Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن عرض تطوير حزم تجميعها ذاتيا، ثلاثية الأبعاد سوماتى أستروسيتيك الانحياز طوليا والعمليات داخل انكاسيمينت مادة بيولوجية رواية. هذه المهندسة "السقالات الحية"، نستعرض ميكرون على نطاق القطر بعد تمديد سنتيمتر في الطول، وتكون بمثابة اختبار-أسرة لدراسة الآليات العصبية النمائية أو تيسير نيوروريجينيريشن بتوجيه الهجرة العصبية و/أو محواري اﻻستطﻻعية.

Abstract

وكثيراً ما تسفر الأمراض نيوروتراوما والأعصاب دائم العجز العصبي بسبب القدرة المحدودة للجهاز العصبي المركزي (CNS) لتحل محل الخلايا العصبية المفقودة وإعادة إنشاء مسارات محواري. ومع ذلك، أثناء تطوير الجهاز العصبي والهجرة العصبية وامتداد محواري غالباً ما تحدث على طول الممرات التي شكلتها الخلايا الأخرى، يشار إليه بوصفه "السقالات المعيشة". تسعى إلى محاكاة هذه الآليات، وتصميم استراتيجية التي تلتف البيئة المثبطة للجهاز العصبي المركزي، ويعرض هذه المخطوطة بروتوكولا لاختلاق الأنسجة المهندسة المستندة إلى أستروسيتي "السقالات المعيشة". لإنشاء هذه الثوابت، استخدمنا مخطط انكاسيمينت مادة بيولوجية جديدة للحث على أستروسيتيس لتجميع ذاتي إلى حزم ثلاثي الأبعاد الكثيفة من القطبين سوماتى الانحياز طوليا والعمليات. المائية أولاً، جوفاء الصغرى-أعمدة تم تجميعها، والتجويف الداخلي كانت مغطاة بطبقة الكولاجين خارج الخلية-مصفوفة. ثم تم تسليم astrocytes القشرية الدماغية منفصلان في التجويف الصغرى-عمود أسطواني، وقطرها داخلي حاسمة < 350 ميكرون، عفوية الانحياز الذاتي وتعاقدت على إنتاج كابلات الألياف مثل فترة طويلة تتكون من حزم كثيفة عمليات astrocyte وييفات الكولاجين قياس < 150 ميكرومتر في القطر بعد توسيع عدة سم في الطول. هذه المهندسة السقالات المعيشة أظهرت > خلية بقاء 97% و بشكل حصري تقريبا تتألف من أستروسيتيس التعبير عن مزيج من خيوط متوسطة البروتينات الدبقية فيبريلاري الحمضية البروتين (توصيني)، فيمنتين، ونيستين. وهذه محاذاة astrocyte شبكات وجد أن توفر الركازة متساهلة لمرفق الخلايا العصبية والانحياز التمديد نورت. وعلاوة على ذلك، هذه الثوابت الحفاظ على سلامتها والمحاذاة عند استخراج من انكاسيمينت المائية، يجعلها مناسبة لزرع الجهاز العصبي المركزي. تحاكي هذه الثوابت بريفورميد هيكلياً العناصر الرئيسية سيتوارتشيتيكتورال التي تقع بشكل طبيعي فيفو في"العيش السقالات" المستندة إلى الدبقية. على هذا النحو، قد هذه السقالات الحية المحورة بمثابة اختبار-أسرة للدراسة النمائية الآليات في المختبر أو تيسير نيوروريجينيريشن بتوجيه الهجرة العصبية و/أو اﻻستطﻻعية محواري عقب تدهور الجهاز العصبي المركزي الحية .

Introduction

الجهاز العصبي المركزي (CNS) لديها قدرة محدودة لمواجهة الخسائر و/أو خلل وظيفي للخلايا العصبية ومسالك محواري التي تصاحب ظروف مثل إصابات الدماغ الرضية (تبي)، السكتة الدماغية، مرض إصابة (العلوم)، والأعصاب النخاع الشوكي1 ،،من23،،من45. الخلايا في الجهاز العصبي المركزي يقتصر على عدد محدود من المناطق في الدماغ، وتعوق استعادة الخلايا العصبية المفقودة6،7. بالإضافة إلى ذلك، يتم التجديد لمسارات محواري المفقودة في الجهاز العصبي المركزي غير كافية بسبب الافتقار إلى التوجيه الموجه، ووجود مثبطات ثمرة، ورد الفعل أستروجليوسيس في أعقاب الضرر للأنسجة العصبية2،8، 9،10. عادة ما يكون astrocytes وظائف متنوعة في مساعدة الخلايا العصبية مع أيون التوازن وإزالة العصبي وتشكيل المشبك و neurovascular اقتران11. ومع ذلك، بعد حتى خفيفة الضرر للأنسجة العصبية، astrocytes قد تغيرات الجزيئية والهيكلية والوظيفية كما أنهم الانتقال إلى دولة الضخامي11. ردا على نيوروتروما شديدة، تؤدي هذه التغييرات في تشكيل ندبة مع غبش التي تحتوي على أستروسيتيس رد الفعل ترحيل ونواة آفة يحتوي على الكريات البيضاء التي تسربت من تمزق حاجز الدم في الدماغ (BBB)، ميكروجليا، oligodendrocytes، والخلايا الليفية11،،من1213. هذه أستروسيتيس رد الفعل بلوغ مورفولوجيا العمليات الخيطية، وغير منظم ويحمل التعبير زيادة البروتينات الشعيرة المتوسطة وكبريتات شوندروتن بروتيوجليكانس (كسبجس)، التي تعيق تجديد العصبية12. على الرغم من أن يساعد ندبة الدبقية في البداية استعادة سلامة BBB وتجنب انتقال العدوى الاستجابة الالتهابية للأنسجة السليمة المحيطة، هو بمثابة حاجز الفيزيائية والكيميائية الحيوية ضد إكسون التجديد12،14 ،،من1516. على سبيل المثال، محاور عصبية التي تواجهها ندبة الدبقية عرض النمو تندب منتفخة والأقماع وتوقف نمو12. وعلاوة على ذلك، يعوق الفوضى العمليات أستروسيتيك بعد إصابة تمديد تجديد محاور عصبية17. وتتجلى نتائج هذه الخصائص المثبطة في العاهات الجسدية والعصبية الدائمة غالباً أن المرضى الذين يعانون بعد نيوروتروما شديدة، بما في ذلك تبي وعشر

بغض النظر عن التحديات الخارجية التي تواجه التجدد وظيفية في الجهاز العصبي المركزي، أظهرت محاور عصبية لامتلاك قدرة الذاتية على تجديد. على سبيل المثال، الطابع الدينامي الأقماع النمو تندب على اتصال بندبة الدبقية يوحي بأن هذه النهايات تحتفظ بقدرتها على توسيع12. ونتيجة لذلك، فإنه يعتقد أن عقبة رئيسية أمام محواري إعادة نمو البيئة المثبطة CNS ما بعد الإصابة، وأن توفير بيئة متساهلة أكثر عن طريق تقليل الدبقية تندب و/أو توفير جسور التجدد عبر الندبة ستكون فائدة. وفي الواقع، أظهرت الدراسات السابقة أن الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي كانت قادرة على توسيع محاور عصبية من خلال آفة باستخدام الطعوم الأعصاب الطرفية كالجسور، والتي تشكل بيئة مواتية أكثر لمحور عصبي التجديد12،18، 19. واتبعت عدة استراتيجيات أخرى لاستغلال هذه القدرات التجديدية رمزي. على سبيل المثال، أدى التلاعب بالخلية نمو مسارات الإشارات في نماذج مختلفة من الإصابة محواري التجدد وندبة الدبقية الحد10،،من2021. بالإضافة إلى ذلك، وقد أظهرت الدراسات أن العلاج مع تشوندرويتيناسي أي بي سي، الذي كليافيس معظم سلاسل السكر في كسبجس، يقلل من تأثير المثبطة كسبجس يفرزها astrocytes رد الفعل22. على الرغم من تشجيع النتائج، لا توفر هذه النهج الموجهة توجيها الأقماع النمو، الذي يحتمل أن يؤدي إلى التجديد المنحرف12، وأيضا لا تراعي لفقدان الخلايا العصبية. وقد استخدمت نهج يستند إلى الخلية في محاولات للتغلب على آثار ندبة الدبقية وتجديد الخلايا المفقودة، وخاصة الخلايا العصبية. بعض المجموعات قد ديديفيرينتياتيد أستروسيتيس رد الفعل في الخلايا العصبية، في حين أن البعض الآخر قد زرع الخلايا العصبية السلف إلى آفات الجهاز العصبي المركزي إعادة ملء منطقة الإصابة وتعزيز إكسون التجدد23،24، 25-ومع ذلك، يقتصر زرع الخلايا الجذعية وحدها بمعدلات بقاء منخفضة، وإدماج الفقراء، واستبقاء متواضعة في الأنسجة التالفة5. وعلاوة على ذلك، تفشل هذه الاستراتيجيات المستندة إلى خلية لاستعادة مساحات محواري مسافات طويلة، لا سيما في طريقة يمكن التحكم بها. ولذلك، يجري استكشاف المواد الحيوية في تركيبة مع النهج الأخرى كوسائل إيصال مختلفة العصبية وخلايا السلف ونمو عوامل26. النهج القائم على أساس مادة بيولوجية تتميز بدرجة عالية من التحكم التصميم لإنتاج بنيات التي تحاكي هابتوتاكسيك المادية، محددة، والعظة تشيموتاكسيك الموجودة في المكروية (3D) ثلاثي الأبعاد للهدف المضيف الأنسجة27، ،من 2829،30،31،32،،من3334. استنساخ هذه الإشارات البيئية أمر بالغ الأهمية للخلايا المزروعة مورفولوجيا أصلي مثل وانتشار، والهجرة، ويشير، من بين سائر الخصائص العصبية الحيوية29. وعلى الرغم من هذه الخصائص مفيدة، النهوض خارج الخلية التقليدية المصنف مادة بيولوجية السقالات المطلوبة تعزيز التجديد محواري مسافات طويلة الموجه وتحل محل الخلايا العصبية المفقودة في الوقت نفسه.

