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요약

우리 쇼케이스 경도 정렬된 astrocytic somata 소설 소재 넣음 내 프로세스의 자기 조립, 3 차원 번들의 개발. 이러한 "생활 건설 기계", 아직 테스트-베드 neurodevelopmental 메커니즘을 공부 하거나 감독 신경 마이그레이션 및 axonal neuroregeneration를 용이 하 게 하 역할 수 센티미터 길이, 확장 미크론 단위 직경을 전시 설계 길입니다.

초록

Neurotrauma 및 신경 퇴행 성 질환 자주 손실된 신경 대체 axonal 경로 재생성 하 중앙 신경 시스템 (CNS)의 제한 된 용량으로 인해 신경학 상 적자 지속 될. 그러나, 신 시스템 개발, 신경 마이그레이션 및 axonal 확장 하는 동안 자주 발생 "건설 기계 생활"로 다른 세포에 의해 형성 하는 경로 따라 합니다. 이러한 메커니즘을 에뮬레이션 circumvents CNS의 금지 환경 전략을 디자인 하 고 추구,이 원고 제공 조직 설계를 조작 하는 프로토콜 사이토 기반 "건설 기계 생활". 이러한 구조를 만들려면, 우리는 바이 폴라 경도 정렬 somata 및 프로세스의 고밀도 3 차원 번들으로 조립 자체 이다 유도 하는 소설 소재 넣음 구조 고용. 첫째, 빈 히드로 마이크로-열 조립 했다, 그리고 내부 루멘 기질-콜라겐 코팅 했다. 해리 대뇌 피 질 이다 다음의 중요 한 내부 직경, 및 원통형 마이크로 열의 루멘으로 배달 되었다 < 350 µ m, 자발적으로 자기 정렬 및 밀도 번들으로 구성 된 긴 섬유 같은 케이블을 생산 하는 계약을 체결 사이토 프로세스와 콜라겐 소 측정의 < 150 µ m 직경에 길이 몇 cm를 확장. 이러한 전시 생활 건설 기계 설계 > 97% 생존 세포와 거의 독점적으로 했다 이다 표현 하는 중간 필 라 멘 트 단백질 폐해 fibrillary 산 성 단백질 (GFAP), vimentin의 조합 및 nestin의 구성. 이 사이토 네트워크 신경 첨부 파일에 대 한 관대 한 기질을 제공 하는 것을 발견 했다 고 neurite 연장 정렬 정렬. 또한, 이러한 구조에 맞춤 히드로 넣음, CNS 이식 적합 하에서 추출 될 때 무결성 유지 관리 합니다. 이러한 미리 형성한 구조는 구조적으로 자연스럽 게 발생의 주요 cytoarchitectural 요소를 에뮬레이션 "건설 기계 생활" glial 기반 에 비보. 따라서, 이러한 설계 생활 건설 기계 테스트-베드 neurodevelopmental 메커니즘에서 생체 외에서 연구 또는 신경 마이그레이션 및 CNS 변성 vivo에서 다음 axonal 길 여 neuroregeneration 촉진 역할 수 있습니다. .

서문

중앙 신경 조직 (CNS) 중화 손실 및/또는 신경의 외상 성 뇌 손상 (TBI), 같은 조건이 동반 axonal 경로 장애 제한 용량이 뇌졸중, 척수 상해 (SCI), 및 신경 퇴행 성 질병1 ,2,3,,45. CNS에 신생 방해 손실된 신경6,7의 복원, 두뇌에 있는 영역의 제한 된 수에 제한 됩니다. 또한, CNS에서 손실된 axonal 통로의 재생 감독된 지침의 부족, 파생물 억제제, 및 신경 조직2,8에 손상 다음 반응 astrogliosis의 존재 충분 하지 않습니다. 9,10. 이다는 일반적으로 이온 항상성, 신경 전달 물질 클리어런스, 시 냅 스 형성, 및11를 커플링 하는 혈관과 신경 지원에 다양 한 기능을가지고. 그럼에도 불구 하 고, 신경 조직에 가벼운 손상, 다음 이다 수 있습니다 받을 분자, 구조적, 기능적 변화 그들은11hypertrophic 상태 전환. 심한 neurotrauma에 대응, 이러한 변경 결과 흉터의 형성에 포함 된 마이그레이션 반응성 이다는 파열된 혈액-뇌 장벽 (BBB) microglia에서 유출 하는 백혈구를 포함 하는 병 변 코어 penumbra oligodendrocytes, 그리고 섬유 아 세포11,,1213. 이러한 반응성 이다 달성 filamentous, 비 조직 프로세스의 형태 그리고 중간 필 라 멘 트 단백질 및 신경 재생12방해 콘 proteoglycans (CSPGs)의 증가 식 전시. Glial 흉터 처음 BBB 무결성을 복원 하 고 건강 한 티슈를 에워싸는 것 염증 반응의 전송을 방지 하는 데 도움이, 비록 그것은 축 삭 재생12,14에 대 한 물리적 및 생화학 장벽 역 ,,1516. 예를 들어, glial 흉터 발생 axons 주먹코 dystrophic 성장 콘을 표시 하 고 성장12저하. 또한, 부상 후 astrocytic 프로세스의 해체는 축 삭17회생의 확장을 방해 한다. 이러한 억제 특성의 결과 종종 영구 신체적, 신경 장애 환자 겪는 심각한 neurotrauma, TBI 및 문화를 포함 한 후에 각 성

