Engenharia de Tecido Tridimensional de Redes de Astrócitos Alinhadas para Recapitular Mecanismos de Desenvolvimento e Facilitar a Regeneração do Sistema Nervoso

Resumo

Vamos mostrar o desenvolvimento de feixes Self montados, tridimensionais do somata hamartomas alinhado longitudinalmente e processos dentro de um invólucro de biomaterial romance. Estas engenharia "vida andaimes", exibindo o diâmetro do mícron-escala ainda estendendo centímetros de comprimento, pode servir como teste-camas para estudar os mecanismos do desenvolvimento neurológico ou facilitar Epilepsias pelo diretor de migração neuronal e/ou axonal Pathfinding.

Resumo

NEUROTRAUMA e neurodegenerativas doença muitas vezes resultam em duração déficits neurológicos devido à capacidade limitada do sistema nervoso central (SNC) a substituir neurônios perdidos e regeneração axonal caminhos. No entanto, durante o desenvolvimento do sistema nervoso, migração neuronal e axonal extensão ocorrem frequentemente ao longo dos caminhos formados por outras células, conhecido como "andaimes de viver". Buscando para emular esses mecanismos e para a concepção de uma estratégia que contorna o ambiente inibitório do SNC, este manuscrito apresenta um protocolo para fabricar a engenharia de tecidos astrocyte-baseado "andaimes de viver". Para criar essas construções, utilizamos um esquema de invólucro romance biomaterial para induzir astrócitos de auto-montagem em feixes tridimensionais densas de bipolar somata alinhado longitudinalmente e processos. Primeiro, oco hidrogel microcolunas foram montados, e o lúmen interno foi revestido com colágeno-matriz extracelular. Astrócitos corticais cerebrais dissociados então foram entregues no lúmen da microcoluna cilíndrica e, com um diâmetro interno crítico de < 350 µm, espontaneamente Self-alinhado e contratada para produzir cabos de fibra-like longas que consiste de feixes densos dos processos de astrocyte e fibrilas de colágeno medindo < 150 µm em diâmetro ainda estender a vários centímetros de comprimento. Estas engenharia vivos andaimes exibidas > 97% de viabilidade celular e foram quase exclusivamente composta de astrócitos, expressando uma combinação de filamento intermediário proteínas glial fibrilar ácida proteína (GFAP), vimentina e nestin. Estas alinhadas astrocyte redes foram encontradas para fornecer um substrato permissivo para fixação neuronal e alinhado à extensão do axônio. Além disso, essas construções mantenham integridade e alinhamento quando extraído o invólucro de hidrogel, tornando-os adequados para implantação do CNS. Essas construções pré-formadas estruturalmente emulam chave cytoarchitectural elementos de ocorrência natural gliais com base em "vivendo andaimes" em vivo. Como tal, estes andaimes de vida projetada podem servir como teste-camas para estudar desenvolvimento neurológico mecanismos em vitro ou facilitar Epilepsias direcionando a migração neuronal e/ou axonal pathfinding degeneração CNS in vivo a seguir .

Introdução

Sistema nervoso central (SNC) tem uma capacidade limitada para compensar a perda e/ou disfunção dos neurônios e vias axonal que acompanham as condições tais como traumatismo crânio-encefálico (TCE), derrame, medular lesão (SCI) e neurodegenerativas doença^{1 ,2,3,4,5}. Neurogênese no SNC é restrito a um número limitado de áreas no cérebro, impedindo a restauração de neurônios perdidos^6,7. Além disso, a regeneração das vias axonal perdidas no SNC é insuficiente devido a falta de orientação dirigida, a presença de inibidores de consequência natural e astrogliosis reativa após danos ao tecido neural^{2,8, 9,10}. Astrócitos normalmente têm diversas funções na assistência neurônios com homeostase iónica, liberação de neurotransmissores, formação de sinapse e neurovasculares acoplamento¹¹. No entanto, seguindo até leve dano ao tecido neural, astrócitos podem sofrer mudanças moleculares, estruturais e funcionais como eles transição para um estado hipertrófica¹¹. Em resposta à severa neurotrauma, estas mudanças resultam na formação de uma cicatriz com uma penumbra contendo migrando astrócitos reativos e um núcleo de lesão que inclui leucócitos vazados da ruptura barreira hemato - encefálica (BBB), microglia, oligodendrócitos e fibroblastos^11,12,13. Estes astrócitos reativos atingir uma morfologia de processos filamentosos, desorganizados e exibem expressão aumentada de proteínas de filamento intermediário e proteoglicanos de sulfato de condroitina (CSPGs), que impedem a regeneração neural¹². Mesmo que a cicatriz glial inicialmente ajuda a restaurar a integridade BBB e evitar a transmissão da resposta inflamatória ao tecido saudável circundante, serve como uma barreira física e bioquímica contra axônio regeneração^{12,14 ,15,16}. Por exemplo, axônios que encontrar a cicatriz glial exibir cones de crescimento distrófica bulbosa e atrofiado crescimento¹². Além disso, a desorganização dos processos hamartomas após lesão impede a extensão de regeneração de axônios¹⁷. O resultado destas características inibitório manifesta-se nas deficiências permanentes muitas vezes físicas e neurológicas que os pacientes sofrem após grave neurotrauma, incluindo TBI e Sci.