واعدة نهج بديل يستند إلى الأنسجة العصبية المهندسة "السقالات الحية"، التي تختلف عن الأخرى النهج المستندة إلى الخلية بسبب وجود الخلايا العصبية الحية مع سيتوارتشيتيكتوري بريفورميد الذي يضاهي التشريح الأصلية و/أو الإنمائية آليات لتسهيل استبدال المستهدفة، والتعمير، وتجديد الدوائر العصبية4،35. اعتبارات تصميم السقالات المعيشة تشمل تعمل ومصادر للخلايا العصبية، فضلا عن الخصائص الميكانيكية/الفيزيائية والإشارات البيوكيميائية التي تمليها تكوين أي الحيوية المصاحبة35. بعد تلفيق في المختبر، يمكن أن تكون هذه السقالات المعيشة مزروع في فيفو إلى جزيئات التصاق الخلية الحالية وتشيموتاكتيك ونيوروتروفيك إشارات لنشاط تنظيم الهجرة الخلية العصبية وثمرة إكسون تبعاً للدولة و تطور عمليات التجدد35. الخلايا الدبقية يمكن اعتبارها أساسا سيتوارتشيتيكتوري هندسيا للسقالات المعيشة منذ هذه الخلايا التوسط الآليات الإنمائية المختلفة في فيفو. خلال نمو الدماغ، والخلايا العصبية الجديدة تعتمد على القاعدية العمليات الموسعة بإطلاق شعاعي من منطقة البطين صوب لوحة القشرية النامية السقالات الحية لتوجيه الهجرة36،37. وعلاوة على ذلك، يقترح توسيع النمو الأقماع تظهر لتوجيه أنفسهم بالاستشعار إشارات جذابة وطارد بالخلايا الدبقية تنطوي، وما يسمى "رائدة" محاور عصبية للوصول إلى الأهداف الصحيحة التي تمتد على طول قبل منقوشة الدبقية السقالات35،،من3839. وهكذا، الخلايا الدبقية ضرورية لتوجيه الرائد محاور عصبية، الذي يخدم في وقت لاحق أساس إكسون "السقالات الحية" لتوجيه التوقعات من "اتباع" محاور عصبية. وعلاوة على ذلك، أظهرت آليات وساطة إطلاق النمو مستمرة وأرزان ارتباط المستقبلات، كما اتبع neuroblasts تيار الهجرة روسترال (RMS) للتنقل من منطقة سوبفينتريكولار (SVZ)، أحد المجالات القليلة المتبقية من الخلايا في الدماغ الكبار، إلى شمي لمبة (OB)40. هذه نيوروبلاستس في جمهورية مالوكو الجنوبية تهاجر داخل الأنبوب الدبقية (الشكل 1A-1)، التي تتألف من العمليات أستروسيتيك الانحياز طوليا، عبر الالتصاقات الخلية الخلية مباشرة ومترجمة العوامل القابلة للذوبان37، 41-أخيرا، بينما تلف الجهاز العصبي المركزي في الثدييات أسباب تعطل ترتيب عملية أستروسيتيك تشكيل ندبة الدبقية فعلياً يحول دون تجديد محواري17، تفتقر العديد من الثدييات غير نظم تشكيل ندبة الدبقية ضارة. بدلاً من ذلك، الحفاظ على الخلايا الدبقية من الأنواع غير الثدييات أكثر نظم، والانحياز الأنماط التي تستخدم كأدلة من خلال42،،من17المنطقة المضرورة43. على سبيل المثال، في نماذج علوم غير الثدييات، تظهر محاور عصبية تنمو في ارتباط وثيق مع الدبقية جسور عبور الآفة، مما يوحي بدور هام للسقالات الدبقية المنظمة كركائز تيسير محواري التجدد والانتعاش وظيفية ( الشكل 1A -2) 42 , 44 , 45-خلاصة من ميزات نيورواناتوميكال والآليات الإنمائية/التجدد الموصوفة أعلاه قد تسفر عن فئة جديدة من السقالات هندسيا المعيشة المستندة إلى الدبقية التي يمكن أن تدفع في الوقت نفسه الهجرة العصبية غير ناضجة ومحواري اﻻستطﻻعية من خلال بيئات غير المتساهلة في خلاف ذلك، وبالتالي يحتمل أن التخفيف من آثار العصبية وانحطاط المسالك إكسون المرتبطة بإصابات الجهاز العصبي المركزي والمرض.

لدينا فريق البحث صمم سابقا أنواع متعددة من السقالات الحية لإعادة إعمار وتجديد محواري مساحات في الجهاز العصبي المركزي والجهاز العصبي المحيطي (السندات الإذنية) عبر الأنسجة الدقيقة هندسة الشبكات العصبية (الصغرى-مزح) والأنسجة إجراء هندسة عكسية ترقيع العصب (تينجس)، على التوالي27،46،،من4748. كلتا الاستراتيجيتين تستند أصلاً إلى بيوميميكري. مزح الصغرى هياكل مستوحاة تشريحيا مصممة هيكلياً ووظيفيا الاستعاضة عن مساحات محواري الاتصال متميزة السكان الخلايا العصبية في الدماغ. تينجس استغلال الآلية التنموية التجدد محواري إكسون-ويسرت، يتجلى في "اتباع" إكسون النمو على طول محاور عصبية "رائدة"، لتحقيق المضيفة المستهدفة التجدد محواري35،،من4648. نحن رسملة مؤخرا على براعة سقالة المعيشة تقنية استخدام نظام انكاسيمينت مماثلة الجزئي-مزح والتماس الإلهام من الآليات المستندة إلى إطلاق الحالية في التنمية. هنا، قمنا بوضع ثوابت تتكون من حزم أستروسيتيك متحاذية تمتد collagenous التجويف العمود الصغير المائية49. وتوضع هذه السقالات المعيشة أستروسيتيك بملء أول تجمع إبرة أنبوبة شعرية-الوخز بالإبر مع سائل [اغروس] لإنشاء أجوف هيدروجيل أسطواني مع القطر الخارجي (OD) والقطر الداخلي (ID) المقابلة للأقطار الأنبوب والإبرة، على التوالي. بعد جيليشن [اغروس] واستخراج المائية الصغيرة-العمود من الأنبوبة الشعرية، الداخلية جوفاء مطلية بنوع الكولاجين لتوفير بيئة متساهلة للالتصاق astrocyte والانحياز تشكيل حزمة (الشكل 1B -1). وبعد ذلك، هو المصنف التجويف مع astrocytes القشرية الدماغية المعزولة من الفئران بعد الولادة الجراء (الشكل 1 باء-2). عكس المحاذاة ثنائي الأبعاد (2D) التقنيات التي تعتمد على تطبيق المجالات الكهربائية والاخاديد ميكروباتيرنيد، والمصفوفة خارج الخلية البروتين (ECM) الزخرفة، astrocyte المحاذاة في سقالة المعيشة تقنية تعتمد على التجميع الذاتي ووفقا للمتغيرات يمكن السيطرة عليها مثل انحناء الركازة (معرف العمود) وكثافة الخلايا والكولاجين تركيز50،،من5152. أستروسيتيس العقد ويعيد الكولاجين، والحصول على مورفولوجيا القطبين، والانحياز طوليا يناظر السقالات الطبيعية التي لوحظت في فيفو (الشكل 1-3). في الواقع، ونحن نواصل بنشاط استخدام هذه الهياكل الشبيهة بالكابل كركائز المادية لتوجيهات تستهدف ترحيل الخلايا العصبية غير ناضجة، فضلا عن تيسير تجديد محواري من خلال البيئة غير المواتية للجهاز العصبي المركزي تلف، لا سيما ندبة الدبقية الثدييات (الشكل 1). هذه المادة سوف يقدم طريقة تصنيع مفصلة أستروسيتيك الصغرى-الأعمدة، والمرحلة الصور الفلورة وعلى النقيض من سيتوارتشيتيكتوري المتوقعة، وإجراء مناقشة شاملة حول القيود الحالية والاتجاهات المستقبلية تقنية.

figure-introduction-12068
رقم 1: الإلهام، وبروتوكول تلفيق، والتطبيقات المقترحة لشبكات أستروسيتيك تمت محاذاته. (أ) الإلهام العصبية الحيوية: نيوروبلاستس (1) التي تنشأ من منطقة سوبفينتريكولار العصبية (SVZ) تستخدم أنبوب الدبقية الانحياز طوليا في تيار الهجرة روسترال (RMS) للهجرة الموجهة نحو لمبة شمي (OB)؛ (2) عدم-الثدييات مثل البرمائيات والأسماك يمكن إدامة التجديد بعد الأنسجة العصبية الضرر جزئيا بسبب تشكيل جسر الدبقية الذي يربط طرفي الآفة (مثلاً بحف الحبل الشوكي) ويعمل سقالة لإرشاد تجديد محاور عصبية. (ب) نظرة عامة على تلفيق: (1) بناء المائية جوفاء، ميكرون الحجم الصغير-عمود مع التجويف المغلفة مع إدارة المحتوى في المؤسسة، (2) البذر من الابتدائي أستروسيتيس القشرية معزولة عن الجراء الفئران بعد الولادة، (3) التجميع الذاتي للتوجه طوليا حزم في الثقافة، واستخراج الحزمة (4) من انكاسيمينت مادة بيولوجية للدراسات غرس المستقبل. (ج) التطبيقات في فيفو : (1) هذه السقالات المعيشة تكون بمثابة أنابيب الدبقية هندسيا للهجرة الموجهة العصبية من المراكز العصبية إعادة ملء المناطق تفتقر إلى الخلايا العصبية؛ (2) خلاصة إليه إنمائية رائدة الإرشاد إكسون وآلية التجدد جسور الدبقية في غير الثدييات قد تضفي هذه السقالات أستروسيتيك مع القدرة على توجيه إكسون التجديد عبر غير المتساهلة بيئة ندبة الدبقية الثدييات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Protocol

جميع الإجراءات المعتمدة برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجان في جامعة بنسلفانيا والمركز الطبي شؤون قدامى المحاربين مايكل ج. كريسسينز والتقيد بالمبادئ التوجيهية المنصوص عليها في "سياسة خدمة الصحة العامة في المعاهد الوطنية للصحة" في إنسانية رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (2015).