외부 직면 CNS 기능 재생에 축 삭 재생성 하는 본질적인 능력을가지고 표시 되었습니다. 예를 들어, glial 흉터 문의 dystrophic 성장 콘의 동적 특성 제안 이러한 엔딩 확장12하 그들의 능력을 유지 합니다. 따라서, 그것은 있다고 믿고 axonal 다시 성장에 주요 방해 후 부상 CNS와 감소 glial 흉터 및 흉터에서 재생 다리 것 제공을 통해 더 환경을 제공 하는 금지 환경 유리. 실제로, 이전 학문은 설명 했다 CNS 뉴런 축 삭 재생12,18에 대 한 더 많은 유리한 환경을 제시, 교량으로 주변 신경 이식 술을 사용 하 여 병 변을 통해 축 삭 연장 가능 했다 19. 여러 가지 다른 전략이 흔적 재생 능력을 악용 하 추구 되어 있다. 예를 들어 다양 한 부상 모델에서 세포 성장 신호 통로의 조작 axonal 재생 및 glial 흉터 감소10,,2021에 결과 있다. 또한, 연구 치료 chondroitinase CSPGs에 설탕 체인의 대부분을 앞, ABC CSPGs 반응 이다22분 비의 억제 효과 줄이는 나타났습니다. 도 불구 하 고 고무적인 결과, 이러한 방식을 벗어난 재생12, 잠재적으로 발생할 수 있습니다 하 고 또한 신경의 손실에 대 한 계정을 하지 않습니다 성장 콘의 지도 감독을 제공 하지 않습니다. 셀 기반 접근 시도 glial 흉터의 효과 극복 하 고 보충 손실된 세포, 특히 신경에 이용 되어 있다. 다른 CNS 병 변 축 삭 재생23,24, 을 추진 하 고 다시 상해 지역에 신경 조상 세포를 이식 하는 동안 일부 그룹 뉴런으로 반응 이다를 dedifferentiated는 그러나 25., 줄기 세포 이식 혼자 낮은 생존 율, 불 쌍 한 통합 및 손상 된 조직을5겸손 보존에 의해 제한 됩니다. 또한, 이러한 세포 기반 전략 제어 방식 특히 장거리 axonal 책자를 복원 실패. 따라서, 다른 접근에와 함께 바이오는 다양 한 신경에 대 한 배달 차량으로 탐험 되 고 조상 세포 및 성장 요인26. 소재 기반 접근 디자인 컨트롤 구문 특정 물리적, haptotaxic 모방 생산의 높은 학위와 대상 호스트 조직27의 3 차원 (3D) microenvironment chemotaxic 단서 제시 28,29,30,31,32,,3334. 이러한 환경 신호 복제는 네이티브 같은 형태학, 확산, 마이그레이션, 및 다른 neurobiological 특성29중 신호 이식된 세포에 대 한 최고입니다. 이러한 유리한 속성 시드 전통적인 셀 소재 건설 기계 넘어 발전은 동시에 감독된 장거리 axonal 재생을 촉진 하 고 손실 된 신경 세포를 대체 하는 데 필요한.

"생활 건설 기계", 다른 네이티브 neuroanatomy를 에뮬레이트하는 미리 형성한 cytoarchitecture와 살아있는 신경 세포의 존재로 인해 다른 셀 기반 접근을 설계 유망한 다른 접근은 신경 조직 기반 및 타겟된 교체, 개조, 및 신경 회로4,35의 재생을 촉진 하기 위하여 발달 기계 장치. 건설 기계 생활의 디자인에 대 한 고려 사항 포함 고기 그리고 신경 세포, 기계/물리 속성의 소스 및 생 화 확 적인 신호 어떤 동반 바이오35의 구성에 의해 결정. 제조 후 체 외에, 이러한 생활 건설 기계 이식 수 비보에 현재 세포 접착 분자 및 혈 및 科 신호 신경 세포 이동과 축 삭 가지 상태에 따라 적극적으로 규제를 하 고 재생의 진행35를처리합니다. Glial 세포는 이후 다양 한 개발 메커니즘에 vivo에서이 세포 중재 건설 기계 생활 설계 된 cytoarchitecture에 대 한 기준으로 사용할 수 있습니다. 두뇌 개발, 새로운 신경 세포 기저 프로세스 개발 외피 격판덮개로 심 실 영역에서 방사형 명과 감독된 마이그레이션36,37건설 기계 생활으로 확장에 의존 합니다. 또한, 콘은 도표 glial 세포, elicited 매력적이 고 구 충 제 신호를 감지 하 여 스스로 방향을 표시 하 고 소위 "개척" 축 삭 성장 확장 제안 하 고 폐해 미리 패턴을 따라 확장 하 여 올바른 목표 도달 35,,3839투어 따라서, glial 세포는 축 삭, 나중으로 축 삭을 기반으로 봉사 하는 개척의 지도에 필요한 "건설 기계 생활" "추종자" 축 삭의 투영을 직접. 또한, 명과 중재 성장 메커니즘 표시 되었습니다 유지 postnatally, neuroblasts 따라 rostral 철새 스트림 (RMS) 帯 (SVZ), 성체 뇌에서 신생의 몇 가지 남아 있는 분야 중 하나에서 탐색 하는 후 각 전구 (OB)40. RMS에서이 neuroblasts 경도 정렬 astrocytic 프로세스, 직접 셀 유착을 통해 이루어진 고 성 요인37, 지역화 glial 튜브 (그림 1A-1), 내 마이그레이션 41. 마지막으로, 포유류 원인에 CNS 손상 중단 astrocytic 프로세스 배열 axonal 재생17를 물리적으로 방해 glial 흉터를 형성 하는 동안 많은 비 포유류 시스템 부족 해로운 glial 흉터의 형성. 오히려, 비 포유류 종의 glial 세포 유지 더 조직, 부상된 지역17,,4243를 통해 가이드로 사용 되는 패턴을 정렬 합니다. 예를 들어, 비 포유류 과학 모델에서 축 삭 glial 다리 건너 기판 axonal 재생과 기능 회복 (촉진으로 조직 된 폐해 건설 기계에 대 한 중요 한 역할을 제안 하는 병 변와 가까운 협회에서 성장에 표시 됩니다. 그림 1A -2) 42 , 44 , 45. 신경 해부학 기능 및 위에서 설명한 발달/재생 메커니즘의 재현 부 동시에 미 숙 신경 마이그레이션 구동할 수 조작된 폐해-기반 생활 장비의 새로운 클래스를 얻을 수 있습니다 및 axonal 그렇지 않으면 비 허용 환경, 그로 인하여 잠재적으로 신경의 효과 완화를 통해 길 및 축 삭으로 변성 CNS 상해 및 질병과 관련 된.

연구 그룹은 이전 여러 종류의 재건을 위한 건설 기계 생활 설계 및 CNS와 말 초 신 경계 (PNS) 마이크로 조직 통해 axonal 책자의 재생 신경 네트워크 (마이크로-TENNs) 및 조직 설계 신경 이식 (TENGs), 각각27,,4647,48를 설계. 두 전략 biomimicry에 근본적으로 근거한 다. 마이크로-TENNs는 해부학 영감 구조 구조적 및 기능적으로 연결 하는 뇌의 뚜렷한 신경 인구 axonal 책자를 대체 하도록 설계 되었습니다. TENGs 축 삭 촉진 axonal 중생, 타겟된 호스트 axonal 재생35,,4648를 달성 하기 위해 "선구자" 축 삭을 따라 "추종자" 축 삭 성장에 의해 exemplified의 개발 메커니즘을 악용 합니다. 우리는 최근 생활 발판의 다양성에 대문자로 기술 개발을 통해 제시 하는 마이크로 TENNs로 비슷한 넣음 스키마를 사용 하 고 명과 기반 메커니즘에서 영감을 추구. 여기, 우리는 히드로 마이크로 열49의 collagenous 루멘에 걸친 정렬된 astrocytic 번들으로 구성 된 구조를 개발 했다. 이러한 astrocytic 생활 건설 기계 만들 해당 직경의 하는 외경 (OD) 및 내경 (ID)와 함께 빈 원통형 히드로 액체 agarose는 모 세관 튜브-침술 바늘 어셈블리를 작성 하 여 개발 되는 튜브와 바늘, 각각. Agarose 겔 화와 히드로 마이크로 열 모 세관 튜브에서 추출, 빈 내부는 유형 나 사이토 접착을 위한 관대 한 환경을 제공 하는 콜라겐 코팅 및 정렬 번들 형성 (그림 1B -1)입니다. 이후에, 루멘은 대뇌 피 질 이다 출생 후 쥐 새끼 (그림 1B-2)에서 절연 된 시드. 2 차원 (2D) 정렬 기법 (ECM) 단백질 패턴, 전기 분야, micropatterned 홈 및 세포 외 매트릭스의 응용 프로그램에 의존 하는 생활 발판에서 사이토 맞춤 반대로 기술에 의존 자기 조립 제어 변수 같은 기판 곡률 (열 ID), 셀 밀도 및 콜라겐 농도50,,5152에 따르면. 이다 계약, 콜라겐을 리 모델링 하 고 바이 폴라, 경도 정렬 형태에서 관찰 vivo에서 (그림 1B-3) 자연 건설 기계와 유사한 취득. 실제로, 우리는 적극적으로 추구 하 고이 케이블 같은 구조를 사용 하 여 미 성숙한 신경 세포 이주 특히 손상 된 CNS의 불리 한 환경을 통해 axonal 재생 촉진의 대상된 지도 대 한 실제 기판으로 포유류 glial 흉터 (그림 1C). 이 문서는 astrocytic 마이크로-열에 대 한 자세한 제작 방법을 제시, 단계 예상된 cytoarchitecture의 현재 한계에 대 한 포괄적인 토론 명암과 면역 형광 이미지 및의 미래 방향에 기술입니다.