Independentemente dos extrínsecos desafios funcional regeneração no SNC, axônios demonstraram possuir uma capacidade intrínseca de se regenerar. Por exemplo, a natureza dinâmica dos cones distrófica crescimento em contato com a cicatriz glial sugere que estes finais mantém sua capacidade de estender¹². Por conseguinte, acredita-se que um obstáculo principal para a re-crescimento axonal é o ambiente inibitório do CNS pós-lesão e que fornecendo um ambiente mais permissivo via redução de cicatrizes e/ou fornecendo regenerativas pontes sobre a cicatriz seria gliais vantajoso. De fato, estudos anteriores demonstraram que os neurônios do CNS eram capazes de estender axônios através de uma lesão utilizando enxertos de nervo periférico como pontes, que apresentam um ambiente mais favorável para o axônio regeneração^{12,18, 19}. Seguiram-se diversas outras estratégias para explorar essa capacidade regenerativa vestigial. Por exemplo, manipulação de vias de sinalização celular crescimento em vários modelos de lesão resultou na regeneração axonal e cicatriz glial redução^10,20,21. Além disso, estudos têm mostrado que o tratamento com chondroitinase ABC, que fende a maioria das cadeias de açúcar em CSPGs, diminui o efeito inibitório de CSPGs secretada por astrócitos reativos²². Apesar de encorajador resultados, essas abordagens não fornecem dirigido a orientação dos cones de crescimento, que pode potencialmente resultar em regeneração aberrante¹²e também não conta para a perda de neurônios. Abordagens baseadas em célula têm sido utilizadas em tentativas de ultrapassar os efeitos da cicatriz glial e para repor as células perdidas, particularmente os neurônios. Alguns grupos têm os astrócitos reativos em neurônios, enquanto outros transplantamos células progenitoras neurais em lesões de CNS para repovoar a área de lesão e promover o axônio regeneração^{23,24, 25}. no entanto, transplante de células-tronco sozinho é limitado por taxas de sobrevivência baixa integração pobre e modesta de retenção no tecido danificado⁵. Além disso, estas estratégias baseadas em células não restaurar a longa distância axonal panfletos, especialmente em uma maneira controlada. Portanto, biomateriais em combinação com outras abordagens estão sendo exploradas como veículos de entrega para vários neural e fatores de crescimento e células progenitoras²⁶. Abordagens baseadas em biomaterial apresentam um alto grau de controle de projeto para produzir construções que imitam o haptotaxic físico, específico, e sinais quimiotáxicas presente no microambiente (3D) tridimensional do destino anfitrião tecido^{27, 28,29,30,31,32,33,34}. Reprodução desses sinais ambientais é de suma importância para células transplantadas apresentar morfologia como de um nativo, proliferação, migração e sinalização, entre outras características neurobiológicas²⁹. Apesar dessas propriedades vantajosas, avanço além da tradicional célula semeada biomaterial andaimes é necessário para substituir neurônios perdidos e promover a regeneração axonal longa distância dirigida simultaneamente.

Uma promissora abordagem alternativa baseia-se no tecido neural engenharia "andaimes vivos", que são distintos de outras abordagens baseadas em célula devido à presença de células neurais vivas com um cytoarchitecture pré-formadas que emula neuroanatomia nativa e/ou mecanismos do desenvolvimento para facilitar a substituição do alvo, reconstrução e regeneração dos circuitos neurais^4,35. Considerações para o projeto de vida andaimes incluem os fenótipos e fontes de células neurais, bem como as propriedades mecânicas e/ou físicas e os sinais bioquímicos ditaram pela composição de qualquer acompanhamento de biomateriais³⁵. Após a fabricação em vitro, estes andaimes vivos podem ser implantado no vivo de moléculas de adesão celular presente e Quimiotáticos e neurotrophic sinaliza para regular ativamente a migração de células nervosas e consequência natural do axônio dependendo do estado e progressão dos processos regenerativos³⁵. Células gliais podem servir como base para a cytoarchitecture engenharia de andaimes de vida, desde que estas células mediam diversos mecanismos do desenvolvimento na vivo. Durante o desenvolvimento do cérebro, os neurônios novos dependem de processos basais prorrogados pela glia radial da zona ventricular para a placa de desenvolvimento cortical como andaimes vivos para migração dirigida^36,37. Além disso, estendendo o crescimento cones são mostrada para orientar-se por sensoriamento de sinais atraentes e repelentes eliciados células gliais guidepost, and so-called "pioneiro" axônios são sugeridos para alcançar as metas corretas, estendendo-se ao longo de pre-modelado gliais moldes de^38,35,39. Assim, as células gliais são necessárias para a orientação do pioneirismo de axônios, que mais tarde servem como baseado no axônio "andaimes de vida" para direcionar a projeção de axônios "seguidor". Além disso, mecanismos de crescimento mediada por glia foram mostrados para persistir pós-natal, como neuroblastos seguem o fluxo migratório rostral (RMS) para navegar na zona subventricular (SVZ), uma das poucas áreas remanescentes da neurogênese no cérebro adulto, para o bulbo olfatório (OB)⁴⁰. Estes neuroblastos em RMS migram dentro do tubo glia (figura 1A-1), que é composto por processos hamartomas alinhados longitudinalmente, através de aderências direta célula-célula e localizadas fatores solúveis^{37, 41}. por fim, enquanto danos CNS em causas de mamíferos interrompeu arranjo hamartomas processo formando uma cicatriz glial que impede fisicamente a regeneração axonal¹⁷, muitos sistemas não-mamíferos faltam a formação de uma cicatriz glial prejudicial. Em vez disso, as células gliais de espécies não-mamíferos mantenham mais organizado, alinhados a padrões que são usados como guias através da região lesada^17,42,43. Por exemplo, em modelos de não-mamíferos SCI, axônios são mostrados para crescer em estreita associação com gliais pontes cruzando a lesão, sugerindo um papel importante para andaimes gliais organizados como substratos, facilitando a regeneração axonal e recuperação funcional ( Figura 1A -2) ^{42 , 44 , 45}. recapitulação das características neuroanatômica e os mecanismos do desenvolvimento/regenerativa descritos acima pode produzir uma nova classe de engenharia baseada em gliais vivos andaimes que simultaneamente pode conduzir a migração neuronal imatura e axonal Pathfinding através de ambientes caso contrário não-permissivo, assim, potencialmente, mitigação dos efeitos da neuronal e degeneração do trato de axônio associado com lesão do CNS e doença.