1-التنمية المائية الصغيرة [اغروس]-الأعمدة

  1. جعل حلاً حجم/وزن (w/v) 3% [اغروس] بوزن 3 غرام من [اغروس] ونقلها إلى كوب عقيمة التي تحتوي على 100 مل من الفوسفات مخزنة المالحة دولبيكو (دببس). إضافة شريط مغناطيسي عقيمة للكأس، ووضعه على سطح صفيحة/محرض. الاحتفاظ بالكأس تغطية لمنع تبخر محتوياته في الخطوة التالية.
  2. الحرارة [اغروس] ودببس عند درجة حرارة 100 درجة مئوية، ويقلب 60-120 لفة في الدقيقة. ضبط هذه الإعدادات حسب الضرورة، ورصد تطور عملية انحلال باستمرار كما يتغير الحل في البداية من معتم إلى مظهر واضح يدل على أن [اغروس] قد حلت تماما.
    تنبيه: كوب ساخن والحل ساخنة!
  3. كما هو الحل [اغروس] يسخن وحركت، استرداد أربعة أطباق بيتري فارغة 10 سم وإضافة 20 مل دببس إلى اثنين منهم. مكان العلاج بوخز الإبر (القطر: 300 ميكرون، وطول: 40 مم)، زجاج الأنابيب الشعرية ميكروليتير (القطر: 701.04 ميكرومتر، وطول: 65 مم، القدرات: 25.0 ميليلتر)، وموزع لمبة داخل مجلس الوزراء السلامة الأحيائية. عند مسح الحل السائل [اغروس]، الحفاظ على التدفئة في حوالي 50 درجة مئوية ثابتة وآثاره لتجنب جيليشن [اغروس].
  4. إدخال إبرة الوخز بالإبر فتح أسفل موزع لمبة. إدراج أنبوب شعري عبر الإبرة يتعرض إلى الخارج. تأمين الأنبوبة الشعرية بإدخال جزء منه في المقطع المطاط اسطوانة موزع لمبة.
  5. نقل 1 مل من سائل [اغروس] مع ميكروبيبيتي على السطح طبق بيتري فارغة، ومكان واحدة من نهاية الأنبوبة الشعرية رأسياً (مع إبرة تدخل) على اتصال مع [اغروس]، بينما هو يجري مقروص كاب المطاط من موزع لمبة إلى الداخل. ببطء الإفراج عن الضغط على الغطاء موزع لمبة لرسم [اغروس] إلى الأنبوبة الشعرية.
    ملاحظة: يجب إجراء النقل [اغروس] السائل في الأنابيب الشعرية سريعاً. إذا تركت [اغروس] السائل لتبريد على سطح طبق بيتري لوقت كاف (حوالي 60 s)، يبدأ لجل، منع المص ملائمة من [اغروس] على طول الأنبوبة الشعرية.
  6. مكان كل تجميع لمبة-أنبوب-إبرة في طبق بتري مجاناً، واسمحوا [اغروس] هلام داخل الأنابيب الشعرية ترسيخ للحد الأدنى 5 بعناية سحب الأنبوبة الشعرية بيديك من سداده المطاط في الاسطوانة موزع لمبة، ترك الإبرة [اغروس] هلام في مكان داخل الأنبوب.
  7. استخراج إبرة الوخز بالإبر يدوياً بسحب ببطء الأنبوبة الشعرية؛ اسطوانة طدت حديثا [اغروس] أيضا الشرائح خارج الأنبوب في هذا الإجراء، لا تزال تحيط بالإبرة. دفع بلطف العمود الصغير على طول إبرة الوخز بالإبر بطرف الملقط المعقم لنقلها إلى النهاية. ضع الإبرة على صحن بيتري المحتوية على دببس مفتوح، ودفع العمود الصغير إلى دببس مع الملقط.
    ملاحظة: إذا كان لا يزال العمود الصغير [اغروس] داخل زجاج الأنبوبة الشعرية عند إزالة إبرة الوخز بالإبر، ببطء دفع العمود الصغير [اغروس] خارج الأنبوبة الشعرية بإبرة قياس 25 مم، وفي الطبق مع دببس.
  8. تعقيم ميكروسكالبيلس أو الملقط استخدام معقم حار حبة. جعل 4% w/v [اغروس] التي تزن 4 غرام من [اغروس]، ونقل ذلك إلى 100 مل دببس. حرارة وآثاره كما هو موضح في الخطوة 1، 2 للحصول على حل سائل [اغروس] 4% واضحة. الحفاظ على التدفئة وآثاره من الحل في الخطوات التالية.
  9. نقل أطباق بيتري الذي يحتوي على الأعمدة-الجزئي لغطاء تشريح، ونقل الصغير-عمود مع الملقط غرامة طبق بيتري فارغة. استخدام ستيريوسكوبي للإرشادات المرئية ومن ميكروسكالبيل قطع الصغيرة-الأعمدة إلى الطول المطلوب. تقليم كلا طرفي لينتهي شكل مشطوف الزواياس 45 من أفقي لتسهيل المناولة الصغرى-الأعمدة أثناء إضافة خلية وإدارة المحتوى في المؤسسة.
  10. تكرار الخطوة ثلاثة المزيد من الأعمدة الدقيقة في طبق بتري نفس السابقة وحتى بنيات الأربعة بالتوازي مع فصل بين خط < 3 ملم بين كل من الاسطوانات. تحميل 50 ميليلتر من 4% [اغروس] الحل مع ميكروبيبيتي وصب متواصلة/خط السائل على الصفيف العمود الدقيقة للاتصال وحزمة بنيات إلى مجموعات من أربعة (الآخرة تسمى "القوارب الصغيرة-العمود"). تجنب حركة [اغروس] 4% إلى نهايات الأعمدة الدقيقة، التي قد تسد الداخلية، بتقليل المسافة بين بنيات وإضافة [اغروس] بسرعة في خط رفيع.
    ملاحظة: ترتيب المجموعات الأربع الصغيرة-الأعمدة في "مراكب" غير مطلوب لاختلاق السقالات أستروسيتيك. ومع ذلك، خدمة القوارب للتعجيل بعملية التصنيع، وأن توفر طريقة أكثر أمنا للتحرك والتعامل مع الأعمدة الدقيقة في خطوات لاحقة.
  11. السماح لتبرد القارب الصغير-العمود لمدة 1-2 دقيقة للسماح جيلاتيون إضافة 4% [اغروس]. التقاط القارب الصغير-العمود مع الملقط غرامة قبل يربط 4% [اغروس]، ونقل الصغير-الأعمدة إلى الأخرى المحتوية على دببس بيتري الطبق أعد الخطوة 1-1-3. اختﻻق قوارب أكثر مع الأعمدة الصغيرة المتبقية كما هو مطلوب.
  12. نقل أطباق بيتري الذي يحتوي على الأعمدة الصغيرة و/أو قوارب للسلامة الأحيائية مجلس الوزراء وتعقيم مع التعرض للأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) خفيفة لمدة 30 دقيقة.
    تنبيه: ارتداء الحماية المناسبة لمنع التعرض للأشعة فوق البنفسجية.
  13. تخزين الأطباق بالقوارب الصغيرة-العمود في دببس في 4 درجات مئوية، إذا إضافة إدارة المحتوى في المؤسسة، وطلاء الخلية لن يحدث فورا بعد ذلك، حتى 1 الأسبوع. كرر الخطوات تلفيق العمود الصغير إذا لم يتم استخدام بنيات خلال هذا الإطار الزمني.