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그림 1: 영감, 제조 프로토콜 및 정렬된 Astrocytic 네트워크에 대 한 제안 된 응용 프로그램. (A) Neurobiological 영감: neurogenic 帯 (SVZ)에서 발생 하는 (1) Neuroblasts 후 각 전구 (OB); 향해 감독 마이그레이션 rostral 철새 스트림 (RMS)에 경도 정렬된 glial 관 활용 (2) 비-포유류 양서류, 물고기 등 신경 조직의 병 변 (예: transected 척수)의 끝을 연결 하 고의 지도 위한 비 계 역할 glial 다리의 형성으로 인해 일부 손상 후 재생을 유지할 수 있는 축 삭 재생 (B) 제조 개요: ECM, 코팅 루멘과 미크론 크기, 빈 히드로 마이크로 열의 건설 (1) (2) 기본 외피 이다 출생 후 쥐 새끼, 경도 중심의 (3) 자기 조립에서 고립의 시드 문화와 미래 이식 연구 소재 넣음에서 번들의 (4) 추출에서의 번들 (C) vivo에서 응용 프로그램: (1) 이러한 생활 건설 기계 신경 결핍 지역; 다시 neurogenic 센터에서 감독된 신경 마이그레이션에 대 한 설계 glial 튜브 역할을 수 있습니다 (2) 축 삭 지도 개척의 발달 메커니즘 및 비 포유류에서 glial 교량의 재생 메커니즘의 재현 부 비 허가 걸쳐 축 삭 재생을 직접 수 용량을 가진이 astrocytic 건설 기계를 부여 수 있습니다. 포유류 glial 흉터의 환경입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

프로토콜

모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 펜실베니아 대학의 마이클 J. Crescenz 노 병 사변 의료 센터에 의해 승인 되었고 자비 롭에 NIH 공중 보건 서비스 정책에 명시 된 지침을 준수 관리 및 실험실 동물 (2015)의 사용 합니다.

1. 개발의 Agarose 히드로 마이크로-열

  1. Agarose의 3 g의 무게와 Dulbecco의 버퍼링 하는 인산 염 (DPBS) 100 mL를 포함 하는 메 마른 비 커에 전송 agarose 3% 무게/볼륨 (w/v) 솔루션을 확인 합니다. 비이 커에 살 균 자석 막대를 추가 하 고 핫 플레이트/활동가의 표면에 놓습니다. 다음 단계에서 내용물의 증발을 방지 하기 위해 적용 하는 비 커를 유지.
  2. Agarose 및 DPBS 100 ° C의 온도에서 열 하 고 60-120 rpm에서 저 어 합니다. 필요에 따라 이러한 설정을 조정 하 고 솔루션은 agarose는 완전히 해산 되었습니다 의미 명확한 모양 불투명에서 처음 변경 끊임없이 해체 과정의 진행을 모니터링 합니다.
    주의: 뜨거운 비 커와 솔루션은!
  3. Agarose 솔루션 열 자극으로 4 개의 빈 10 cm 배양 접시를 검색 하 고 그들의 2 DPBS의 20 mL를 추가 합니다. 침술 바늘을 배치 (직경: 300 µ m, 길이: 40 m m), microliter 모 세관 튜브 유리 (직경: 701.04 µ m, 길이: 65 mm, 용량: 25.0 µ L), 그리고 biosafety 캐비닛 안에 전구 디스펜서. 때 액체 agarose 솔루션 지웁니다, 유지 관리 일정 약 50 ° C에서 난방는 agarose의 겔 화를 피하기 위해 교 반 합니다.
  4. 침술 바늘 전구 디스펜서의 하단 오프닝으로 소개 합니다. 외부에 노출 하는 바늘을 통해 모 세관 튜브를 삽입 합니다. 모 세관 튜브 전구 디스펜서 실린더의 고무 부분에 그것의 일부를 입력 하 여 보안.
  5. 빈 페 트리 접시의 표면에는 micropipette와 액체 agarose의 1 mL를 전송 하 고 전구 디스펜서의 고무 캡을 안쪽으로 슬쩍 되는 동안 agarose, 접촉 모 세관 튜브의 한쪽 끝을 수직 (바늘 삽입)으로 장소. 천천히 압력을으로 그리는 agarose 모 세관 튜브 전구 디스펜서 모자에 놓습니다.
    참고: 모 세관 튜브로 액체 agarose의 양도 빠르게 수행 되어야 합니다. 액체 agarose 남아 있는 경우 충분 한 시간 동안 배양 접시 표면에 냉각 (약 60 s), 모 세관 튜브를 따라 agarose의 적당 한 suctioning 방지 젤, 시작.
  6. 장소 각 전구 튜브 바늘 조립 무료 페 트리 접시에 하자는 agarose 젤 모 세관 튜브 내부 강화 위한 5 분 신중 하 게 전구 디스펜서 실린더에서 고무 마 개에서 손으로 모 세관 튜브를 당겨 바늘을 떠나와 agarose 젤 튜브 내부.
  7. 모 세관 튜브; 천천히 당겨 침술 바늘을 수동으로 추출 새로 응고 agarose 실린더는 또한 아직도 바늘을 둘러싼이 절차에서는 튜브 슬라이드. 부드럽게 침술 바늘 끝에 이동 소독 집게의 끝에와 함께 따라 마이크로 열을 슬쩍 찌 르다. 오픈, 포함 하는 DPBS 페 트리 접시에 바늘을 놓고 집게는 DPBS에 마이크로 열 밀어.
    참고: agarose 마이크로 열 침술 바늘의 제거에 따라 유리 모 세관 튜브 내 경우, 천천히 agarose 마이크로 열 모 세관 튜브 25 mm 게이지 바늘으로 및 밀 DPBS 함께 그릇에.
  8. Microscalpels 또는 뜨거운 비드 소독 기를 사용 하 여 집게를 소독. Agarose의 4 g의 무게와 DPBS의 100 mL에 전송 하 여 4 %w / v agarose를 확인 합니다. 가 열 하 고 명확한 4% 액체 agarose 솔루션을 1.2 단계에 설명 된 대로 저 어. 가 열 하 고 다음 단계를 통해 솔루션의 감동 유지.
  9. 절 개 후드에 마이크로 열을 포함 하는 배양 접시를 전송 고 빈 페 트리 접시를 미세 집게와 마이크로 열을 이동 합니다. 시각적 안내 stereoscope 및 microscalpel 마이크로 열 원하는 길이로 잘라 이용 한다. ECM 및 셀 추가 동안 마이크로 열 처리를 용이 하 게 하는에 수평에서 45o 각도에서 입체 형태로 끝에 양쪽 끝을 잘라.
  10. 이전 같은 페 트리 접시에 더 많은 마이크로 열 3에 대 한 단계와의 분리와 동시에 4 개의 구문 줄 반복 < 실린더의 각각 사이 3 m m. 4 %agarose micropipette 솔루션의 50 µ L을 로드 하 고 액체의 행진/라인을 연결 하 고 4의 그룹으로 구문 번들 마이크로 열 배열 붓는 (약칭 이라고 "마이크로 열 배"). 4 %agarose 구문 사이의 거리를 최소화 하 고 얇은 라인에는 agarose를 신속 하 게 추가 하는 방법으로 인테리어를 방해할 수 있습니다 마이크로 열의 끝의 움직임을 피하십시오.
    참고: astrocytic 건설 기계를 조작 하 하지 필요 "배"로 4 개의 마이크로 열 그룹을 정렬 합니다. 그럼에도 불구 하 고, 보트 제공 제조 과정을 촉진 하 고 이동 하 고 마이크로-나중 단계에서 열 처리 하는 안전한 방법을 제공 합니다.
  11. 1-2 분 추가 4 %agarose 겔 화를 허용에 대 한 마이크로 열 배 식 지. 연결 4 %agarose 좋은 집게와 마이크로 열 보트를 선택 하 고 다른 포함 하는 DPBS 페 트리 접시에 준비 단계 1.1.3에서에서 마이크로 열 이동. 원하는 대로 나머지 마이크로 열 더 보트를 조작.
  12. 마이크로 열 및/또는 보트 biosafety 내각을 포함 하는 배양 접시를 이동 하 고 30 분 동안 자외선 (UV)에 노출 된 소독.
    주의: 자외선에 노출을 방지 하기 위해 적절 한 보호를 착용 하십시오.
  13. ECM 추가 및 셀 도금 즉시 발생 하지 것입니다 경우 4 ° C에서 마이크로 열 보트와 요리 DPBS에 저장 후, 1 주까지. 이 기간 동안 구문을 사용 하지 않는 경우 마이크로 열 제조 단계를 반복 합니다.