Nosso grupo de pesquisa anteriormente desenvolveu vários tipos de andaimes de vida para a reconstrução e regeneração dos tracts axonal no SNC e o sistema nervoso periférico (SNP) através de microtecido projetado redes neurais (micro-TNS) e tecido enxertos de nervo engenharia (TENGs), respectivamente,^27,46,,^47,48. Ambas as estratégias são inerentemente baseia biomimetismo. Micro-TNS são estruturas anatomicamente inspirada projetadas estruturalmente e funcionalmente substituir axonal folhetos conectando distintas populações neuronais do cérebro. TENGs explorar o mecanismo de desenvolvimento da regeneração axonal axônio-facilitada, exemplificado pelo crescimento do axônio "seguidor" ao longo de axônios "pioneiro", para alcançar o hospedeiro alvo regeneração axonal^35,46,48. Nós recentemente capitalizou a versatilidade do andaime a vida técnica usando um esquema similar do encastoamento como micro-TNS e buscando inspiração os mecanismos baseados em glia de presentes durante todo o desenvolvimento. Aqui, nós desenvolvemos construções consistindo de feixes hamartomas alinhados, abrangendo o lúmen colágenas de um hidrogel microcoluna⁴⁹. Estes andaimes hamartomas vivos são desenvolvidos pelo primeiro preencher um conjunto de agulha de acupuntura-tubo capilar com líquido agarose para criar um hidrogel cilíndrico oco com um diâmetro externo (OD) e o diâmetro interno (ID) correspondente para os diâmetros do tubo e agulha, respectivamente. Na sequência de gelificação de agarose e extração de hidrogel microcoluna do tubo capilar, o interior oco é revestido com tipo eu colágeno para fornecer um ambiente permissivo para a adesão de astrocyte e alinhado à formação de feixe (figura 1B -1). Depois, o lúmen é semeado com astrócitos corticais cerebrais, isolados de filhotes pós-natal (figura 1B-2). Contrariamente ao bidimensional (2D) alinhamento as técnicas que dependem da aplicação de campos elétricos, micropatterned grooves e matriz extracelular da proteína (ECM), padronização, alinhamento astrocyte no cadafalso vivos técnica depende de auto-montagem de acordo com variáveis controláveis como colágeno concentração^50,,^51,52, densidade celular e curvatura do substrato (coluna ID). Os astrócitos contraem e remodelam o colágeno e adquirem uma morfologia bipolar, alinhado longitudinalmente análoga para os andaimes naturais observados na vivo (figura 1B-3). Com efeito, estamos ativamente perseguindo o uso destas estruturas de cabo, como como substratos físicos para orientação alvo da migração de neurônios imaturos, bem como facilitar a regeneração axonal através do ambiente desfavorável do SNC danificado, particularmente a cicatriz glial mamíferos (Figura 1). Este artigo irá apresentar o método de fabricação detalhada para as microcolunas hamartomas, contraste e imunofluorescência imagens de cytoarchitecture o esperado e uma discussão abrangente sobre as limitações atuais e futuras direções da fase a técnica.

Figura 1: inspiração, protocolo de fabricação e aplicações propostas para as redes de hamartomas alinhadas. (A) neurobiológicos inspiração: neuroblastos (1), originários da zona subventricular neurogênica (SVZ) utilizam o tubo glia alinhado longitudinalmente do fluxo migratório rostral (RMS) para migração dirigida para o bulbo olfatório (OB); (2) não-mamíferos, como os anfíbios e peixes podem sustentar a regeneração após dano no tecido neural em parte devido à formação de uma ponte glia que conecta as extremidades de uma lesão (por exemplo, medula espinhal necrosante) e serve como um andaime para a orientação de regeneração de axônios. (B) visão geral de fabricação: (1) a construção de uma hidrogel de micro-empresas, oco microcoluna com o lúmen revestido com ECM, (2) semeadura do primários astrócitos corticais isolados de filhotes pós-natal, (3) auto-montagem do longitudinalmente orientada pacotes em cultura e (4) extraído do pacote o invólucro de biomaterial para estudos futuros de implantação. (C) na vivo aplicações: (1) estes andaimes de vida podem servir como tubos gliais projetados para a migração de neurônio dirigido de centros neurogênicos repovoar regiões do neurônio-deficiente; (2) recapitulação o mecanismo do desenvolvimento de pioneirismo orientação do axônio e o mecanismo regenerativo das pontes gliais de não-mamíferos pode dotar estes andaimes hamartomas com a capacidade de direcionar a regeneração do axônio através do não-permissivo ambiente da cicatriz glial mamífera. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso de comissões na Universidade da Pensilvânia e o Michael J. Crescenz veteranos assuntos Medical Center e aderiu às diretrizes estabelecidas na política de serviço de saúde pública de NIH em humanos Cuidado e uso de animais de laboratório (2015).