2-الخلية الابتدائية الثقافة وعزله

  1. أستروسيتي القشرية في معزل عن الجراء الفئران
    1. في إطار التحضير للخطوات التالية، إضافة 20 مل هانك لموازنة الحل الملح (حبس) إلى أربعة أطباق بيتري 10 سم التي ستكون بمثابة خزانات لتشريح الأنسجة. إبقاء جميع الأطباق على الجليد. تعقيم المقصات الجراحية نظيفة والملقط وملعقة صغيرة والمشارط الصغيرة في التعقيم حبة ساخنة.
    2. بريوارم التربسين 0.25% مع حمض الإيثيلين 1 مم (يدتا) و 0.15 مغ/مل ديوكسيريبونوكليسي (الدناز) في حبس عند 37 درجة مئوية. وبالإضافة إلى ذلك، بريوارم المتوسطة الثقافة astrocyte على 37 درجة مئوية، والتي تتألف من تعديل النسر المتوسطة (دميم دولبيكو) مع "خليط المغذيات" F-12 في لحم الخنزير و 10% مصل بقرى الجنين (FBS).
    3. تخدير الولادة اليوم 0 أو الجراء الفئران سبراغ داولي يوم 1 بتعريضها لظروف باردا، و euthanize بقطع الرأس. قياس دبوس الرأس إلى مرحلة استخدام 19 مم إبرة توضع في الآنف عرفت العينين.
    4. جعل شق مع مشرط أسفل الوسط الخلفي إلى الأمامي، من قاعدة العنق حتى مجرد وراء العينين. القيام بشق آخر تسير أفقياً من مباشرة خلف العيون أسفل، تشكيل شكل T. استخدام الملقط غرامة لسحب الجلد/الجمجمة الجمجمة قبالة إلى الجانب.
    5. عقد الرئيس بالأنف (مواجهة) بوضع الشق واحد الملقط في فم الحيوان وأخرى على السطح الخارجي. إزالة الدماغ مع مايكرو-ملعقة معقمة ووضعه في واحدة من أطباق بيتري مليئة بحبس مبردة. مكان هذا طبق بيتري على الجليد بعد ذلك فورا، وفي جميع الأوقات ما عدا عندما تكون قيد الاستخدام.
    6. يوضع كتلة جرانيت مسبقاً بتخزينها في-20 درجة مئوية أدناه ستيريوسكوبي داخل غطاء تشريح. ضع طبق بيتري مع أنسجة المخ على سطح كتلة الجرانيت للحفاظ على درجة الحرارة المنخفضة أثناء إجراء تشريح. استخدام ستيريوسكوبي كالتوجيه البصرية في جميع أنحاء الخطوات التالية.
    7. إذا المصابيح شمي تظل على حالها، استخراجها بالقطع مع الملقط أو ميكروسكالبيلس. وبالإضافة إلى ذلك، استخدم ميكروسكالبيل لإزالة المخيخ وجعل شق خط الوسط الذي يفصل نصفي الدماغي. نقل في نصفي الكرة الأرضية مع الملقط إلى طبق بتري يحتوي على حبس الطازجة والمثلجة.
    8. تشريح هياكل midbrain من الداخل من نصفي الكرة الأرضية مع ميكروسكالبيل للحصول على فقط كورتيسيس المنفصلين عن ذويهم. استخدام الملقط غرامة تقشر السحايا، بنية تشبه ورقة، من الأنسجة القشرية ونقل كورتيسيس معزولة إلى طبق بتري جديد مع حبس الباردة. استخدم في ميكروسكالبيل فرم النسيج من أجل زيادة المساحة السطحية لعمل التربسين في الخطوة التالية.
    9. استخدام ماصة باستور نقل كورتيسيس إلى أنبوب الطرد مركزي 15 مل يحتوي على 4 مل بريوارميد التربسين-يدتا (كورتيسيس 8 في كل أنبوبة). تعرض الأنسجة القشرية إلى التربسين-يدتا لمدة 5-7 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    10. مع ماصة باستور، بعناية إزالة التربسين-يدتا وإضافة 400 ميليلتر من 0.15 مغ/مل الدناز أنا الحل إلى أنبوب الطرد المركزي. تحرض على أنبوب أو دوامة حتى يتم فصل جميع الأنسجة وليست هناك أي قطع الأنسجة المتبقية في السائل. إذا كان من غير الممكن حل تماما في الأنسجة، إزالة الأجزاء المتبقية بطرف ماصة باستور.
    11. إزالة أجهزة الطرد المركزي على أنبوب يحتوي على الحل خلية معزولة في 200 غ س للحد الأدنى 3 المادة طافية مع ماصة باستور دون إزعاج الخلايا. أضف 1 مل من أستروسيتي الثقافة المتوسطة (المحدد في الخطوة 2.1.2) إلى الأنبوب مع ميكروبيبيتي وتحرض على ريسوسبيند وإيجاد حل للمشكلة متجانسة.
    12. نقل 10 مل من أستروسيتي الثقافة المتوسطة مع ماصة مصلية قارورة T-75. إضافة 250 ميليلتر من الحل خلية 1 مل (أعد الخطوة 2.1.11) مع ميكروبيبيتي بقارورة لوحة الدماغ ألجرو واحد يستحق كل الخلايا في قارورة. توزيع حل الخلية خرجوا بالتساوي عبر المتوسط الثقافة وتحرض قارورة لمواصلة تعزيز توزيعاً حتى بلطف.
    13. الثقافة قوارير مطلي في حاضنة هوميديفيد في أول أكسيد الكربون 37 درجة مئوية و 5%2. بعد أن وصلت إلى 24 و 72 ساعة في الثقافة، ميكانيكيا تحرض قارورة لفصل أنواع الخلايا غير ملتصقة، مثل الخلايا العصبية و oligodendrocytes.
    14. بعد ذلك، في كل من هذه تيميبوينتس، إجراء تغيير وسائط. عقد قارورة عمودياً حتى وسائل الإعلام الثقافة يكمن في الجزء السفلي لقارورة، لا تغطي الخلايا التقيد بها. نضح المتوسطة الثقافة مع ماصة باستور، الضغط على طرف الماصة ضد الزاوية السفلي لقارورة لتجنب استخراج الخلايا. وضع في قارورة في الموضع الأفقي الأصلي وإضافة 10 مل متوسطة أستروسيتي بلطف فوق الخلايا مع ماصة مصلية.
    15. العودة قوارير للحاضنة بعد كل تغيير الوسائط. بعد تحقيق 90% كونفلوينسي، ميكانيكيا تحرض قارورة مرة أخرى لإزالة أي الخلايا المتبقية غير المنضمة.
    16. ممر في أستروسيتيس بإخراج المتوسطة الثقافة مع فراغ وماصة باستور. إضافة 5 مل من 0.25% التربسين-يدتا مع ماصة مصلية أكثر من الخلايا التقيد بها. بلطف تحرض قارورة لضمان التربسين يغطي كافة الخلايا، واحتضان قارورة لمدة 5-7 دقائق في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
    17. آرو التربسين بإضافة 1 مل من أستروسيتي المتوسطة للخلايا مع ماصة مصلية. استخراج الحل خلية من قارورة مع ماصة مصلية وتحويلها إلى أنبوب الطرد مركزي 15 مل عقيمة. الطرد المركزي الأنبوب في 200 غ س لمدة 3 دقائق.
    18. إزالة المادة طافية مع ماصة مصلية وريسوسبيند أنه في 1 مل من أستروسيتي الثقافة المتوسطة. تحرض أنبوب لضمان الحل خلية يكون متجانساً. حساب عدد الخلايا في الحل مع هيموسيتوميتير أو عداد تلقائي خلية.
      ملاحظة: غلة قارورة التي روافد 90% عادة ما يقرب من 3 مليون أستروسيتيس.
    19. إضافة 10 مل من أستروسيتي الثقافة المتوسطة إلى قارورة T-75. إجراء تخفيف 1:4 بنقل 250 ميليلتر من الحل خلية (الخطوة 2.1.18) مع ميكروبيبيتي إلى قارورة T-75 الفعل الذي يتضمن الثقافة المتوسطة. تحرض بلطف لضمان توزيع خلية متجانسة في جميع أنحاء السطح قارورة.
    20. كرر الخطوات 2.1.16-2.1.19 في كل مرة يتحقق كونفلوينسي 90% المرور الخلايا.
  2. عزل الخلايا العصبية القشرية من أجنة الفئران
    1. متابعة استعدادات مماثلة كخطوات 2.1.1 و 2.1.2، باستثناء أن بريوارميد وسائل الإعلام هي وسائل الإعلام ثقافة المشارك، تتألف من المتوسطة نيوروباسال + 0.25% 2% B-27 الملحق (للخلايا العصبية) + + 1% G-5 خالية من المصل ملحق (astrocytes) ل الجلوتامين.
    2. Euthanize الفئران سبراغ داولي يوم الجنينية في الوقت المناسب-الحوامل 18 بالخنق بغاز ثاني أكسيد الكربون، وتأكيد الإعدام بقطع الرأس.
    3. استخراج أجنة الجرذان وتشريح كورتيسيس عن باقي الأنسجة الدماغية في أطباق بتري تحتوي على حبس على سطح كتلة الجرانيت المثلجة، استخدام ستيريوسكوبي للتوجيه البصرية ومقص معقم وميكروسكالبيل والملقط53 . بعد تشريح المتعاقبة من رؤساء والعقول ونصفي الكرة الدماغي، وكورتيسيس، نقل كل الأنسجة إلى طبق بتري مملوءة بحبس جديدة.
    4. فرم الأنسجة القشرية إلى أجزاء أصغر لزيادة المساحة السطحية التربسين. نقل كورتيسيس 4-6 مع باستور "الماصة؛" لأنبوب مع 5 مل يدتا التربسين بريوارميد والحفاظ على 37 درجة مئوية ننأى بالانسجة. في 5-7 دقيقة يدوياً تحرض على أنبوب لخلط ومنع التثاقل من الأنسجة.
    5. إزالة الأنبوب من 37 درجة مئوية بعد 10 دقائق. كما هو موضح مسبقاً في الخطوة 2، 1، استخراج التربسين-يدتا واستبدال مع 1.8 مل 0.15 مغ/مل الدناز الحل. وبعد ذلك، دوامة الأنسجة حتى الحل يظهر متجانسة، مع لا أجزاء الأنسجة العائمة في السائل.
    6. الطرد المركزي حل الأنسجة منفصلان في 200 غ س لمدة 3 دقائق. بعد إزالة المادة طافية، ريسوسبيند في 2 مل متوسطة الثقافة المشتركة. حساب عدد الخلايا في هذا الحل مع هيموسيتوميتير أو عداد تلقائي خلية.
      ملاحظة: هو المحصول المعتاد 3.0-5.0 × 106 خلايا/القشرية نصف الكرة الأرضية.
    7. تعد حلاً خلية جديدة بكثافة 2.0-4.0 × 105 خلايا/مل في وسائل الإعلام ثقافة المشاركة المحددة أعلاه.