2. 1 차 세포 배양 및 절연

  1. 쥐 새끼에서 대뇌 피 질의 사이토 격리
    1. 다음 단계에 대 한 준비, 행 크의의 20 mL 균형 소금물 (HBSS) 해 부 조직에 대 한 저수지 역할을 하는 4 개의 10 cm 배양 접시를 추가 합니다. 얼음에 모든 요리를 유지. 깨끗 한 수술가 위, 집게, 마이크로-주걱, 그리고 마이크로-scalpels 뜨거운 비드 소독 기에 소독.
    2. Prewarm 1 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)와 0.15 mg/mL deoxyribonuclease (DNase) 0.25% trypsin HBSS 37 ° c.에 있는 나 또한, prewarm의 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 햄의 F-12 영양소 혼합물을 구성 하는 37 ° C에서 사이토 문화 매체.
    3. 저체온증이 조건에 그들을 노출 하 여 출생 후 하루 0 또는 1 일 Sprague-Dawley 쥐 새끼를 anesthetize 하 고 잘린 여 안락사. 핀 19 m m를 사용 하 여 단계에 머리 눈 앞쪽 주 둥이 바늘 게이지.
    4. 눈 바로 뒤에 까지의 목의 기지에서 앞쪽에 후부 중간에서 내려 메스로 절 개를 확인 합니다. 옆에서 눈 아래쪽, T 자형을 형성 뒤에 직접가 하는 또 다른 절 개를 실시 합니다. 미세 집게를 사용 하 여 측면에 두개골 피부/해골 챌.
    5. 외부 표면에 다른 동물의 입에 (위로 향하도록)는 집게의 한 단자를 배치 하 여 주 둥이로 머리를 잡아. 살 균 마이크로-주걱으로 두뇌를 제거 하 고 냉장된 HBSS 가득 배양 접시 중 하나에 그것을 배치. 곳이 페 트리 접시 얼음에 즉시 이후에 그리고 모든 경우에서 제외 하 고 시간.
    6. 절 개 후드 내부 stereoscope-20 ° C에 이전 저장 된 화강암 블록을 놓으십시오. 해 부 절차 동안 그것의 낮은 온도 유지 하기 위해 화강암 블록의 표면에 뇌 조직으로 페 트리 접시를 놓습니다. 다음 단계에 걸쳐 시각적 지침으로는 stereoscope를 사용 합니다.
    7. 후 각 전구 그대로 남아 있으면 집게 또는 microscalpels 그들을 절단 하 여 추출. 또한, 소 뇌를 제거 하 고 두 개의 대뇌 반구를 분리 하는 중간 선 절 개는 microscalpel를 사용 합니다. 신선, 냉장 HBSS 포함 된 배양 접시에 집게를 가진 반구를 전송.
    8. 분리 된 외피가를 microscalpel으로 반구의 내부에서 midbrain 구조를 해 부. 고급 포 셉을 사용 하 여 대뇌 피 질의 조직에서 meninges, 시트와 같은 구조를 벗기다 절연된 외피가 찬 HBSS로 새로운 배양 접시에 전송. microscalpel를 사용 하 여 다음 단계에서 트립 신 행동에 대 한 표면적을 증가 하기 위하여 직물을 말하다.
    9. 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 prewarmed 트립 신-EDTA (각 관에서 8 외피가)의 4 mL를 포함 하는 15 mL 원심 분리기 튜브에는 외피가 전송. 트립 신-EDTA 37 ° c.에 5-7 분 동안에 대뇌 피 질의 조직 노출
    10. 파스퇴르 피 펫, 신중 하 게 제거 하는 트립 신-EDTA와 0.15 mg/mL DNAse의 400 µ l을 추가 내가 원심 분리기 튜브에 솔루션. 모든 조직의 해리는 액체에 있는 아무 나머지 조직 조각 때까지 튜브 또는 소용돌이 교 반 하십시오. 완전히 조직 분해 불가능, 파스퇴르 피 펫의 끝을 가진 나머지 조각을 제거 합니다.
    11. 원심 분리기 튜브 200 x g 3 분에 해리 셀 솔루션을 포함 하는 셀을 방해 하지 않고 파스퇴르 피 펫과 상쾌한을 제거 합니다. (2.1.2 단계에서 정의 된) 사이토 문화 매체의 1 mL는 micropipette와 튜브를 추가 하 고 resuspend 균질 솔루션을 선동.
    12. T-75 플라스 크에 10 mL 혈 청 학적인 피 펫과 사이토 문화 매체의 전송. 플라스 크 당 셀의 가치가 한 강아지 뇌 접시를 플라스 크에는 micropipette 1 mL 셀 솔루션 (단계 2.1.11에서에서 준비)의 250 µ l를 추가 합니다. 문화 매체를 통해 방전된 셀 솔루션을 균등 하 게 배포 하 고 부드럽게 더 동등한 배급을 홍보 하기 위해 플라스 크를 선동.