1. desenvolvimento de Agarose Hydrogel Microcolunas

1. Fazer uma solução de peso/volume (p/v) de 3% de agarose pesando 3 g de agarose e transferindo-o para um copo esterilizado contendo 100 mL de solução salina de tampão fosfato de Dulbecco (DPBS). Adicionar uma barra magnética estéril para o copo e coloque-o sobre a superfície de uma placa quente/agitador. Mantenha o béquer coberto para evitar a evaporação de seu conteúdo na próxima etapa.
2. Aqueça a agarose e DPBS a uma temperatura de 100 ° C e agitar em 60-120 rpm. Ajustar essas configurações conforme necessário e constantemente monitorar a progressão do processo de dissolução, enquanto a solução muda inicialmente de opaco para uma clara aparência que significa que a agarose foi completamente dissolvido.
   Atenção: O copo quente e a solução estão quentes!
3. Como a solução de agarose é aquecida e agitada, recuperar quatro pratos de Petri vazia 10cm e adicionar 20 mL de DPBS para dois deles. Coloque as agulhas de acupuntura (diâmetro: 300 µm, comprimento: 40 mm), microlitro tubos capilares de vidro (diâmetro: 701,04 µm, comprimento: 65 mm, capacidade: 25,0 µ l) e um dispensador de bulbo dentro do armário de biossegurança. Quando a solução de agarose líquido limpa, manter constante aquecimento a aproximadamente 50 ° C e mexendo para evitar gelificação da agarose.
4. Introduza uma agulha de acupuntura na abertura inferior de um dispensador de bulbo. Inserir um tubo capilar sobre a agulha exposta para o exterior. Fixe o tubo capilar, inserindo parte para a seção de borracha do cilindro ampola dispensador.
5. Transferir 1 mL de líquido agarose com uma micropipeta para a superfície de uma placa de Petri vazia e coloque uma extremidade do tubo capilar verticalmente (com a agulha inserida) em contacto com a agarose, enquanto a tampa de borracha do distribuidor bulbo está sendo comprimida para dentro. Libere lentamente a pressão na tampa do distribuidor do bulbo desenhar agarose no tubo capilar.
   Nota: A transferência de agarose líquido para os tubos capilares deve ser realizada rapidamente. Se o líquido agarose é deixado para esfriar sobre a superfície do prato de Petri por tempo suficiente (aproximadamente 60 s), que começa ao gel, evitando a sucção adequada do agarose ao longo do tubo capilar.
6. Lugar de cada conjunto de bulbo-tubo-agulha em uma enciclopédia de Petri e deixar o agarose gel dentro dos tubos capilares solidificar por 5 min. puxe cuidadosamente o tubo capilar com as mãos para fora da rolha de borracha no cilindro ampola dispensador, deixando a agulha e o gel de agarose no lugar dentro do tubo.
7. Extrair manualmente a agulha de acupuntura, puxando-o lentamente fora do tubo capilar; o cilindro de agarose recém solidificado também desliza para fora do tubo neste procedimento, ainda em torno da agulha. Nudge delicadamente a microcoluna ao longo da agulha de acupuntura com a ponta da pinça estéril para movê-lo até o fim. Coloque a agulha sobre um prato de Petri contendo DPBS aberto e empurrar a microcoluna para o DPBS com fórceps.
   Nota: Se a agarose microcoluna mantém-se dentro do tubo capilar de vidro, depois de retirar a agulha de acupuntura, empurre lentamente a agarose microcoluna do tubo capilar com uma agulha de calibre 25 mm e para o prato com DPBS.
8. Esterilize microscalpels ou pinça usando um esterilizador de grânulo quente. Fazer 4% w/v agarose por pesagem 4G de agarose e transferi-lo para 100 mL de DPBS. Aquecer e agitar como explicado no passo 1.2 para obter uma solução clara de agarose líquida de 4%. Manter o aquecimento e agitação da solução durante as etapas a seguir.
9. Transferir os pratos de Petri contendo as microcolunas para uma capa de dissecação e mover uma microcoluna com pinça fina para um prato de Petri vazia. Utilize o estereoscópio para orientação visual e um microscalpel para cortar as microcolunas até o comprimento desejado. Guarnição ambas as extremidades para termina de forma chanfrada em 45^ó ângulos de horizontal para facilitar a manipulação das microcolunas durante a adição de ECM e celular.
10. Repita o anterior passo para três mais microcolunas no mesmo prato de Petri e alinhe as quatro construções em paralelo com uma separação de < 3 mm entre cada um dos cilindros. Carregar 50 µ l de solução de agarose 4% com uma micropipeta e despeje uma raia/linha de líquido sobre a matriz de microcoluna para conectar e agrupar as construções em grupos de quatro (doravante chamado "microcoluna barcos"). Evite o movimento de agarose de 4% para as extremidades das microcolunas, que podem entupir o interior, minimizando a distância entre as construções e adicionando o agarose rapidamente em uma linha fina.
    Nota: Organizando grupos de quatro microcolunas em "barcos" não é necessário para fabricar os andaimes hamartomas. No entanto, os barcos servem para acelerar o processo de fabricação e oferecer uma maneira mais segura de se mover e manipular microcolunas em etapas posteriores.
11. Deixe arrefecer o barco microcoluna para 1-2 min permitir a gelificação da agarose adicional de 4%. Pegar o barco de microcoluna com pinça fina pelo ligação agarose de 4% e mover as microcolunas para de outros que contenham DPBS Petri preparadas na etapa 1.1.3. Fabrica mais barcos com os microcolunas restantes conforme desejado.
12. Mova os pratos de Petri contendo o microcolunas e/ou barcos para um armário de biossegurança e esterilizar com exposição aos raios ultravioleta (UV) por 30 min.
    Cuidado: Use proteção adequada para evitar a exposição aos raios UV.
13. Armazenar os pratos com os barcos de microcoluna em DPBS a 4 ° C, se a adição de ECM e chapeamento de célula não ocorrerá imediatamente depois disso, até 1 semana. Repita as etapas de fabricação de microcoluna se as construções não são usadas durante este período de tempo.