3-وضع الكابلات أستروسيتيك داخل الجزئي-الأعمدة

  1. إدارة المحتوى في المؤسسة الأساسية تلفيق
    ملاحظة: إدارة المحتوى في المؤسسة قد تضاف إلى الداخلية المائية الصغيرة-الأعمدة في نفس اليوم الذي سيتم تنفيذ البذر الخلية.
    1. داخل مجلس الوزراء السلامة الأحيائية، تعد من 1 ملغ/مل حل ذيل الفئران النوع الأول من الكولاجين في مستنبت المشارك في أنبوب ميكروسينتريفوجي عقيمة. الحفاظ على أنبوب ميكروسينتريفوجي مع حلول إدارة المحتوى في المؤسسة على الجليد في جميع الأوقات ما عدا عند الاستخدام.
    2. 1-2 ميليلتر من حل إدارة المحتوى في المؤسسة مع ميكروبيبيتي على قطاع من ورقة عباد الشمس لتقدير درجة الحموضة في نقل. أضف 1 ميليلتر من 1 هيدروكسيد الصوديوم N (هيدروكسيد الصوديوم) أو حمض الهيدروكلوريك (HCl) مع ميكروبيبيتي لزيادة أو تقليل درجة حموضة حل إدارة المحتوى في المؤسسة، على التوالي، و "الماصة؛" صعودا ونزولاً مجانسة. التحقق من الرقم الهيدروجيني جديدة مع قطاع ورقة عباد الشمس، وإضافة المزيد من حمض أو قاعدة، حسب الحاجة، حتى تصبح مستقرة في حدود 7.2-7.4 درجة الحموضة.
    3. نقل أطباق بيتري من الخطوة 1، 2 إلى غطاء تشريح، ونقل 4-5 مايكرو-أعمدة أو قارب مع الملقط غرامة العقيمة فارغ, عقيمة 35 أو 60 ملم بيتري طبق. استخدام في ستيريوسكوبي للتوجيه، يوضع طرف 10 ميليلتر ميكروبيبيتي في واحدة من نهاية كل العمود الصغير والشفط لإفراغ التجويف فقاعات دببس والهواء. التأكد من عدم وجود فقاعات الهواء مع ستيريوسكوبي لضمان أن المحتوى إضافة في الخطوة التالية يمكن أن تتدفق بحرية عبر التجويف.
    4. رسوم ميكروبيبيتي P10 مع حل إدارة المحتوى في المؤسسة، ومكان ميليلتر 10 تلميح ضد واحدة من نهاية الدقيقة-الأعمدة المائية، وتقديم حل ما يكفي لملء التجويف (حوالي 3-5 ميليلتر)، مراقبة دخول إدارة المحتوى في المؤسسة ستيريوسكوبي. "الماصة؛" خزان صغير (2-4 ميليلتر) لإدارة المحتوى في المؤسسة الحل على حد سواء الصغرى-العمود.
      ملاحظة: دائماً إدارة 4-5 مايكرو-أعمدة أو قارب واحد في وقت واحد لمنع إطالة التجفيف بني، كما قد يؤدي هذا إلى كرومبلينج بنية العمود الصغير. إيمانا راسخا إرفاق الأعمدة الصغيرة المجففة تماما على السطح من أطباق بيتري، مما يحول دون الاستفادة منها لبذر الخلية. لا يمكن إضافة كميات مفرطة من وسائط الثقافة المشتركة (كتدبير الماء) إلى الصغرى-الأعمدة لأن هذا قد يسبب ECM تتدفق خلال فترة الحضانة هو موضح أدناه.
    5. ماصة وسائط ثقافة المشارك في حلقة حول صحن بيتري لتوفير مصدر رطوبة لمنع الأعمدة من الجفاف خلال الاحتضان. احتضان طبق بتري يحتوي على المحتوى التي تحتوي على الأعمدة الصغرى في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لح 1 لتعزيز البلمرة الكولاجين قبل إضافة الخلايا العصبية و/أو أستروسيتيس.
      ملاحظة: إدارة المحتوى في المؤسسة ينبغي أن تشكل طبقة طلاء السطح الداخلي التجويف جوفاء، بدلاً من نواة إدارة المحتوى في المؤسسة صلبة تشمل الداخلية، اللذين يمكن ملاحظتها ستيريوسكوبي باستخدام. إذا ECM تشكل نواة، تستمر فترة الحضانة حتى يتم ترك الطبقة فقط. مع هذه الطبقة التي شكلت، يمكن ملء الحل خلية أستروسيتي الداخلية للعمود الصغير في خطوات الطلاء.
    6. وخلال فترة الحضانة، إعداد الحل خلية أستروسيتي (كما هو موضح أدناه).
  2. Astrocyte والعصبية البذر في الدقيقة-الأعمدة
    1. ممر astrocytes مطلي (بين سن الرابعة والثانية عشرة) كما هو موضح في الخطوات 2.1.16-2.1.19. بعد إحصاء عدد الخلايا في قارورة، إعداد حل الخلية في كثافة 9.0-12.0 x 105 خلايا/مل حل تعليق في خلية ثقافة وسائل الإعلام.
    2. استخدام ستيريوسكوبي، ضع طرف ميكروبيبيتي P10 في واحدة من نهاية الدقيقة-الأعمدة، ونقل حل خلية كاف (~ 5 ميليلتر) في التجويف ملئه تماما. كما فعلت أعلاه مع إدارة المحتوى في المؤسسة، إضافة الخزانات الصغيرة لحل الخلية إلى طرفي كل عمود الصغرى.
    3. احتضان مطلي الصغرى-الأعمدة على أطباق بيتري في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لح 1 تعزيز تمسك أستروسيتيس بإدارة المحتوى في المؤسسة. إذا لن يتم إضافة الخلايا العصبية للأعمدة الدقيقة، تابع إلى الخطوة 3.2.5.
    4. بعد انتهاء فترة الحضانة الأولى، إضافة 1-2 ميليلتر من الحل العصبية القشرية التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.2.7 في كلا طرفي الصغرى-الأعمدة مع ميكروبيبيتي، مع التقيد بإطار ستيريوسكوبي. تأكد من أن وسائل الإعلام كافية موجودة في الأطباق تجنب التجفيف، واحتضان مرة أخرى لمدة 40 دقيقة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 للسماح لالتصاق الخلايا العصبية.
      ملاحظة: حل العصبية القشرية يمكن أيضا إضافة 1-2 أيام بعد تشكيل حزمة، تنفيذ الخطوة 3.2.4 بعد إزالة الوسائط الثقافة بعناية من طبق بيتري مع ميكروبيبيتي.
    5. وبعد التفريخ ملء الفترة، بعناية أطباق بتري يحتوي على مايكرو-الأعمدة مطلي مع 3 أو 6 مل من وسائل الإعلام ثقافة المشارك لاطباق بيتري مم 35 أو 60، على التوالي. المحافظة على الصغير-الأعمدة مطلي في الثقافة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لتعزيز التجميع الذاتي لحزم أستروسيتيك تمت محاذاته، التي ينبغي أن تشكل بنية المجمعة، مثل كبل بعد ح 6-10.
  3. تحقيق الاستقرار في العمارة كبل أستروسيتي
    ملاحظة: بعد تكوين حزم، حوالي 6-12 ح لاستزراع بنيات، نفذ الخطوات التالية لمنع انهيار الهيكل تمت محاذاته للسقالات أستروسيتيك.
    1. في أنبوب ميكروسينتريفوجي عقيمة، تعد الكولاجين ذيل الفئران 3 مغ/مل أنا الحل في وسائل الإعلام ثقافة المشارك. ضبط الأس الهيدروجيني للحل إلى 7.2-7.4 اتباع الإجراء الوارد في الخطوة 3.1.2. الحفاظ على الكولاجين الأسهم وثقافة المشارك وسائط الإعلام على الجليد عندما لا تكون قيد الاستعمال، ووضع الحل الكولاجين مستعدة على الجليد في جميع الأوقات.
    2. قم بإزالة الوسائط من أطباق بتري تحتوي على السقالات أستروسيتيك مع ميكروبيبيتي، تاركة بعض وسائل الإعلام على جانبي الطبق لإنشاء بالوعة رطوبة أن يضمن ترطيب مايكرو-الأعمدة. ضع الطبق تحت ستيريوسكوبي المعونة في التصور.
    3. مع ميكروبيبيتي، تأخذ 2-3 ميليلتر لحل الكولاجين والتفريغ لكل نهاية من الأعمدة-الجزئي، استخدام في ستيريوسكوبي للتوجيه البصرية. تأكد من وجود وسائط كافية حول الجانبين العمل كبالوعة رطوبة حول حواف الطبق في الطبق. احتضان أطباق بيتري مع الدقيقة-الأعمدة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5% CO2 في حاضنة هوميديفيد لتعزيز جيليشن الكولاجين المضافة حديثا.
    4. إضافة 3 أو 6 مل من وسائط الثقافة المشارك ببطء (35 أو 60 ملم بيتري الأطباق، على التوالي) إلى بيتري أطباق مع ماصة، وثقافة الأطباق في حاضنة هوميديفيد في 37 سج و 5% أول أكسيد الكربون2.