    13. 37 ° C, 5% CO2습도 인큐베이터에서 도금된 플라스 크 문화. 도달 후 24, 72 h 문화에, 기계적으로 교 반 하십시오 신경 및 oligodendrocytes와 같은 비 부착 세포 유형 분리를 플라스 크.
    14. 나중에, 각각이 timepoints의, 미디어 변화를 수행 합니다. 그래서 문화 미디어 준수 셀 취재 플라스 크의 하단에 거짓말 플라스 크를 수직으로 잡으십시오. 배양 세포를 추출 하는 피하기 위해 플라스 크의 하단 모서리에 대 한 피 펫의 끝을 누르면 파스퇴르 피 펫과 발음 원래 수평 위치에 플라스 크를 놓고 부드럽게 셀 혈 청 학적인 피 펫을 통해 사이토 매체의 10 mL를 추가 합니다.
    15. 각 미디어 변경 후 인큐베이터에 있는 플라스 크를 반환 합니다. 90 %confluency 달성 후 기계적으로 어떤 나머지 비 준수 세포를 제거 하는 한 번 더 플라스 크를 교 반 하십시오.
    16. 진공 청소기와 파스퇴르 피 펫 문화 매체를 취 함으로써 통행에 이다. 준수 셀에 0.25 %trypsin-EDTA와 혈 청 학적인 피 펫의 5 mL를 추가 합니다. 부드럽게 모든 셀을 처리 하는 트립 신을 보장 하기 위해 플라스 크를 선동 하 고 37 ° C, 5% CO2에 5-7 분 동안 플라스 크를 품 어.
    17. 사이토 매체의 1 mL 혈 청 학적인 피 펫과 셀을 추가 하 여 트립 신을 끄다. 혈 청 학적인 피 펫과 플라스 크에서 셀 솔루션을 추출 하 고 살 균 15ml 원심 관에 그것을 전송. 3 분 x 200g에 튜브 원심
    18. 혈 청 학적인 피 펫과 상쾌한을 제거 하 고 사이토 문화 매체의 1 mL에 resuspend. 셀 솔루션은 균질 되도록 튜브를 교 반 하십시오. hemocytometer 또는 자동 셀 카운터 솔루션에서 셀의 개수를 계산 합니다.
      참고: 일반적으로 90% 합칠은 플라스 크 수율 약 3 백만 이다.
    19. T-75 플라스 크에 사이토 문화 매체의 10 mL를 추가 합니다. 1:4 희석 이미 문화 매체를 포함 하는 T-75 플라스 크에는 micropipette와 셀 솔루션 (단계 2.1.18)의 250 µ l를 전송 하 여 수행 합니다. 부드럽게 플라스 크의 표면에 걸쳐 균일 셀 분배 되도록 교 반 하십시오.
    20. 90 %confluency 셀 통로를 얻을 때마다 2.1.16-2.1.19 단계를 반복 합니다.
  2. 쥐 태아에서 대뇌 피 질의 신경 절연
    1. 유사한 준비 단계로 2.1.1, 2.1.2, prewarmed 미디어 공동 문화 미디어, Neurobasal 매체 (신경)에 대 한 2 %B-27 보충 + (이다)에 대 한 1 %G-5 혈 청 무료 보충 + 0.25%의 구성 된 예외와 함께 따라 L-글루타민.
    2. 이산화탄소 질 식과 타임-임신 배아 하루 18 Sprague-Dawley 쥐를 안락사 고 죽음 잘린 합니다.
    3. 쥐 태아를 추출 하 고 페 트리 요리 HBSS 집게53 , microscalpel, 및 소독된가 위, 영상 지도 stereoscope를 사용 하 여 냉장된 화강암 블록의 표면에 대뇌 조직의 나머지에서 외피가 해 부 . 머리, 두뇌, 대뇌 반구, 외피가의 연속 해 부, 후 각 조직 새로운 HBSS 가득 페 트리 접시에 전송 합니다.
    4. 트립 신에 대 한 표면 영역을 증가 하는 더 작은 조각으로 대뇌 피 질의 조직을 말하다. 양도 파스퇴르와 함께 4-6 외피가 prewarmed 트립 신-EDTA의 5 mL 튜브에 플라스틱 및 조직 분리를 37 ° C에서 유지. 5-7 분 수동으로 교 반 하십시오 혼합 하 고 조직의 응집 방지 튜브.
    5. 10 분 후 37 ° C에서 튜브를 제거 합니다. 앞에서 설명한 단계 2.1, 트립 신-EDTA를 추출 하 고 0.15 mg/mL DNAse 솔루션의 1.8 mL로 대체. 나중에, 소용돌이 솔루션까지 조직이 나타납니다 균질, 액체에 떠 있는 아무 조직 파편.
    6. 200 x g 3 분에 해리 조직 솔루션 원심 제거한 후에 상쾌한, 공동 문화 매체의 2 mL에 resuspend. hemocytometer 또는 자동 셀 카운터와 함께이 솔루션에는 셀의 수를 계산 합니다.
      참고: 일반적인 수익률은 3.0-5.0 x 106 셀/대뇌 반구.
    7. 위에 정의 된 공동 문화 미디어에서 105 셀/mL x 2.0-4.0의 밀도와 새로운 셀 솔루션을 준비 합니다.