2. a célula primária cultura e isolamento

1. Isolamento de astrocyte cortical de filhotes
   1. Em preparação para as próximas etapas, adicione 20 mL de Hank está equilibrada (HBSS) solução de sal de quatro pratos de Petri de 10 cm que irá servir como reservatórios para os tecidos dissecados. Manter todos os pratos no gelo. Esterilize a tesoura cirúrgica limpa, fórceps, microespátula e microbisturis num esterilizador quente do grânulo.
   2. Escaldar a tripsina 0,25% com ácido de 1 mM ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e desoxirribonuclease 0,15 mg/mL (DNase) I em HBSS a 37 ° C. Além disso, escaldar o meio de cultura astrocyte a 37 ° C, que consiste de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) com a mistura de nutrientes do Ham F-12 e 10% de soro fetal bovino (FBS).
   3. ANESTHETIZE pós-Natal dia 0 ou filhotes de ratos Sprague-Dawley dia 1, expondo-os às condições hipotérmicas e eutanásia por decapitação. Pino da cabeça num palco usando um 19 mm bitola agulha colocada no focinho à frente dos olhos.
   4. Fazer uma incisão com um bisturi no meio posterior para anterior, da base do pescoço até atrás dos olhos. Realize uma outra incisão passando lateralmente de diretamente atrás dos olhos para baixo, formando um T. Use pinça fina para retirar o pele craniano/crânio para o lado.
   5. Segure a cabeça pelo focinho (para cima), colocando um pino da pinça na boca do animal e a outra na face externa. Remover o cérebro com um microespátula estéril e colocá-lo em um dos pratos Petri preenchida com HBSS refrigerados. Lugar este prato de Petri no gelo imediatamente depois e em todas as vezes exceto quando em uso.
   6. Situa um bloco de granito previamente armazenado a-20 ° C abaixo de um estereoscópio dentro de uma capa de dissecação. Coloque a placa de Petri com o tecido cerebral na superfície do bloco de granito para preservar sua baixa temperatura durante o processo de dissecação. Use o estereoscópio como orientação visual durante as etapas a seguir.
   7. Se os bulbos olfatórios permanecem intactos, extraí-los cortando com fórceps ou microscalpels. Além disso, use um microscalpel para remover o cerebelo e tornar-se uma incisão mediana, separando os dois hemisférios cerebrais. Transferi os hemisférios com fórceps para uma placa de Petri contendo HBSS frescos, refrigerados.
   8. Disse as estruturas do mesencéfalo de dentro dos hemisférios com um microscalpel para obter apenas os córtices separados. Use a pinça fina Descole as meninges, uma estrutura de folha, no tecido cortical e transferir os córtices isolados para uma nova placa de Petri com HBSS frio. Use o microscalpel para picar o tecido a fim de aumentar a área de superfície para a ação da tripsina na próxima etapa.
   9. Use uma pipeta Pasteur para transferir os córtices para um tubo de centrífuga de 15 mL contendo 4 mL de escaldadas do trypsin-EDTA (8 córtices em cada tubo). Expor o tecido cortical do trypsin-EDTA por 5-7 min a 37 ° C.
   10. Com uma pipeta Pasteur, cuidadosamente remova do trypsin-EDTA e adicione 400 µ l de 0,15 mg/mL DNAse eu solução no tubo de centrífuga. Agite o tubo ou vórtice até que todo o tecido é dissociado e existem pedaços tecido restante no líquido. Se não é possível dissolver completamente o tecido, remova os fragmentos restantes com a ponta de uma pipeta Pasteur.
   11. Centrifugar o tubo contendo a solução de células dissociadas a 200 x g, durante 3 min. Retire o sobrenadante com uma pipeta Pasteur, sem perturbar as células. Adicionar 1 mL de meio de cultura de astrocyte (definido na etapa 2.1.2) para o tubo com uma micropipeta e agitar para Ressuspender e criar uma solução homogênea.
   12. Transferi 10 mL do meio de cultura astrocyte com uma pipeta sorológica para um balão de T-75. Adicione 250 µ l de 1ml célula solução (preparada na etapa 2.1.11) com uma micropipeta no balão para a placa de um cérebro de cachorro vale de células por balão. Distribuir a solução de pilha descarregada uniformemente entre o meio de cultura e agitar suavemente o frasco para promover uma distribuição uniforme.
   13. Cultura os frascos chapeados em uma incubadora umidificado a 37 ° C e 5% de CO₂. Depois de atingir 24 e 72 h em cultura, mecanicamente agite o frasco para desanexar os tipos de células não-aderentes, tais como os neurônios e oligodendrócitos.
   14. Depois disso, em cada um destes momentos, realizar uma alteração de mídia. Segure o frasco verticalmente para que os meios de cultura encontra-se no fundo do frasco, não cobrindo as células aderidas. Aspire o meio de cultura com uma pipeta Pasteur, pressionando a ponta da pipeta contra o canto inferior do frasco para evitar a extração de células. Coloque o frasco em posição horizontal original e suavemente, adicionar 10 mL de meio de astrocyte sobre as células com uma pipeta sorológica.
   15. Retorne os frascos para a incubadora após cada mudança de mídia. Depois de confluência de 90% é alcançada, mecanicamente agite o frasco mais uma vez para remover qualquer restantes células não-aderentes.
   16. Passagem os astrócitos tirando o meio de cultura com um vácuo e uma pipeta Pasteur. Adicione 5 mL de 0,25% do trypsin-EDTA com uma pipeta serológica sobre as células aderidas. Agitar suavemente o frasco para assegurar que a tripsina abrange todas as células e incubar o frasco para 5-7 min a 37 ° C e 5% de CO₂.
   17. Saciar a tripsina, adicionando 1 mL de meio de astrocyte para as células com uma pipeta sorológica. Extrair a solução de célula do balão com uma pipeta sorológica e transferi-lo para um tubo de centrífuga estéril 15 mL. Centrifugar o tubo a 200 x g, durante 3 min.
   18. Remover o sobrenadante com uma pipeta sorológica e ressuspendê-lo em 1 mL de meio de cultura astrocyte. Agite o tubo para garantir que a solução da célula é homogênea. Conte o número de células na solução com um hemocytometer ou um contador automático de células.
       Nota: Um frasco que é 90% de confluencia normalmente produz cerca de 3 milhões astrócitos.
   19. Adicione 10 mL de meio de cultura de astrocyte para um balão de T-75. Realizar uma diluição de 1:4 através da transferência de 250 µ l da solução de célula (etapa 2.1.18) com uma micropipeta para o balão de T-75 já contendo meio de cultura. Suavemente agite para garantir uma distribuição homogênea de células em toda a superfície do balão.
   20. Repita os passos 2.1.16-2.1.19 cada vez confluência de 90% é alcançada para a passagem das células.
2. Isolamento do neurônio cortical de fetos de rato
   1. Siga preparações semelhantes como etapas 2.1.1 e 2.1.2, com exceção de que a mídia escaldada é meios de cultura co, consistindo de Neurobasal médio, suplemento de B-27 2% (para os neurônios) + suplemento isento de soro de G-5 1% (para astrócitos) + 0,25% L-glutamina.
   2. Eutanásia em ratos Sprague-Dawley cronometrado-grávida embrionárias dia 18 asfixia de dióxido de carbono e confirmar a morte por decapitação.
   3. Extrair os fetos de rato e dissecar os córtices do resto do tecido cerebral em placas de Petri contendo HBSS na superfície do bloco de granito refrigerados, usando um estereoscópio para orientação visual e tesoura esterilizada, microscalpel e fórceps⁵³ . Após a dissecação sucessiva das cabeças, cérebro, hemisférios cerebrais e córtices, transferir cada tecido para um novo prato de Petri HBSS-cheia.
   4. Picar o tecido cortical em fragmentos menores para aumentar a área de superfície de tripsina. Transferência de 4-6 córtices com uma Pasteur Pipetar para um tubo com 5 mL de EDTA-tripsina escaldada e mantêm a 37 ° C para dissociar o tecido. Em 5-7 min manualmente agite o tubo para misturar e impedir a aglutinação do tecido.
   5. Retire o tubo de 37 ° C após 10 min. Como explicado anteriormente no passo 2.1, extrair o tripsina-EDTA e substituir com 1,8 mL de 0,15 mg/mL solução de DNAse. Depois, vórtice o tecido até a solução aparece homogêneo, com nenhum fragmento de tecido flutuando no líquido.
   6. Centrifugue a solução de tecido dissociado a 200 x g, durante 3 min. Depois de retirar o sobrenadante, resuspenda em 2 mL de meio de cultura co. Conte o número de células nesta solução com um hemocytometer ou um contador automático de células.
      Nota: O rendimento habitual é 3.0-5.0 x 10⁶ células/cortical hemisfério.
   7. Prepare uma nova solução de célula com uma densidade de 2,0-4,0 x 10⁵ células/mL na mídia co-cultura definida acima.