4-استخراج حزم أستروسيتيك من المائية الداخلية

  1. تعقيم الزجاج كوفيرسليبس في اﻷوتوكﻻف. تعد حلاً ميكروغرام/مل 20 من بولي-L-يسين (PLL) في الخلية العقيمة ثقافة الصف المياه.
  2. داخل مجلس الوزراء السلامة الأحيائية، يدوياً نقل كوفيرسليبس زجاج معقمة إلى 10 سم معقم طبق بيتري، وإضافة حل PLL كافية لتغطية كوفيرسليبس.
  3. احتضان كوفيرسليبس، مغطاة بالحل PLL، مدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية معطف السطح. إزالة الحل PLL مع ماصة باستير بعد 30 دقيقة يشطف ثلاث مرات بإضافة خلية ثقافة الصف المياه إلى ساترة وإزالتها بواسطة ماصة باستور.
  4. بعد تشكيل حزمة الدبقية تمت محاذاته، نقل العمود الصغير حساسا إلى طبق بتري معقم مع الملقط غرامة العقيمة، وإضافة مجموعة صغيرة من 10 ميليلتر من وسائط الثقافة المشارك مع ميكروبيبيتي منع الجفاف والتأكد من صحة الحزمة. استخراج حزمة أستروسيتيك من العمود الصغير المائية عن طريق سحب بلطف من طرف واحد مع العقيمة الملقط الجراحي، استخدام ستيريوسكوبي للتوجيه البصرية.
  5. عقد حزمة أستروسيتيك مع الملقط، جبل على ساترة المغلفة PLL. فيكس ووصمة عار لبروتوكول أدناه.

5-إيمونوسيتوتشيميستري للدراسات في المختبر

ملاحظة: هذه الدراسة، كانت الأجسام المضادة الأولية أرنب مكافحة الدبقية البروتين فيبريلاري الحمضية (توصيني) (1: 500)، الماوس المضادة-β-tubulin الثالث (1: 500)، أرنب الكولاجين المضادة الأولى (1: 500) والماوس نيستين المضادة (1: 200) وارنب المضادة-فيمنتين (1: 100). وكانت الأجسام المضادة الثانوية حمار 568 الماوس لمكافحة وحمار 568 أرنب المضادة، حمار المضادة أرنب 488 وحمار المضادة الماوس 568 (1: 500 للجميع). وفي جميع الحالات، إضافة إلى حجم ما يكفي كل حل لتغطية الصغرى-الأعمدة تماما.

  1. تعد حلاً 4% فورمالدهايد حجم/حجم (v/v) في x DPBS 1 داخل غطاء الأبخرة كيميائية.
    تنبيه: فورمالدهايد مركب سامة المعروفة لتكون مسببة للسرطان، ويجب التخلص منها في حاوية منفصلة. دائماً التعامل مع هذا المركب داخل غطاء الأبخرة كيميائية واستخدام معدات الوقاية الشخصية (معدات الوقاية الشخصية) مثل معطف المختبر وسلامة النظارات والقفازات.
  2. في حالة الصغير-الأعمدة، تجاهل وسائل الإعلام ثقافة من أطباق بتري تحتوي على بنيات مع ماصة باستور دون قصد المص اسطوانات المائية. إضافة حل فورمالدهايد كاف لتغطية الصغرى-الأعمدة أو كوفيرسليبس المحملة (التي تبقى على أطباق بيتري) واحتضانها لمدة 35 دقيقة في 18-24 درجة مئوية.
  3. استخراج الحل فورمالدهايد 4.0% من مايكرو-الأعمدة الثابتة أو كوفيرسليبس مع ماصة مصلية. شطف الصغرى-الأعمدة الثابتة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني بسرعة إضافة وإزالة برنامج تلفزيوني مرتين وثم السماح لهم نقع للمرة الثالثة 10 دقيقة.
  4. حل مصل الحصان العادي (NHS) في برنامج تلفزيوني لتركيز 4% v/خامسا-تحضير حلاً مع المنظفات غير الأيونية بتركيز 0.3% v/v استخدام الحل الصحي المذيب.
  5. قم بإزالة برنامج تلفزيوني من أطباق بتري تحتوي على الصغير-الأعمدة أو كوفيرسليبس مع ماصة. إضافة حل المنظفات 0.3% كاف لتغطية الصغرى-الأعمدة/كوفيرسليبس لمدة 60 دقيقة في 18-24 درجة مئوية إلى بيرميبيليزي الخلايا.
  6. إخراج الحل المنظفات، وشطف مرتين بسرعة مع برنامج تلفزيوني وثلاث مرات مغطس لأدنى 5 حساب حجم المطلوبة من المستشفيات العامة 4% وكل من الأجسام المضادة الأولية لإعداد حل مع تركيزات جسم المطلوب.
  7. إزالة برنامج تلفزيوني من أطباق بتري وإضافة ما يكفي من جسم الأولية (مخففة في 4% دائرة الصحة الوطنية--دببس) الحل لتغطية الصغرى-الأعمدة أو حزم أستروسيتيك المستخرج. تبني بين عشية وضحاها (12-16 ح) في 4 درجات مئوية.
  8. إخراج الحل جسم الأولية وشطف مرتين بسرعة مع برنامج تلفزيوني وثلاث مرات مغطس لمدة 5 دقائق. إعداد الحل جسم الثانوية، في الظلام، ومع كل الأجسام المضادة موجودة في إضعاف 1: 500 في الحل الصحي 4.0%.
  9. احتضان الخلايا مع الحل جسم الثانوية ح 2 في 18-24 درجة مئوية. في جميع أنحاء طوال الوقت للحضانة، تغطي أطباق بتري يحتوي على مايكرو-الأعمدة مع رقائق الألومنيوم لتجنب التعرض للضوء.
  10. إزالة الحل جسم الثانوي وإضافة حل هويشت (01:10، 000) لمدة 10 دقيقة في 18-24 درجة مئوية إلى وصمة عار الأنوية.
    تنبيه: هو هويشت مطفر معروفة التي ينبغي أن يعامل كمسرطن. ولذلك، فإنه يجب التخلص من حاوية منفصلة وينبغي أن تستخدم معدات الوقاية الشخصية في جميع الأوقات عند التعامل مع هذا الوكيل.
  11. شطف مع برنامج تلفزيوني خمس مرات، في كل مرة للحد الأدنى 5-10 وبعد ذلك، وتخزين الأعمدة الصغير الملون في 4 درجات مئوية في برنامج تلفزيوني، وتغطي برقائق الألومنيوم. في حالة الحزم أستروسيتيك المحملة، إضافة قطره من تصاعد مائي المتوسطة للحزمة، مكان آخر الزجاج ساترة فوق الحزمة الثابتة، وختم كلا كوفيرسليبس بطلاء الأظافر للتخزين على المدى الطويل وتصوير اللاحقة.

6-صلاحية المقايسة مع ميت لايف (كالسين-صباحا/اثيديوم هوموديمير) ستينينج

  1. إعداد الحل كاشف عن طريق إضافة 5 ميكروليتر كالسين صباحا (4 مم في اللامائى ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس])) و 20 ميكروليتر اثيديوم هوموديمير 1 (اتهد-1) (2 مم في [دمس]/ح2س 1:4 v/v) إلى 10 مل 1 x DPBS. تغطية الحل مع رقائق الألومنيوم أو تخزينها في الظلام لحمايتها من الضوء.
  2. نضح وسائل الإعلام من طبق بتري يحتوي على الأعمدة الدقيقة مطلي مع ماصة باستور، وإضافة حل ما يكفي (إعداد أعلاه) لتغطية بنيات. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5% CO2، الحفاظ على طبق بيتري مشمولة بحماية الحل من الضوء.
  3. إزالة الحل مع ميكروبيبيتي أو ماصة باستور. شطف 2-3 مرات مع دببس كما هو موضح في الخطوة 5، 3. الفيضانات أطباق بيتري مع دببس وفقا لحجم الطبق. خلايا الصورة فورا بعد ذلك باستخدام ابيفلوريسسينسي أو تصوير [كنفوكل].
    ملاحظة: التحويل من نفاذية الغشاء كالسين صباحا إلى كالسين من الخلايا النشطة أيضي غلة الفلورية الخضراء من كالسين. وتتميز الخلايا الميتة كاختراق غشاء الخلايا، التي تسمح بدخول اتهد-1 إلى الخلية وملزمة لها للأحماض النووية، مما تسبب في ومضان أحمر.

النتائج

مرحلة التباين في البداية، تم استخدام الفحص المجهري لرصد التقدم لتشكيل الالتصاق وحزمة astrocyte والاستقرار الشامل سيتوارتشيتيكتوري كدالة للزمن. في 1 ح بعد الطلاء، عثر astrocytes طوال التجويف الصغير-الأعمدة مع مورفولوجيا كروية (الشكل 2A). ح 5، بدأت astrocytes توسيع العملي...