3. 마이크로 열 내부 Astrocytic 케이블의 개발

  1. ECM 코어 제조
    참고: ECM 히드로 마이크로 열 내부에 있는 셀 시드 수행 됩니다 같은 날에 추가할 수 있다.
    1. Biosafety 내각, 내부 준비 1 mg/mL 쥐 꼬리의 솔루션 유형 I 교원 질 살 균 microcentrifuge 관에서 공동 문화 매체에. 사용 때 제외 하 고 모든 시간에 얼음에 ECM 솔루션 microcentrifuge 튜브를 유지 합니다.
    2. 1-2 µ L의 pH를 추정 하는 리트머스 종이의 스트립에 micropipette와 ECM 솔루션의 전송. 1 N 수산화 나트륨 (NaOH) 또는 염 산 (HCl)를 ECM 솔루션의 pH를 각각 늘리거나 micropipette와 1 µ L을 추가 하 고 균질을 위쪽 및 아래쪽 플라스틱. 새로운 pH 리트머스 종이 스트립을 확인 하 고 pH 7.2-7.4 범위에서 안정 될 때까지 필요에 따라 더 많은 산 성 또는 자료, 추가.
    3. 절 개 후드를 페 트리 접시 1.2 단계에서 이동 하 고 멸 균 미세 집게는 빈, 살 균 35 또는 60 mm 페 트리 접시에 4-5 마이크로-열 또는 보트 전송. 지도 stereoscope를 사용 하 여, 각 마이크로 열 및 빈 DPBS 및 공기 거품의 루멘을 흡입의 한쪽 끝에서 micropipette의 10 µ L 팁을 놓으십시오. 다음 단계에서 추가 된 ECM 루멘에서 자유롭게 흐를 수 있도록 stereoscope와 공기 방울의 부재를 확인 합니다.
    4. P10 micropipette ECM 솔루션, 장소 10 µ L 히드로 마이크로-열의 한쪽 끝에 대 한 팁과 루멘 (약 3-5 µ L), 관찰은 stereoscope와 ECM의 항목을 채우기 위해 충분 한 솔루션을 제공 충전. 마이크로 열의 양쪽 끝에 ECM 솔루션의 작은 저수지 (2-4 µ L) 플라스틱.
      참고: 항상 4-5 마이크로-열을 관리 하거나이 마이크로 열 구조의 crumpling 발생할 수 있으므로 방지 하기 위해 한 번에 하나의 보트 구문, 건조를 연장 합니다. 완전히 말린된 마이크로-열 셀 시드를 위한 그들의 사용을 방지 하는 접시의 표면에 단단히 연결 합니다. 이 아래에 설명 된 잠복기 동안 흐름 ECM을 일으킬 수 있기 때문에 (수 분 측정)으로 공동 문화 미디어의 과도 한 양의 마이크로 열에 추가할 수 없습니다.
    5. 열 부 화 하는 동안 밖으로 건조 하지 않도록 습도 싱크를 제공 하기 위해 페 트리 접시 주위에 반지에서 피 펫 공동 문화 미디어. 포함 하는 포함 하는 ECM 마이크로-열 신경 또는 이다 추가 하기 전에 콜라겐의 중 합을 촉진 1 h 37 ° C, 5% CO2 배양 접시를 품 어.
      참고: ECM 빈 루멘의 내부 표면에 코팅 층을 형성 한다 보다는 오히려 고체 ECM 코어 내부를 포괄, 둘 다 관찰 될 수 있다는 stereoscope를 사용 하 여. ECM는 코어를 형성, 층만 남아 때까지 잠복기를 계속 합니다. 이 층으로 형성, 사이토 셀 솔루션 도금 단계에서 마이크로 열 내부를 채울 수 있습니다.
    6. (아래와 같이) 인큐베이션 기간 동안 사이토 셀 솔루션을 준비 합니다.
  2. 사이토와 신경 마이크로 열에 뿌리기
    1. 통로 (사이 네 번째 및 12 번째 통로) 도금된 이다 단계 2.1.16-2.1.19에 설명 된 대로. 플라스 크에 세포의 수를 계산 후 셀 문화 미디어에 9.0 12.0 x 105 셀/mL 해결책의 조밀도에 셀 솔루션을 준비 합니다.
    2. stereoscope 사용 하 여, P10 micropipette의 팁 마이크로 열의 한쪽 끝에 놓고 완전히 그것을 채우기 위해 루멘으로 충분 한 셀 솔루션 (~ 5 µ L)를 전송 합니다. ECM와 위에 다, 각 마이크로 열의 양쪽에 셀 솔루션의 작은 저수지를 추가 합니다.
    3. 1 h는 ECM 이다 부착 홍보를 위한 37 ° C, 5% CO2 배양 접시에 도금된 마이크로 열 품 어. 신경 마이크로 열에 추가 되지 것입니다, 만약 3.2.5 단계를 진행 합니다.
    4. 초기 잠복기, 다음 1-2 µ L는 stereoscope 아래 관찰 하는 동안 단계 2.2.7 micropipette와 마이크로-열의 양쪽 끝에서에서 얻은 대뇌 피 질의 뉴런 솔루션의 추가. 충분 한 미디어, 건조 방지 하 고 신경 세포의 접착을 위한 수 있도록 37 ° C, 5% CO2 에서 40 분 다시 품 어를 요리에 존재 하는 확인 하십시오.
      참고: 대뇌 피 질의 뉴런 솔루션 또한 추가할 수 있습니다 신중 하 게 문화 미디어는 micropipette와 페 트리 접시에서 제거 후 단계 3.2.4 수행 번들 형성 후 1-2 일.
    5. 부 화 후 기간, 신중 하 게 작성 접시 각각 35 또는 60 mm 페 트리 접시를 위한 공동 문화 미디어의 3 또는 6 mL와 함께 도금된 마이크로 열을 포함 하는. 문화 홍보를 37 ° C, 5% CO2 도금된 마이크로 열 유지는 6-10 h 후 번들, 케이블 같은 구조를 형성 해야 정렬된 astrocytic 번들의 자기 조립.
  3. 사이토 케이블 아키텍처의 안정화
    참고: 번들의 형성, 후 구조, 경작의 대략 6-12 h astrocytic 장비의 정렬 구조의 붕괴를 방지 하기 위해 다음 단계를 수행 합니다.
    1. 살 균 microcentrifuge 관에서 3 mg/mL 쥐 꼬리 콜라겐 준비 나 공동 문화 미디어에서 솔루션. 7.2-7.4 단계 3.1.2에에서 설명 된 절차에 따라 솔루션의 pH를 조정 합니다. 때 사용에서 얼음에 콜라겐 재고 및 공동 문화 미디어를 유지 하 고 모든 시간에 얼음에 준비 된 콜라겐 솔루션을 배치.
    2. 접시는 micropipette, 마이크로 열의 수 분을 보장 하는 습도 싱크를 만들려고 접시의 측면에 몇 가지 미디어를 떠나와 astrocytic 건설 기계를 포함 하는에서 미디어를 제거 합니다. 시각화에 도움 stereoscope 아래 접시를 놓습니다.
    3. Micropipette, 시각적 지도 stereoscope를 사용 하 여 마이크로 열의 각 끝에 2-3 µ L 콜라겐 솔루션 및 방전의 소요. 접시는 접시의 가장자리 주위 습도 싱크 역할을 양쪽 주변 충분 한 미디어 다는 것을 확인 하십시오. 새로 추가 된 콜라겐의 겔 화를 촉진 하는 습도 인큐베이터에서 37 ° C, 5% CO2 시 30 분에 대 한 마이크로 열으로 페 트리 요리를 품 어.
    4. 천천히 3 또는 6 mL 공동 문화 미디어의 추가 (35 또는 60 mm 페 트리 접시, 각각)는 배양 하는 피 펫으로 요리 하 고 37 oC, 5% CO2에서 습도 인큐베이터에서 요리 문화.