3. desenvolvimento dos hamartomas cabos dentro do Microcolunas

1. Fabricação de núcleo de ECM
   Nota: O ECM tem a ser adicionado para o interior das microcolunas de hidrogel no mesmo dia em que célula semeadura será executada.
   1. Dentro de uma armário de biossegurança, preparar um 1 mg/mL solução de rabo de rato colágeno tipo I em meio de cultura co em um tubo estéril microcentrifuga. Manter o tubo de microcentrifugadora com a solução de ECM no gelo em todos os momentos, exceto quando em uso.
   2. Transferi 1-2 µ l da solução de ECM com uma micropipeta para uma tira de papel de tornassol para estimar o seu pH. Adicione 1 µ l de 1 N de hidróxido de sódio (NaOH) ou ácido clorídrico (HCl) com uma micropipeta para aumentar ou diminuir o pH da solução de ECM, respectivamente e pipetar para cima e para baixo para homogeneizar. Verificar o pH de novo com uma tira de papel tornassol e adicionar mais ácido ou base, conforme necessário, até que o pH é estável na faixa de 7,2-7,4.
   3. Mover as caixas de Petri da etapa 1.2 para uma capa de dissecação e transferir o micro de 4-5-colunas ou um barco com pinça fina estéril para um vazio, estéril 35 ou 60 mm placa de Petri. Usando o estereoscópio para orientação, situa a ponta de 10 µ l de uma micropipeta em uma extremidade de cada microcoluna e sucção para esvaziar o lúmen de bolhas de ar e DPBS. Confirme a ausência de bolhas de ar com o estereoscópio para garantir que o ECM adicionado na próxima etapa pode fluir livremente entre o lúmen.
   4. Cobra uma micropipeta P10 com solução de ECM, lugar a 10 µ l de ponta contra uma das extremidades do hydrogel microcolunas e entregar a solução suficiente para preencher o lúmen (aproximadamente 3-5 µ l), observando a entrada do ECM com o estereoscópio. Pipete um pequeno reservatório (2-4 µ l) da solução de ECM em cada extremidade da microcoluna.
      Nota: Sempre gerir micro de 4-5-colunas ou de um barco de cada vez para evitar prolongada secagem das construções, pois isto pode resultar na amassando da estrutura microcoluna. Microcolunas completamente secas anexar firmemente à superfície dos pratos Petri, que impede a sua utilização para a propagação da célula. Quantidades excessivas de meios de cultura co (como uma medida de hidratação) não podem ser adicionadas para as microcolunas porque isso pode causar o ECM fluir para fora durante o período de incubação, descrito abaixo.
   5. Pipeta de meios de cultura co em um anel ao redor do prato de Petri para fornecer um dissipador de humidade para evitar que as colunas de secar durante a incubação. Incube a placa de Petri contendo as ECM-contendo microcolunas em 37 ° C e 5% CO₂ para 1 h promover a polimerização do colágeno antes de adicionar os neurônios e/ou astrócitos.
      Nota: O ECM deve formar uma camada de revestimento de superfície interna do lúmen do oco, ao invés de um núcleo sólido de ECM, englobando o interior, ambos os quais podem ser observados usando o estereoscópio. Se o ECM forma um núcleo, continue o período de incubação até que resta apenas a camada. Com esta camada formada, a solução de célula astrocyte pode preencher o interior da coluna-micro nas etapas de chapeamento.
   6. Durante o período de incubação, prepare a solução de célula astrocyte (conforme descrito abaixo).
2. Astrocyte e neurônio semeadura nas Microcolunas
   1. Passagem os astrócitos chapeados (entre a quarta e décima segunda passagem), conforme explicado nos passos 2.1.16-2.1.19. Depois de contar o número de células no frasco, prepare solução de célula em uma densidade de 9.0-12,0 x 10⁵ células/mL solução suspendida em meios de cultura de células.
   2. Usando um estereoscópio, coloque a ponta de uma micropipeta de P10 em uma extremidade das microcolunas e transferir a solução de célula suficiente (~ 5 µ l) no lúmen para preenchê-lo completamente. Como feito acima com o ECM, adicione pequenos reservatórios de solução de célula para ambas as extremidades de cada microcoluna.
   3. Incube as chapeado microcolunas sobre os pratos de Petri em 37 ° C e 5% CO₂ para 1 h promover a fixação de astrócitos para o ECM. Se os neurônios não serão adicionados para microcolunas, prossiga para o passo 3.2.5.
   4. Após o período de incubação inicial, adicionar 1-2 µ l da solução de neurônio cortical obtida na etapa 2.2.7 em ambas as extremidades das microcolunas com uma micropipeta, enquanto observa sob o estereoscópio. Certifique-se de que os meios suficientes está presente nos pratos para evitar a secagem e incube novamente por 40 min a 37 ° C e 5% CO₂ para permitir a adesão de neurônios.
      Nota: Solução de neurônio Cortical pode também ser adicionada 1-2 dias após a formação de feixe, realizando passo 3.2.4 após remover cuidadosamente os meios de cultura da caixa de Petri com uma micropipeta.
   5. Após a incubação período, cuidadosamente encha os pratos de Petri contendo as microcolunas chapeadas com 3 ou 6 mL de meio de cultura co para 35 ou 60 mm placas de Petri, respectivamente. Manter as microcolunas chapeadas na cultura em 37 ° C e 5% CO₂ para promover o Self-assembly dos pacotes hamartomas alinhados, que devem formar uma estrutura empacotada, cabo, como depois de 6-10 h.
3. Estabilização de arquitetura de cabo Astrocyte
   Nota: Após a formação de feixes, cerca de 6-12 h de cultivo as construções, execute as seguintes etapas para evitar o colapso da estrutura alinhada as hamartomas andaimes.
   1. Em um tubo estéril microcentrifuga, preparar um colágeno de cauda de rato de 3 mg/mL eu solução em meios de cultura co. Ajuste o pH da solução de 7,2-7,4 seguindo o procedimento descrito no passo 3.1.2. Manter a mídia de estoque e co-cultura de colágeno no gelo quando não estiver em uso e coloque a solução preparada de colágeno no gelo em todos os momentos.
   2. Remova a mídia os pratos de Petri contendo os andaimes hamartomas com uma micropipeta, deixando alguns meios de comunicação nas laterais do prato para criar um coletor de umidade que garante a hidratação das microcolunas. Coloque o prato em um estereoscópio para ajudar na visualização.
   3. Com uma micropipeta, tome 2 a 3 µ l de solução de colágeno e descarga a cada extremidade das microcolunas, usando o estereoscópio para orientação visual. Certifique-se que o prato tem meios suficientes em torno dos lados para agir como um dissipador de umidade em torno das bordas do prato. Incube as placas de Petri com as microcolunas para 30 min a 37 ° C e 5% CO₂ em uma incubadora umidificada para promover a gelificação do colágeno recém-adicionado.
   4. Lentamente, adicionar 3 ou 6 mL de meios de cultura co (para 35 ou 60 milímetros Petri pratos, respectivamente) para a Petri pratos com uma pipeta e cultura os pratos em uma incubadora umidificado no 37 ^oC e 5% de CO₂.

