/poço de citrato de sódio 0,1 M, 50% de etanol. Medida da absorvância em 545 nm e representam os resultados como unidades arbitrárias de absorvância ou percentagem de adesão considerando 100% como adesão celular chegaram aos poços revestida com maior concentração de ligante

7. Teste de ativação endotelial por ensaio de co de adesão leucócito-endotélio

1. tratar as MLEC-04 células em placas de 96 poços, conforme descrito na seção 2 e incubar com LPS (6h, 37 ° C).
2. Etiqueta fluorescente J774 células com Carboxyfluorescein succinimidil éster (CSFE).
   1. Lavar o J774 células em PBS, seguindo o procedimento em 6.2.5. Contagem de células pelo Neubauer método de câmara e ressuspender a 1 x 10 ⁶ células/mL em PBS, 0,1% BSA.
   2. Incube as celulas com CFSE (5 µM, concentração final) por 20 min a 37 ° C. adicionar 5 mL incompleta meios de comunicação e incubar (5 min, 4 ° C).
   3. Lave uma vez com mídia incompletas, conforme explicado em 6.2.5. Ressuspender em 15 x 10 ⁴ células/100 µ l e prossiga para o ensaio de adesão co.
3. Após o tratamento do endotélio, lavar os poços três vezes com mídia incompleta. Adicione células CFSE-J774 (15 x 10 ⁴ células/100 µ l) a cada endotelial revestido bem. Incubar a placa por 10 min a 4 ° C, seguido por 60 min a 37 ° C.
4. Lavar os poços suavemente, conforme descrito em 6.2.7., usando o PBS aquecido e relatório a adesão de J774 à camada endotelial por dois métodos a seguir:
   1. lisar as células em 0.1 M Tris-HCl pH 8.8, SDS 1% (100 µ l/poço) e medir a CFSE-J774 sinal por fluorometry (excitação/emissão = 492 nm nm/517). Representam os resultados como unidades arbitrárias de intensidade de fluorescência ou percentagem de adesão em relação ao controle positivo (sinal de células totais adicionadas a cada poço).
   2. Consertar as células em 4% PFA e relatório a fixação das células CFSE-J774 para o endotélio através da visualização sob um microscópio de fluorescência (excitação/emissão = 492 nm nm/517).

Resultados

Avaliação da ativação de células endoteliais induzida por LPS por RT-qPCR

As soro fome MLEC-04 células foram estimuladas por 100 ng/mL de LPS para 6h, e a expressão de gene endotelial foi avaliada por meio de RT-qPCR, comparando a expressão de marcadores de ativação para a condição de repouso. Como mostrado na figura 1A, as células de LPS incubados MLEC-04 induziram a expressão de RNAm de...

Discussão

Este protocolo endotelial descreve uma tecnologia gradual que estabelece as bases para explorar novos mecanismos envolvidos na regulação da resposta inflamatória. Essas abordagens baseiam-se no estudo da atividade endotelial estimulado por LPS e avaliar os passos críticos envolvidos no recrutamento de leucócitos durante a resposta inflamatória, especificamente: liberação de citocinas endotelial, adesão endotelial adesão de expressão e leucócitos moléculas para a camada vascular. Uma vez que os parâmetros en...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gelatin	Sigma	G9391
DMEM-F12	Lonza	BE12-719F
Fetal Bovine Serum	Sigma	A4503
Penicillin streptomycin	Lonza	DE17-602E
Trypsine	Lonza	BE17-160E
EDTA	Sigma	ED2SS
LPS	Sigma	L2880
Trizol	Sigma	T9424	RNA extraction buffer
Isopropanol	Sigma	33539
Ethanol absoluto	Panreac	1,310,861,612
Pure H2O	Qiagen	1017979	RNAse free
Agarose	Pronadisa	8020
Stain for agarose gels	Invitrogen	s33102
SuperScript III First-Strand Synth	Invitrogen	18080051	Reagents for RT-PCR
Fast SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	4385610	Fluorescent stain for qPCR
MicroAmp Fast Optical 96-Well	Applied Biosystems	4346906	Plates for qPCR
U-bottom 96 well plates	Falcon	353072
Cytometry tubes	Falcon	352054
TX100	Panreac	212314	Non-ionic surfactant
Tris-HCl	Panreac	1,319,401,211
Sodium chloride	Merck	1,064,041,000
Sodium pyrophosphate	Sigma	221368
Sodium fluoride	Sigma	S7920
Sodium orthovanadate	sigma	13721-39-6
Protease inhibitor cocktail	sigma	P8340
Pierce BCA Protein Assay Kit	Pierce	23225	Reagents for bicinchoninic acid assay
β-mercaptoethanol	merck	805,740
PVDF Transfer Membrane, 0.45 µm	Thermo Scientific	88518
Tween-20	Panreac	1,623,121,611	Polysorbate 20
PBS	Lonza	BE17-515Q
ECL	Millipore	WBKLS0500
Fibronectin	Sigma	F1141
Laminin	Sigma	L2020
Collagen type I	Sigma	c8919
Acetic acid	Panreac	1,310,081,611
Trypan blue	Sigma	T8154
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Methanol	Panreac	1,310,911,612
Crystal violet	Sigma	HT90132
Sodium citrate	Sigma	C7254
Ethanol 96%	Panreac	1,410,851,212
CFSE	Sigma	21888
RPMI	Lonza	BE12-115F
SDS	Bio-Rad	161-0418
Infinite M200	Tecan	M200	Multi mode microplate reader
Gel Doc 2000	Bio-Rad	2000	Gel documentation system
StepOnePlus	Applied Biosystems	StepOnePlus	qPCR system
MACSQuant Analyzer 10	Miltenyi Biotec	Analyzer 10	Cytometry equipment
ChemiDoc MP	Bio-Rad	MP	Chemiluminescence detection system
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
PECAM-1	BD Biosciences	553370	Use at 10 µg/mL
ICAM-2	Biolegend	1054602	Use at 10 µg/mL
E-selectin	BD Biosciences	553749	Use at 10 µg/mL
VCAM-1	BD Biosciences	553330	Use at 10 µg/mL
ICAM-1	Becton Dickinson	553250	Use at 10 µg/mL
anti-rat IgG-FITC	Jackson Immuno Research	112-095-006	Use at 10 µg/mL
anti armenian hamster-FITC	Jackson Immuno Research	127-095-160	Use at 10 µg/mL
Rat IgG isotyope control	Invitrogen	10700	Use at 10 µg/mL
Armenian hamster IgG isotype control	Invitrogen	PA5-33220	Use at 10 µg/mL
P-IκΒ-α	Cell Signaling	2859	Use at 10 µg/mL
β-Actin	Sigma	A5441	Use at 10 µg/mL
P-ERK	Cell Signaling	9101	Use at 10 µg/mL
anti-mouse HRP	GE Healthcare	LNXA931/AE	Use at 1:10,000
anti-rabbit HRP	GE Healthcare	LNA934V/AG	Use at 1:10,000
anti-rat HRP	Santa Cruz	Sc-3823	Use at 1:10,000