4. 하이드로 겔 내부에서 Astrocytic 번들의 추출

  1. 유리 coverslips 오토 클레이 브에서 소독. 살 균 세포 문화 학년 물에 폴 리-L-리 신 (PLL)의 20 µ g/mL 솔루션을 준비 합니다.
  2. Biosafety 내각, 내부 수동으로 멸 균 10 cm 배양 접시를 멸 균된 유리 coverslips를 전송 하 고는 coverslips를 충당 하기 위해 충분 한 PLL 솔루션을 추가 합니다.
  3. PLL 솔루션 코트 표면에 37 ° C에서 30 분으로 덮여 coverslips를 품 어. 제거는 파스퇴르 피 펫과 PLL 솔루션 30 분 린스 후 세 번은 coverslip 셀 문화 학년 물 추가 파스퇴르 피 펫과 그것을 제거 하 여.
  4. 정렬 된 폐해 번들의 형성 후 멸 균 미세 집게와 멸 균 페 트리 접시에 섬세 하 게 마이크로 열을 전송 및 탈수를 방지 하기 위해 번들 건강 보장 micropipette 공동 문화 미디어의 10 µ L의 작은 수영장을 추가. 살짝 당겨 한쪽에서 시각적 지도 stereoscope를 사용 하 여 메 마른 외과 집게와 히드로 마이크로 열에서 astrocytic 번들을 추출 합니다.
  5. 집게와 astrocytic 번들을 들고, PLL 코팅 coverslip에 탑재 합니다. 수정 하 고 아래 프로토콜 얼룩.

5. 생체 외에서 연구 Immunocytochemistry

참고:이 연구를 위해 1 차 항 체 했다 토끼 안티 glial 산 성 fibrillary 단백질 (GFAP) (1: 500), 안티-β-tubulin III (1: 500) 마우스, 나 (1: 500), 마우스 안티 nestin (1: 200), 그리고 토끼 안티-vimentin (1: 100) 방지 콜라겐 토끼. 2 차 항 체 되었고 당나귀 반대로 마우스 568, 당나귀 안티 토끼 568, 당나귀 안티 토끼 488, 당나귀 반대로 마우스 568 (모두 1: 500). 모든 경우에, 충분 한 양의 각 솔루션 완전히 커버 마이크로 열을 추가 합니다.

  1. 화학 증기 두건 안쪽 1 x DPBS에서 4% 볼륨/볼륨 (v/v) 포름알데히드 솔루션을 준비 합니다.
    주의: 포름알데히드, 발암 성 것으로 알려져 독성 화합물 이며, 별도 용기에 폐기 해야 합니다. 항상 화학 증기 두건 안쪽이 화합물을 조작 하 고 실험실 외 투, 안전 안경, 장갑 등 개인 보호 장비 (PPE)를 활용 합니다.
  2. 마이크로 열 경우 실수로 히드로 실린더를 suctioning 없이 파스퇴르 피 펫과 구조를 포함 하는 배양 접시에서 배양을 삭제 합니다. 마이크로 열 또는 탑재 된 coverslips (둘 다는 접시에 남아)를 충당 하기 위해 충분 한 포름알데히드 솔루션 추가 18-24 ° c.에 35 분 동안 품 어
  3. 고정된 마이크로 열 또는 혈 청 학적인 피 펫과 coverslips에서 4.0% 포름알데히드 용액을 추출 합니다. 신속 하 게 추가 하 고 두 번 PBS를 제거 하 고 다음 10 분 3 시간 담가 내버려 하 여 고정 된 마이크로-열 세 번 PBS 씻어.
  4. 4 %v / 준비 용 매로 NHS 솔루션을 사용 하 여 0.3 %v / v의 농도에서 비 이온 세제로 솔루션에 대 한 농도 대 한 PBS에 정상적인 말 혈 청 (NHS)를 분해.
  5. 마이크로 열 이나는 피 펫과 coverslips를 포함 하는 배양 접시에서 PBS를 제거 합니다. 마이크로-열/coverslips 세포를 permeabilize를 18-24 ° C에서 60 분을 충당 하기 위해 충분 한 0.3% 세제 솔루션을 추가 합니다.
  6. 꺼내 세제 솔루션, 그리고 린스 신속 하 게 두 번 PBS와 3 시간 5 분 4 %NHS 필요한 볼륨 및 주 항 체의 각 계산에 몸을 담글 하 여 원하는 항 체 농도와 솔루션을 준비 하.
  7. 배양 접시에서 PBS를 제거 하 고 충분 한 1 차적인 항 체를 추가 (4%에 희석 NHS DPBS) 마이크로 열 또는 추출 된 astrocytic 번들 커버 솔루션. 품 어 4 ° c.에 하룻밤 (12-16 h)
  8. 1 차적인 항 체 솔루션을 꺼내와 PBS와 3 시간 5 분 동안 몸을 담글 하 여 신속 하 게 두 번을 씻어. 1: 500의 희석에 4.0% 보 건국 솔루션에 있는 각 항 체와 함께 어둠 속에서 이차 항 체 솔루션을 준비 합니다.
  9. 2 h 18-24 ° c.에 대 한 2 차 항 체 솔루션에 포함 된 셀을 품 어 외피의 전체 시간에 걸쳐 접시 알루미늄 호 일로 빛에 노출을 피하기 위해 마이크로 열을 포함 하는 커버.
  10. 이차 항 체 솔루션을 제거 하 고 핵 얼룩을 18-24 ° C에서 10 분 동안 Hoechst 솔루션 (1:10, 000)를 추가 합니다.
    주의: Hoechst 발암 물질로 처리 해야 하는 알려진된 등재 이다. 따라서, 그것은 별도 용기에 폐기 해야 하 고 보호구를 사용 해야 항상이 에이전트를 조작 하는 경우.
  11. 5 배, 각 시간 5-10 분 후 PBS로 헹 구 십시오, PBS와 알루미늄 호 일 덮개에 4 ° C에서 스테인드 마이크로 열을 저장 합니다. 탑재 된 astrocytic 번들의 경우 번들에 수성 장착 매체의 한 방울을 추가 하 고는 고정된 번들에 놓고 다른 유리 coverslip 인감 장기 보관 및 후속 이미징에 대 한 매니큐어와 두 coverslips.