4. extração dos pacotes hamartomas do Hydrogel Interior

1. Esterilize em autoclave, as lamelas de vidro. Prepare um 20 µ g/mL solução de poli-L-lisina (PLL) em água de grau de cultura de células estéreis.
2. Dentro de uma armário de biossegurança, manualmente transferir as lamelas de vidro esterilizado para um estéril de Petri de 10 cm e adicionar solução PLL suficiente para abranger as lamelas.
3. Incube as lamelas, cobertas com a solução PLL, por 30 min a 37 ° C para revestir a superfície. Remova a solução PLL com uma pipeta Pasteur após 30 min. enxaguar três vezes adicionando água de grau de cultura de células para a lamela e removê-lo com uma pipeta Pasteur.
4. Após a formação do bundle glia alinhado, transferir a microcoluna delicadamente para uma placa de Petri estéril com pinça fina estéril e adicionar uma pequena piscina de 10 µ l de meios de cultura co com uma micropipeta para prevenir a desidratação e garantir a saúde de pacote. Extraia o pacote hamartomas da microcoluna hidrogel puxando suavemente de um lado com pinça cirúrgica estéril, usando um estereoscópio para orientação visual.
5. Segurando o pacote hamartomas com fórceps, montá-lo em uma lamela de PLL-revestido. Corrigir e mancha com o protocolo abaixo.

5. imunocitoquímica para estudos In Vitro

Nota: Para este estudo, os anticorpos primários foram coelho anti-glial ácida fibrilar proteína (GFAP) (1: 500), mouse anti-β-tubulina III (1: 500), coelho antieu colágeno (1: 500), mouse anti-nestin (1: 200) e o coelho antivimentina (1: 100). Os anticorpos secundários foram anti-rato 568 de burro, burro anti-coelho 568, burro anti-coelho 488 e anti-rato burro 568 (1: 500 para todos). Em todas as instâncias, adicione volume suficiente de cada solução para cobrir inteiramente as microcolunas.

1. Prepare uma solução de formol 4% volume/volume (v/v) em 1 x DPBS dentro de uma coifa de química.
   Cuidado: formaldeído é um composto tóxico conhecido por ser cancerígeno e deve ser descartado em recipiente separado. Sempre manipular este composto dentro uma coifa química e utilizar equipamento de protecção pessoal (PPE) como casaco de laboratório, óculos de segurança e luvas.
2. No caso das microcolunas, descarte os meios de cultura, desde os pratos de Petri contendo as construções com uma pipeta Pasteur sem acidentalmente a sucção dos cilindros de hidrogel. Adicionar a solução de formaldeído suficiente para cobrir as microcolunas ou as lamelas montadas (ambos os quais permanecem sobre os pratos de Petri) e incube por 35 min em 18-24 ° C.
3. Extrai a solução de formaldeído de 4,0% de microcolunas fixas ou as lamelas com uma pipeta sorológica. Enxague as microcolunas fixas três vezes com PBS rapidamente adicionando e removendo PBS duas vezes e então deixá-los mergulhar por 10 min uma terceira vez.
4. Dissolva o soro de cavalo normal (NHS) em PBS para uma concentração de 4% v / v. Prepare uma solução com detergente não-iônico em uma concentração de 0,3% v/v usando a solução de NHS como solvente.
5. Retire os pratos de Petri contendo as microcolunas ou as lamelas com uma pipeta, a PBS. Adicione a solução de detergente de 0.3% suficiente para cobrir as microcolunas / lamelas por 60 min em 18-24 ° C para permeabilize as células.
6. Retire a solução detergente e enxágue rapidamente duas vezes com PBS e três vezes por imersão durante 5 min. calcular o volume necessário de NHS 4% e cada um dos anticorpos primários para preparar uma solução com as concentrações do anticorpo desejado.
7. Retire os pratos de Petri a PBS e adicionar suficiente anticorpo primário (diluída em 4% NHS-DPBS) solução para cobrir as microcolunas ou os pacotes hamartomas extraídos. Incubar durante a noite (12-16 h), a 4 ° C.
8. Retire a solução de anticorpo primário e rapidamente lave duas vezes com PBS e três vezes por imersão durante 5 min cada. Prepare a solução de anticorpo secundário, no escuro, com cada anticorpo presente em uma diluição de 1: 500 em 4,0% solução de NHS.
9. Incubar as células com a solução de anticorpo secundário para h 2 a 18-24 ° C. Ao longo de todo o tempo de incubação, cobrir os pratos de Petri contendo as microcolunas com folha de alumínio para evitar a exposição à luz.
10. Remover a solução de anticorpo secundário e adicionar solução de Hoechst (01:10, 000) por 10 min em 18-24 ° C para manchar os núcleos.
    Cuidado: Hoechst é um conhecido agente mutagénico que deve ser tratado como uma substância cancerígena. Portanto, ele deve ser descartado de em um recipiente separado e EPI deve ser usado em todos os momentos ao manipular este agente.
11. Enxaguar com PBS cinco vezes, cada vez por 5-10 min. depois, armazenar as microcolunas manchadas a 4 ° C em PBS e cubra com papel alumínio. No caso dos feixes hamartomas montados, adicione uma gota de meio de montagem aquoso para o pacote, coloque outra lamela de vidro sobre o pacote fixo e selar as duas lamelas com esmaltes para armazenamento a longo prazo e imagens subsequentes.