Discussion

عند مقارنة إلى بيئة داعمة أكثر من السندات الإذنية، يقتصر الجهاز العصبي المركزي خاصة في التعامل مع العواقب الضارة نيوروتروما ونيوروديجينيريشن. بعد إهانة خطيرة للجهاز العصبي المركزي الثدييات، تتشكل ندبة الدبقية، تتألف من مجموعة أساسية خلايا تليفية والتهابات تحيط به ميشوورك كثيفة من أستر...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

وقدم الدعم المالي من المعاهد الوطنية للصحة [U01-NS094340 (كولين) & F31-NS090746 (كاتييار)]، ومايكل ج. فوكس مؤسسة [العلاجية أنابيب برنامج #9998 (كولين)]، بنسلفانيا طب الأعصاب مركز الطيار جائزة (كولين)، مؤسسة العلوم الوطنية [بحوث الدراسات العليا زمالات تأيين-1321851 (ستروزينا)]، وشؤون إدارة المحاربين القدماء [RR & د الجدارة استعراض #B1097--أنا (كولين)]، والبحوث الطبية في الجيش الأمريكي والعتاد الأمر [#W81XWH-13-207004 (كولين) & W81XWH-15-1-0466 (كولين)].

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Acupuncture needle (300 µm diameter)Lhasa MedicalHS.30x40The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dishFisher08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)Invitrogen14200075
Polystyrene disposable serological pipetFisher13-678-11D
AgaroseSigmaA9539-50G
Microliter glass capillary tube (701 µm)Fisher21-170JThe diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Microcap bulb dispenserFisher21-170JBulb comes with the microcap tubes.
Hot plateFisherSP88857200
Magnetic barFisher1451352
MicropipetteSigmaZ683884-1EA
25 mm gauge needleFisher14-826-49
MicroscalpelRoboz SurgicalRS-6270
ScissorsFine Science Tools14081-09
ForcepsWorld Precision Instruments501985
Hot bead sterilizerSigmaZ378550-1EA
StereoscopeNikonSMZ800N
Micro-spatulaFisherS50821
Rat tail type I collagenCorning354236Maintain at 4 ºC and remove only when needed. Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tubeFisher02-681-256
Sodium hydroxide (NaOH)FisherSS2661
Hydrochloric acid (HCl)FisherSA48-1
Litmus paperFisher09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS)Invitrogen14170112Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTAInvitrogen25200056Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (Dnase) ISigma10104159001Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with Ham's F-12 Nutrient MixtureGibco11330-032Store at 4 ºC.
Fetal bovine serum (FBS)Atlanta BiologicalsS11195Store at -20ºC.
Postnatal day 0 or day 1 Sprague Dawley rat pupsCharles RiverStrain 001
Neurobasal embryonic neuron basal mediumInvitrogen21103049Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 serum free supplementInvitrogen12587010Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamineInvitrogen35050061Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
G5 astrocytic supplementInvitrogen17503012
Sprague Dawley embryonic day 18 ratsCharles RiverStrain 001
Pasteur pipetteFisher22-042816
15 mL centrifuge tubeEMESCO1194-352099
VortexFisher02-215-414
CentrifugeFisher05-413-115
HemocytometerFisher02-671-6
IncubatorFisher13 998 076
Formaldehyde 40%FisherF77P-4Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.
Glass cover slipFisher12-548-5M
Nail polishElectron Microscopy Sciences (EMS)72180
Fluoromont mounting mediumSouthern Biotech0100-01
Poly-L-lysineSigmaP4707
Phosphate buffered salineFisherBP3994
Triton X-100SigmaT8787
Normal horse serumGibco16050-122
Rabbit anti-glial acidic fibrillary protein (GFAP) primary antibodyMilliporeAB5804Store at -20ºC.
Mouse anti-beta-tubulin III primary antibodySigmaT8578Store at -20ºC.
Rabbit anti-collagen I primary antibodyAbcamab34710Store at -20ºC.
Rabbit anti-vimentinMilliporeAB3400Store at -20ºC.
Mouse anti-nestinMilliporeAB5326Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibodyInvitrogenA10037Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 568 secondary antibodyInvitrogenA10042Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibodyInvitrogenA21206Store at 4ºC.
Hoechst 33342, TrihydrochlorideInvitrogenH3570Store at 4ºC. Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen. Therefore, it must be disposed of in a separate container.
Calcein AMSigmaC13594 mM in anhydrous DMSO
Ethidium homodimer-1Life TechnologiesE11692 mM in DMSO/H2O 1:4 (v/v)
Dimethyl sulfoxane (DMSO)Sigma276855
A1RSI Laser Scanning Confocal MicroscopeNikon--------------Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S MicroscopeNikon--------------Used for taking the phase-contrast images. With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).