6. 생존 분석 결과 라이브-죽은 (Calcein-오전/브로민 Homodimer) 얼룩

  1. 1 x DPBS의 10 mL를 5 μ calcein 오전 무수 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) (4 mM) 및 20 μ 브로민 homodimer-1 (EthD-1) (2 mM DMSO/H2O 1:4 v/v)을 추가 하 여 시 약 솔루션을 준비 합니다. 커버 알루미늄 호 일로 솔루션 또는 빛에서 그것을 보호 하기 위해 어둠 속에서 저장.
  2. 파스퇴르 피 펫과 도금된 마이크로 열을 포함 하는 배양 접시에서 미디어를 발음 하 고 충분 한 솔루션 (준비 위) 구문을 커버를 추가 합니다. 37 ° C, 5% CO2, 유지 빛 으로부터 솔루션을 보호 하기 위해 적용 하는 페 트리 접시에서 30 분 동안 품 어.
  3. Micropipette 또는 파스퇴르 피 펫 솔루션을 제거 합니다. 단계 5.3에서에서 설명한 DPBS 2-3 회 린스 합니다. 접시의 크기에 따라 DPBS와 페 트리 접시를 홍수. 이미지 셀 즉시 이후에 사용 하 여 epifluorescence 또는 confocal 영상.
    참고: 변환 metabolically 활성 셀에 의해 calcein에 막 침투성 calcein 오전의 calcein의 녹색 형광을 생성합니다. 죽은 세포 막 손상 셀, 셀 및 빨간색 형광을 일으키는 핵 산 바인딩 EthD-1의 입국을 허용 하는 표시 됩니다.

결과

처음에, 단계 대조 현미경 검사 법 사이토 접착 및 번들 형성의 진행과 시간의 함수로 cytoarchitecture의 전반적인 안정성을 모니터링 하는 데 사용 되었다. 도금 후 1 시간에서 이다 둥근 형태 (그림 2A)와 마이크로 열의 루멘을 통해 발견 되었다. 5 h 이다 시작 프로세스를 확장 하 고 8 h 여 계약 셀 완전 한 프로세스 베어링 형태를 전시 케이블 마이크로 ?...

토론

PNS 더 지원 환경에 비해, CNS neurotrauma 및 neurodegeneration의 해로운 결과 처리에 특히 제한 됩니다. 포유류 CNS에 심각한 모욕 후 glial 흉터 형성, 분열된 반응 이다 축 삭 발전이 억제 proteoglycans14분 비의 조밀한 meshwork에 둘러싸인 거리 및 염증 세포의 핵심 구성. 이 흉터는 축 삭 엔딩12의 재생에 대 한 물리적 및 생화학 방해 역할을 합니다. 또한, 성인 포유류 CNS 복원 ...

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

재정 지원 건강의 국가 학회 [U01-NS094340 (컬) & F31-NS090746 (Katiyar)], 마이클 제이 폭스 재단 [치료 파이프라인 프로그램 #9998 (컬)], 펜 의학 신경 과학 센터 조종사 상 (컬 린)에 의해 제공 되었다 국립 과학 재단 [대학원 연구 장학 DGE-1321851 (Struzyna)], 재향 군인의 부서 담당 [RR & D 장점 검토 #B1097-난 (컬)], 미국 육군 의료 연구 및 물자 명령 [#W81XWH-13-207004 (컬) & W81XWH-15-1-0466 (컬)].

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Acupuncture needle (300 µm diameter)Lhasa MedicalHS.30x40The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dishFisher08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)Invitrogen14200075
Polystyrene disposable serological pipetFisher13-678-11D
AgaroseSigmaA9539-50G
Microliter glass capillary tube (701 µm)Fisher21-170JThe diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Microcap bulb dispenserFisher21-170JBulb comes with the microcap tubes.
Hot plateFisherSP88857200
Magnetic barFisher1451352
MicropipetteSigmaZ683884-1EA
25 mm gauge needleFisher14-826-49
MicroscalpelRoboz SurgicalRS-6270
ScissorsFine Science Tools14081-09
ForcepsWorld Precision Instruments501985
Hot bead sterilizerSigmaZ378550-1EA
StereoscopeNikonSMZ800N
Micro-spatulaFisherS50821
Rat tail type I collagenCorning354236Maintain at 4 ºC and remove only when needed. Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tubeFisher02-681-256
Sodium hydroxide (NaOH)FisherSS2661
Hydrochloric acid (HCl)FisherSA48-1
Litmus paperFisher09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS)Invitrogen14170112Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTAInvitrogen25200056Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (Dnase) ISigma10104159001Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with Ham's F-12 Nutrient MixtureGibco11330-032Store at 4 ºC.
Fetal bovine serum (FBS)Atlanta BiologicalsS11195Store at -20ºC.
Postnatal day 0 or day 1 Sprague Dawley rat pupsCharles RiverStrain 001
Neurobasal embryonic neuron basal mediumInvitrogen21103049Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 serum free supplementInvitrogen12587010Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamineInvitrogen35050061Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
G5 astrocytic supplementInvitrogen17503012
Sprague Dawley embryonic day 18 ratsCharles RiverStrain 001
Pasteur pipetteFisher22-042816
15 mL centrifuge tubeEMESCO1194-352099
VortexFisher02-215-414
CentrifugeFisher05-413-115
HemocytometerFisher02-671-6
IncubatorFisher13 998 076
Formaldehyde 40%FisherF77P-4Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.
Glass cover slipFisher12-548-5M
Nail polishElectron Microscopy Sciences (EMS)72180
Fluoromont mounting mediumSouthern Biotech0100-01
Poly-L-lysineSigmaP4707
Phosphate buffered salineFisherBP3994
Triton X-100SigmaT8787
Normal horse serumGibco16050-122
Rabbit anti-glial acidic fibrillary protein (GFAP) primary antibodyMilliporeAB5804Store at -20ºC.
Mouse anti-beta-tubulin III primary antibodySigmaT8578Store at -20ºC.
Rabbit anti-collagen I primary antibodyAbcamab34710Store at -20ºC.
Rabbit anti-vimentinMilliporeAB3400Store at -20ºC.
Mouse anti-nestinMilliporeAB5326Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibodyInvitrogenA10037Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 568 secondary antibodyInvitrogenA10042Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibodyInvitrogenA21206Store at 4ºC.
Hoechst 33342, TrihydrochlorideInvitrogenH3570Store at 4ºC. Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen. Therefore, it must be disposed of in a separate container.
Calcein AMSigmaC13594 mM in anhydrous DMSO
Ethidium homodimer-1Life TechnologiesE11692 mM in DMSO/H2O 1:4 (v/v)
Dimethyl sulfoxane (DMSO)Sigma276855
A1RSI Laser Scanning Confocal MicroscopeNikon--------------Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S MicroscopeNikon--------------Used for taking the phase-contrast images. With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).

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