6. viabilidade ensaio com Live-morto (calceína-AM/ethidium homodímero) coloração

1. Prepare a solução reagente, acrescentando 5 μl calceína AM (4 mM em anidro dimetilsulfóxido (DMSO)) e 20 μl ethidium homodímero-1 (EthD-1) (2 mM em DMSO/H₂O 1:4 v/v) de 10 mL de 1 x DPBS. Cubra a solução com papel alumínio ou guarde no escuro para protegê-lo contra a luz.
2. Aspirar a mídia a partir da placa de Petri contendo as microcolunas chapeadas com uma pipeta Pasteur e adicionar suficiente solução (preparada acima) para cobrir as construções. Incube durante 30 min a 37 ° C e 5% CO₂, mantendo o prato de Petri coberto para proteger a solução contra a luz.
3. Remova a solução com uma micropipeta ou pipeta Pasteur. Lave 2 - 3 vezes com DPBS conforme explicado na etapa 5.3. Inunde os pratos de Petri com DPBS de acordo com o tamanho do prato. Células de imagem imediatamente depois usando epifluorescência ou imagem latente confocal.
   Nota: Conversão de membrana permeável calceína AM de calceína pelas células metabolicamente ativas produz fluorescência verde de calceína. As células mortas são marcadas como células de membrana-comprometido, que permitem a entrada de EthD-1 na célula e sua ligação aos ácidos nucleicos, causando a fluorescência vermelha.

Resultados

Inicialmente, contraste de fase microscopia foi usada para monitorar a progressão da formação de aderência e pacote de astrocyte e a estabilidade geral da cytoarchitecture como uma função do tempo. A 1 h depois de chapeamento, astrócitos foram encontrados ao longo do lúmen das microcolunas com uma morfologia esférica (Figura 2A). Às 5h, astrócitos começaram a estender processos e contraindo, enquanto h 8 células exibiram uma morfologia de process...

Discussão

Quando comparado com o ambiente mais favorável do PNS, o CNS é particularmente limitado em lidar com as consequências prejudiciais de neurotrauma e neurodegeneração. Após um grave insulto ao SNC mamífero, é formada uma cicatriz glial, consistindo de um núcleo de células inflamatórias e fibróticos rodeado por uma densa malha de astrócitos reativos desorganizadas que secretam proteoglicanos inibindo a consequência natural do axônio¹⁴. Esta cicatriz atua como uma obstrução física e ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acupuncture needle (300 µm diameter)	Lhasa Medical	HS.30x40	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish	Fisher	08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)	Invitrogen	14200075
Polystyrene disposable serological pipet	Fisher	13-678-11D
Agarose	Sigma	A9539-50G
Microliter glass capillary tube (701 µm)	Fisher	21-170J	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Microcap bulb dispenser	Fisher	21-170J	Bulb comes with the microcap tubes.
Hot plate	Fisher	SP88857200
Magnetic bar	Fisher	1451352
Micropipette	Sigma	Z683884-1EA
25 mm gauge needle	Fisher	14-826-49
Microscalpel	Roboz Surgical	RS-6270
Scissors	Fine Science Tools	14081-09
Forceps	World Precision Instruments	501985
Hot bead sterilizer	Sigma	Z378550-1EA
Stereoscope	Nikon	SMZ800N
Micro-spatula	Fisher	S50821
Rat tail type I collagen	Corning	354236	Maintain at 4 ºC and remove only when needed. Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube	Fisher	02-681-256
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher	SS2661
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher	SA48-1
Litmus paper	Fisher	09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS)	Invitrogen	14170112	Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (Dnase) I	Sigma	10104159001	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with Ham's F-12 Nutrient Mixture	Gibco	11330-032	Store at 4 ºC.
Fetal bovine serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11195	Store at -20ºC.
Postnatal day 0 or day 1 Sprague Dawley rat pups	Charles River	Strain 001
Neurobasal embryonic neuron basal medium	Invitrogen	21103049	Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 serum free supplement	Invitrogen	12587010	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine	Invitrogen	35050061	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
G5 astrocytic supplement	Invitrogen	17503012
Sprague Dawley embryonic day 18 rats	Charles River	Strain 001
Pasteur pipette	Fisher	22-042816
15 mL centrifuge tube	EMESCO	1194-352099
Vortex	Fisher	02-215-414
Centrifuge	Fisher	05-413-115
Hemocytometer	Fisher	02-671-6
Incubator	Fisher	13 998 076
Formaldehyde 40%	Fisher	F77P-4	Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.
Glass cover slip	Fisher	12-548-5M
Nail polish	Electron Microscopy Sciences (EMS)	72180
Fluoromont mounting medium	Southern Biotech	0100-01
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Phosphate buffered saline	Fisher	BP3994
Triton X-100	Sigma	T8787
Normal horse serum	Gibco	16050-122
Rabbit anti-glial acidic fibrillary protein (GFAP) primary antibody	Millipore	AB5804	Store at -20ºC.
Mouse anti-beta-tubulin III primary antibody	Sigma	T8578	Store at -20ºC.
Rabbit anti-collagen I primary antibody	Abcam	ab34710	Store at -20ºC.
Rabbit anti-vimentin	Millipore	AB3400	Store at -20ºC.
Mouse anti-nestin	Millipore	AB5326	Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody	Invitrogen	A10037	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 568 secondary antibody	Invitrogen	A10042	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody	Invitrogen	A21206	Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Invitrogen	H3570	Store at 4ºC. Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen. Therefore, it must be disposed of in a separate container.
Calcein AM	Sigma	C1359	4 mM in anhydrous DMSO
Ethidium homodimer-1	Life Technologies	E1169	2 mM in DMSO/H2O 1:4 (v/v)
Dimethyl sulfoxane (DMSO)	Sigma	276855
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon	--------------	Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope	Nikon	--------------	Used for taking the phase-contrast images. With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).