References

  1. Horner, P. J., Gage, F. H. Regenerating the damaged central nervous system. Nature. 407 (6807), 963-970 (2000).
  2. Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 7 (8), 617-627 (2006).
  3. Montani, L., Petrinovic, M. M. Targeting Axonal Regeneration: The Growth Cone Takes the Lead. J. Neurosci. 34 (13), 4443-4444 (2014).
  4. Struzyna, L. A., Harris, J. P., Katiyar, K. S., Chen, H. I., Cullen, D. K. Restoring nervous system structure and function using tissue engineered living scaffolds. Neural Regen. Res. 10 (5), 679-685 (2015).
  5. Li, X., Katsanevakis, E., Liu, X., Zhang, N., Wen, X. Engineering neural stem cell fates with hydrogel design for central nervous system regeneration. Prog. Polym. Sci. 37 (8), 1105-1129 (2012).
  6. Lie, D. C., Song, H., Colamarino, S. A., Ming, G., Gage, F. H. Neurogenesis in the Adult Brain: New Strategies for Central Nervous System Diseases. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 44, 399-421 (2004).
  7. Gao, Y., Yang, Z., Li, X. Regeneration strategies after the adult mammalian central nervous system injury-biomaterials. Regen. Biomater. 3 (2), 115-122 (2016).
  8. Huebner, E. A., Strittmatter, S. M. Axon Regeneration in the Peripheral and Central Nervous Systems. Results Probl. Cell Differ. 48, 339-351 (2009).
  9. Benowitz, L. I., Yin, Y. Combinatorial Treatments for Promoting Axon Regeneration in the CNS: Strategies for Overcoming Inhibitory Signals and Activating Neurons’ Intrinsic Growth State. Dev. Neurobiol. 67 (9), 1148-1165 (2007).
  10. Kyungsuk, K., Liu, K., et al. Promoting Axon Regeneration in the Adult CNS by Modulation of the PTEN / mTOR Pathway. Science. 322 (5903), 963-966 (2008).
  11. Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits. Nat. Neurosci. 18 (7), 942-952 (2015).
  12. Cregg, J. M., DePaul, M. A., Filous, A. R., Lang, B. T., Tran, A., Silver, J. Functional regeneration beyond the glial scar. Exp. Neurol. 253, 197-207 (2014).
  13. Buffo, A., Rolando, C., Ceruti, S. Astrocytes in the damaged brain: Molecular and cellular insights into their reactive response and healing potential. Biochem. Pharmacol. 79 (2), 77-89 (2010).
  14. Silver, J., Miller, J. H. Regeneration beyond the glial scar. Nat. Rev. Neurosci. 5 (2), 146-156 (2004).
  15. Toy, D., Namgung, U. Role of Glial Cells in Axonal Regeneration. Exp. Neurobiol. 22 (2), 68-76 (2013).
  16. Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).
  17. East, E., de Oliveira, D. B., Golding, J. P., Phillips, J. B. Alignment of astrocytes increases neuronal growth in three-dimensional collagen gels and is maintained following plastic compression to form a spinal cord repair conduit. Tissue Eng. Part A. 16 (10), 3173-3184 (2010).
  18. David, S., Aguayo, A. J. Axonal Elongation into Peripheral Nervous System "Bridges" after Central Nervous System Injury in Adult Rats. Science. 214 (4523), 931-933 (1981).
  19. Benfey, M., Aguayo, A. J. Extensive elongation of axons from rat brain into peripheral nerve grafts. Nature. 296 (11), 150-152 (1982).
  20. Fry, E. J., Chagnon, M. J., López-Vales, R., Tremblay, M. L., David, S. Corticospinal tract regeneration after spinal cord injury in receptor protein tyrosine phosphatase sigma deficient mice. Glia. 58 (4), 423-433 (2010).
  21. Lin, B., Xu, Y., Zhang, B., He, Y., Yan, Y., He, M. -. C. MEK inhibition reduces glial scar formation and promotes the recovery of sensorimotor function in rats following spinal cord injury. Exp. Ther. Med. 7 (1), 66-72 (2014).
  22. Bradbury, E. J., Carter, L. M. Manipulating the glial scar: Chondroitinase ABC as a therapy for spinal cord injury. Brain Res. Bull. 84 (4-5), 306-316 (2011).
  23. Vadivelu, S., Stewart, T. J., et al. NG2+ Progenitors Derived From Embryonic Stem Cells Penetrate Glial Scar and Promote Axonal Outgrowth Into White Matter After Spinal Cord Injury. Stem Cells Transl. Med. 4, 401-411 (2015).
  24. Nishimura, Y., Natsume, A., et al. Interferon-beta delivery via human neural stem cell abates glial scar formation in spinal cord injury. Cell Transplant. 22 (12), 2187-2201 (2013).
  25. Guo, Z., Zhang, L., Wu, Z., Chen, Y., Wang, F., Chen, G. In vivo direct reprogramming of reactive glial cells into functional neurons after brain injury and in an Alzheimer's disease model. Cell Stem Cell. 14 (2), 188-202 (2014).
  26. Tam, R. Y., Fuehrmann, T., Mitrousis, N., Shoichet, M. S. Regenerative therapies for central nervous system diseases: a biomaterials approach. Neuropsychopharmacology. 39 (1), 169-188 (2014).
  27. Cullen, D. K., Tang-Schomer, M. D., et al. Microtissue engineered constructs with living axons for targeted nervous system reconstruction. Tissue Eng. Part A. 18 (21-22), 2280-2289 (2012).
  28. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39 (3), 201-240 (2011).
  29. Irons, H. R., Cullen, D. K., Shapiro, N. P., Lambert, N. A., Lee, R. H., Laplaca, M. C. Three-dimensional neural constructs: a novel platform for neurophysiological investigation. J. Neural Eng. 5 (3), 333-341 (2008).
  30. Morrison, B. I., Cullen, D. K., LaPlaca, M. In Vitro Models for Biomechanical Studies of Neural Tissues. Stud. Mechanobiol. Tissue Eng. Biomater. 3, 247-285 (2011).
  31. Vukasinovic, J., Cullen, D. K., Laplaca, M. C., Glezer, A. A microperfused incubator for tissue mimetic 3D cultures. Biomed. Microdevices. 11 (6), 1155-1165 (2009).
  32. Cullen, D. K., Lessing, M. C., Laplaca, M. C. Collagen-dependent neurite outgrowth and response to dynamic deformation in three-dimensional neuronal cultures. Ann. Biomed. Eng. 35 (5), 835-846 (2007).
  33. LaPlaca, M. C., Vernekar, V. N., Shoemaker, J. T., Cullen, D. K. Three-dimensional neuronal cultures. Methods Bioeng. 3D Tissue Eng. , (2010).
  34. Chwalek, K., Tang-Schomer, M. D., Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. In vitro bioengineered model of cortical brain tissue. Nat. Protoc. 10 (9), 1362-1373 (2015).
  35. Struzyna, L. A., Katiyar, K., Cullen, D. K. Living scaffolds for neuroregeneration. Curr. Opin. Solid State Mater. Sci. 18 (6), 308-318 (2014).
  36. Stiles, J., Jernigan, T. L. The basics of brain development. Neuropsychol. Rev. 20 (4), 327-348 (2010).
  37. Kaneko, N., Marín, O., et al. New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain. Neuron. 67 (2), 213-223 (2010).
  38. Hidalgo, A., Booth, G. E. Glia dictate pioneer axon trajectories in the Drosophila embryonic CNS. Development. 127 (2), 393-402 (2000).
  39. Chotard, C., Salecker, I. Neurons and glia: Team players in axon guidance. Trends Neurosci. 27 (11), 655-661 (2004).
  40. Wang, C., Liu, F., et al. Identification and characterization of neuroblasts in the subventricular zone and rostral migratory stream of the adult human brain. Cell Res. 21 (11), 1534-1550 (2011).
  41. Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain. J. Comp. Neurol. 487 (4), 407-427 (2005).
  42. Zukor, K. A., Kent, D. T., Odelberg, S. J. Meningeal cells and glia establish a permissive environment for axon regeneration after spinal cord injury in newts. Neural Dev. 6, (2011).
  43. Reier, P. J. Penetration of grafted astrocytic scars by regenerating optic nerve axons in xenopus tadpoles. Brain Res. 164 (1-2), 61-68 (1979).
  44. Lee-Liu, D., Edwards-Faret, G., Tapia, V. S., Larraín, J. Spinal cord regeneration: Lessons for mammals from non-mammalian vertebrates. Genesis. 51 (8), 529-544 (2013).
  45. Goldshmit, Y., Sztal, T. E., Jusuf, P. R., Hall, T. E., Nguyen-Chi, M., Currie, P. D. Fgf-Dependent Glial Cell Bridges Facilitate Spinal Cord Regeneration in Zebrafish. J. Neurosci. 32 (22), 7477-7492 (2012).
  46. Struzyna, L. A., Wolf, J. A., et al. Rebuilding Brain Circuitry with Living Micro-Tissue Engineered Neural Networks. Tissue Eng. Part A. 21 (21-22), 2744-2756 (2015).
  47. Harris, J. P., Struzyna, L. A., Murphy, P. L., Adewole, D. O., Kuo, E., Cullen, D. K. Advanced biomaterial strategies to transplant preformed micro-tissue engineered neural networks into the brain. J. Neural Eng. 13 (1), 16019-16037 (2016).
  48. Huang, J. H., Cullen, D. K., et al. Long-Term Survival and Integration of Transplanted Engineered Nervous Tissue Constructs Promotes Peripheral Nerve Regeneration. Tissue Eng. Part A. 15 (7), 1677-1685 (2009).
  49. Winter, C. C., Katiyar, K. S., et al. Transplantable living scaffolds comprised of micro-tissue engineered aligned astrocyte networks to facilitate central nervous system regeneration. Acta Biomater. 38, 44-58 (2016).
  50. Alexander, J. K., Fuss, B., Colello, R. J. Electric field-induced astrocyte alignment directs neurite outgrowth. Neuron Glia Biol. 2 (2), 93-103 (2006).
  51. Hsiao, T. W., Tresco, P. A., Hlady, V. Astrocytes alignment and reactivity on collagen hydrogels patterned with ECM proteins. Biomaterials. 39, 124-130 (2015).
  52. Alekseeva, T., Katechia, K., Robertson, M., Riehle, M. O., Barnett, S. C. Long-term neurite orientation on astrocyte monolayers aligned by microtopography. Biomaterials. 28 (36), 5498-5508 (2007).
  53. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. (63), (2012).
  54. Conway, A., Schaffer, D. V. Biomaterial microenvironments to support the generation of new neurons in the adult brain. Stem Cells. 32 (510), 1220-1229 (2014).
  55. Barry, D., McDermott, H. Differentiation of radial glia from radial precursor cells and transformation into astrocytes in the developing rat spinal cord. Glia. 50 (3), 187-197 (2005).
  56. Pertusa, M., Garcia-Matas, S., Rodriguez-Farre, E., Sanfeliu, C., Cristofol, R. Astrocytes aged in vitro show a decreased neuroprotective capacity. J. Neurochem. 101 (3), 794-805 (2007).
  57. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -. L. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  58. Balgude, A. P., Yu, X., Szymanski, A., Bellamkonda, R. V. Agarose gel stiffness determines rate of DRG neurite extension in 3D cultures. Biomaterials. 22 (10), 1077-1084 (2001).
  59. Smeal, R. M., Tresco, P. A. The influence of substrate curvature on neurite outgrowth is cell type dependent. Exp. Neurol. 213 (2), 281-292 (2008).
  60. Smeal, R. M., Rabbitt, R., Biran, R., Tresco, P. A. Substrate curvature influences the direction of nerve outgrowth. Ann. Biomed. Eng. 33 (3), 376-382 (2005).
  61. Jain, A., Kim, Y. -. T., McKeon, R. J., Bellamkonda, R. V. In situ gelling hydrogels for conformal repair of spinal cord defects, and local delivery of BDNF after spinal cord injury. Biomaterials. 27 (3), 497-504 (2006).
  62. Katiyar, K. S., Winter, C. C., Struzyna, L. A., Harris, J. P., Cullen, D. K. Mechanical elongation of astrocyte processes to create living scaffolds for nervous system regeneration. J. Tissue Eng. Regen. Med. , (2016).
  63. McCarthy, K. D., De Vellis, J. Preparation of Separate Astroglial and Oligodendroglial Cell Cultures from Rat Cerebral Tissue. J. Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
  64. Cullen, D. K., Stabenfeldt, S. E., Simon, C. M., Tate, C. C., LaPlaca, M. C. In Vitro Neural Injury Model for Optimization of Tissue-Engineered Constructs. J. Neurosci. Res. 85, 3642-3651 (2007).
  65. Kim, S. U., Stern, J., Kim, M. W., Pleasure, D. E. Culture of purified rat astrocytes in serum-free medium supplemented with mitogen. Brain Res. 274 (1), 79-86 (1983).
  66. Morrison, R. S., de Vellis, J. Growth of purified astrocytes in a chemically defined medium. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78 (11), 7205-7209 (1981).
  67. Stopak, D., Harris, A. K. Connective tissue morphogenesis by fibroblast traction. I. Tissue culture observations. Dev. Biol. 90 (2), 383-398 (1982).
  68. Hsiao, T. W., Swarup, V. M., Kuberan, B., Tresco, P. A., Hlady, V. Astrocytes specifically remove surface-adsorbed fibrinogen and locally express chondroitin sulfate proteoglycans. Acta Biomater. 9 (7), 7200-7208 (2013).
  69. Phillips, J. B., Bunting, S. C. J., Hall, S. M., Brown, R. A. Neural tissue engineering: a self-organizing collagen guidance conduit. Tissue Eng. 11 (9), 1611-1617 (2005).
  70. Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, M. C. Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures. Brain Res. 1158, 103-115 (2007).
  71. Filous, A. R., Miller, J. H., Coulson-Thomas, Y. M., Horn, K. P., Alilain, W. J., Silver, J. Immature astrocytes promote CNS axonal regeneration when combined with chondroitinase ABC. Dev. Neurobiol. 70 (12), 826-841 (2010).
  72. Johansson, S., Strömberg, I. Guidance of dopaminergic neuritic growth by immature astrocytes in organotypic cultures of rat fetal ventral mesencephalon. J. Comp. Neurol. 443 (3), 237-249 (2002).
  73. Jiang, Z., Han, Y., Cao, X. Induced pluripotent stem cell (iPSCs) and their application in immunotherapy. Cell. Mol. Immunol. 11 (1), 17-24 (2014).
  74. Wang, L., Cao, J., et al. Immunogenicity and functional evaluation of iPSC-derived organs for transplantation. Cell Discov. 1, (2015).
  75. Wolmer-Solberg, N., Cederarv, M., Falci, S., Odeberg, J. Human neural stem cells and astrocytes, but not neurons, suppress an allogeneic lymphocyte response. Stem Cell Res. 2 (1), 56-67 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

131

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved