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摘要

我们展示了自组装的发展, 三维束纵向排列星胞和过程内的新型生物材料装箱。这些被设计的 "活脚手架", 显示微米尺度的直径, 但长度延长厘米, 可作为试验床研究神经发育机制或促进 neuroregeneration 通过引导神经元迁移和/或轴突寻.

摘要

神经和神经退行性疾病往往导致持久的神经缺损, 由于中枢神经系统 (CNS) 的能力有限, 以取代失去的神经元和再生轴突通路。然而, 在神经系统的发育过程中, 神经元的迁移和轴突的扩展通常发生在其他细胞形成的通路上, 称为 "活支架"。为了模拟这些机制, 并设计一个绕过中枢神经系统抑制环境的策略, 本手稿提出了一种制造组织工程 astrocyte-based "活支架" 的协议。为了创建这些结构, 我们采用了一种新的生物材料装箱方案, 诱导星形胶质细胞组装成稠密的三维双极纵向排列的胞和过程的束。首先, 对中空水凝胶微柱进行了组装, 内腔表面涂有胶原细胞基质。然后将游离的大脑皮质星形胶质细胞传送到圆柱形微柱的腔内, 并在 < 350 µm 的临界内径上自发对准, 并收缩产生由稠密束组成的长纤维状电缆。星形胶质细胞的过程和胶原纤维的测量 < 150 µm 的直径, 但延长了几个厘米的长度。这些工程化的活体支架展示了 > 97% 细胞的生存能力, 实际上完全由星形胶质细胞、胶质纤维酸性蛋白、波形和巢组成。这些对齐的星形胶质细胞网络被发现为神经元附着和对突起扩展提供了一个可容许的基底。此外, 这些结构保持完整性和对齐时, 提取从水凝胶装箱, 使其适合中枢神经系统植入。这些预制结构模仿自然发生的 glial-based "活体支架"在体内的关键细胞元素。因此, 这些工程化的活体支架可以作为试验床, 用于研究神经发育机制体外或促进 neuroregeneration, 方法是引导神经元迁移和/或轴突寻继中枢神经系统变性后体内.

引言

中枢神经系统 (CNS) 的能力有限, 以抵消的损失和/或功能障碍的神经元和轴突通路, 伴随的条件, 如创伤性脑损伤 (脑外伤), 中风, 脊髓损伤 (SCI), 和神经变性疾病1 ,2,3,4,5。中枢神经系统的神经再生仅限于大脑中的有限区域, 从而阻碍了丢失神经元的恢复6,7。此外, 由于缺乏定向引导, 存在的生长抑制剂, 和反应 astrogliosis 在神经组织损伤后的中枢神经系统失去的轴突通路的再生是不够的2,8, 9,10。星形胶质细胞在帮助神经元的离子稳态、神经递质清除、突触形成和神经血管耦合方面具有不同的功能11。然而, 随着对神经组织的轻度损伤, 星形胶质细胞在转变为肥厚状态11时, 可能会发生分子、结构和功能上的变化。为了应对严重的神经, 这些变化导致形成了一个包含迁移反应性星形胶质细胞的半影和一个病变的核心, 包括从破裂的血脑屏障 (BBB), 小胶质细胞漏出的白血球,突, 和成纤维细胞11,12,13。这些反应性星形胶质细胞获得丝状的形态学, 无序的过程, 并表现出增加的表达中间丝蛋白和硫酸软骨素蛋白 (CSPGs), 这阻碍神经再生12。尽管胶质瘢痕最初有助于恢复血脑屏障的完整性, 避免对周围健康组织的炎症反应的传播, 它作为一个物理和生物化学的屏障, 反对轴突再生12,14 ,15,16。例如, 遇到胶质瘢痕的轴突显示球状不良生长锥和发育迟缓的生长12。此外, 损伤后星过程的解体阻碍了再生轴突的扩展17。这些抑制特征的结果表现在经常永久的身体和神经损伤, 病人遭受严重的神经后, 包括创伤和 SCI。

不管在中枢神经系统的功能再生面临的外在挑战, 轴突已经被证明具有内在的再生能力。例如, 与胶质瘢痕接触的不良生长锥的动态性质表明, 这些结局保留了它们扩展12的能力。因此, 人们认为, 轴突再生的主要障碍是后中枢神经系统的抑制环境, 并通过减少胶质瘢痕和/或提供跨越疤痕的再生桥来提供更宽松的环境有利.事实上, 先前的研究表明, 中枢神经系统神经元能够通过利用周围神经移植作为桥梁的病变来延长轴突, 这为轴突再生提供了一个更有利的环境12,18, 19。还采取了其他一些战略来利用这种退化的再生能力。例如, 在各种损伤模型中对细胞生长信号通路的操纵导致轴突再生和胶质瘢痕减少10,20,21。此外, 研究表明, 酶 ABC, 克里夫斯 CSPGs 的大部分糖链的治疗, 减少反应性星形胶质细胞分泌 CSPGs 的抑制作用22。尽管取得了令人鼓舞的结果, 但这些方法并没有提供对生长锥的定向指导, 这可能导致异常再生12, 也不能解释神经元的丢失。细胞方法已经被用来克服胶质瘢痕的影响, 并补充丢失的神经细胞, 特别是神经元。有些组有分化活性星形胶质细胞进入神经细胞, 而另一些则将神经祖细胞移植到中枢神经系统病变, 以重新填充损伤区并促进轴突再生23,24,25. 然而, 仅靠干细胞移植是由于存活率低、集成度差和在受损的组织中保持适度的5。此外, 这些细胞的策略无法恢复长距离轴突, 特别是以控制的方式。因此, 生物材料与其他方法的结合正在探索作为各种神经和祖细胞的运载工具和生长因子26。Biomaterial-based 的方法具有高度的设计控制, 以产生模仿特定的物理, haptotaxic, 和 chemotaxic 提示存在于目标主机组织的三维 (3D) 微环境中的构造,27, 28,29,30,31,32,33,34。这些环境信号的再现是最重要的移植细胞呈现本机样的形态学, 增殖, 迁移和信号, 在其他神经生物学特征29。尽管这些优越的性能, 超越传统的细胞种子生物材料支架的进步需要同时促进定向长距离轴突再生和取代丢失的神经元。

一个有前途的替代方法是基于神经组织工程 "活支架", 这是不同于其他细胞的方法, 由于存在的活神经细胞与预制细胞, 模拟本地神经和/或发展机制, 以促进有针对性的更换, 重建和再生神经回路4,35。生活支架设计的考虑因素包括神经细胞的表型和来源, 以及由任何伴随的生物材料的组成所决定的机械/物理特性和生物化学信号35。在制作体外后, 这些活体支架可以植入体内, 以呈现细胞黏附分子和趋和神经营养信号, 以积极调节神经细胞迁移和轴突生长, 这取决于状态和再生过程的进展35。胶质细胞可以作为生活支架工程细胞的基础, 因为这些细胞介导各种发育机制在体内。在大脑发育过程中, 新的神经元依赖于由心室区的径向胶质细胞向发育中的皮质板延伸的基底过程, 作为定向迁移的活体支架36,37。此外, 扩展生长锥被证明是自我定位, 通过传感路标细胞诱发的诱人和排斥信号, so-called "先驱" 轴突被建议通过沿 pre-patterned 神经胶质的延伸来达到正确的目标。支架35,38,39。因此, 神经胶质细胞是必要的先驱轴突的指导, 后来作为 axon-based "活支架", 以指导投影的 "追随者" 轴突。此外, 胶质细胞介导的生长机制已被证明坚持后天, 因为细胞跟随侧迁徙流 (RMS), 从脑室区 (SVZ), 在成年大脑中少数残存的神经再生领域之一, 以导航嗅球 (OB)40。这些细胞在 RMS 中迁移到胶质管内 (图 1A-1), 它由纵向排列的星过程组成, 通过直接的细胞-细胞粘连和局部可溶性因子37,41. 最后, 虽然在哺乳动物中枢神经系统损伤导致中断星过程安排形成了一个神经胶质瘢痕, 物理上阻碍轴突再生17, 许多哺乳体系缺乏形成一个有害的胶质瘢痕。相反, 哺乳种类的胶质细胞维持更有条理的、对齐的图案, 这些模式在受伤区域17、42、43中用作参考线。例如, 在哺乳的 SCI 模型中, 轴突被证明与通过病变的神经胶质桥紧密结合生长, 这表明有组织的胶质支架作为促进轴突再生和功能恢复的基质的重要作用 (图 1A-2)42,44,45. 上述神经特征和发展/再生机制的重述可能会产生一种新的工程 glial-based 活体支架, 可同时驱动未成熟的神经元迁移和轴突寻通过其他允许环境, 从而有可能减轻神经元和轴突道变性与中枢神经系统损伤和疾病相关的影响。

我们的研究小组以前曾设计过多种类型的活体支架, 可通过微组织工程化神经网络 (微 TENNs) 和组织对中枢神经系统和周围神经系统 (三七总皂苷) 的轴突重建和再生。工程神经移植 (雄姿), 分别为27,46,47,48。这两种策略都是基于仿生学的。微 TENNs 是解剖学上的启发结构设计, 以结构和功能取代轴突, 连接不同的神经元群体的大脑。雄姿利用轴突促进轴突再生的发育机制, 以 "从动杆" 轴突生长为例, 以 "先锋" 轴突为目标, 实现有针对性的主机轴突再生35,46,48。我们最近利用了生活支架技术的多功能性, 使用了类似的装箱方案作为微 TENNs, 并寻求启发从 glia-based 机制在整个发展中呈现。在这里, 我们开发的结构组成的星束跨越的胶原管的水凝胶微柱49。这些星活体支架的研制首先是用液体琼脂糖来填充毛细管针总成, 以创建一个中空的圆柱形水凝胶, 外径和内径 (ID) 对应的直径管和针分别。在琼脂糖凝胶和提取的水凝胶微柱从毛细管管, 空心内涂层与 i 型胶原蛋白, 以提供一个环境纵容星形胶质细胞粘附和排列束形成 (图 1B-1)。之后, 腔内的大脑皮质星形胶质细胞从产后大鼠幼崽中分离 (图 1B-2)。与 two-dimensional (2D) 的对准技术, 依赖于电场、micropatterned 槽和细胞外基质 (ECM) 蛋白的应用, 活支架技术中的星形胶质星对准依赖于自组装根据可控变量, 如基底曲率 (列 ID), 细胞密度, 和胶原蛋白浓度50,51,52。星形胶质细胞收缩并重塑胶原蛋白, 并获得与自然支架类似的双极性、纵向排列的形态学观察在体内(图 1B-3)。事实上, 我们正积极地使用这些类似电缆的结构作为物理基底, 用于定向迁移未成熟神经元, 以及通过受损的中枢神经系统的不利环境促进轴突再生, 特别是哺乳动物胶质瘢痕 (图 1C)。本文将介绍星微柱的详细制作方法、相衬和预期细胞的免疫荧光图像, 并对当前的局限性和今后的发展方向进行了全面的讨论。技术.

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图 1: 对齐的星网络的启发、制造协议和建议的应用程序.(A) 神经生物学灵感: (1) 来源于神经源性脑室区 (SVZ) 的细胞, 利用侧洄游流 (RMS) 中的纵向对中的胶质管向嗅球定向迁移 (OB);(2) 非哺乳动物, 如两栖动物和鱼类可以维持再生后, 神经组织损伤部分由于形成了一个胶质桥连接的两端病变 (如断脊髓), 并作为一个脚手架的指导再生轴突。(B) 制作概述: (1) 微米、空心水凝胶微柱与管腔内涂敷 ECM, (2) 生后大鼠幼崽的初生皮质星形胶质细胞的播种, (3) 自组装的纵向捆绑在文化, 和 (4) 从生物材料装箱的捆绑提取为未来的植入研究。(C)在体内应用程序: (1) 这些活体支架可作为神经源性神经中心定向神经元迁移到重新填充神经元缺陷区域的神经胶质管。(2) non-mammals 的发展机制的重述和神经胶质桥的再生机制, 可以赋予这些星支架的能力, 以引导轴突再生横跨允许哺乳动物胶质瘢痕的环境。请单击此处查看此图的较大版本.

研究方案

所有程序均经宾夕法尼亚大学动物保育和使用委员会和迈克尔 j Crescenz 退伍军人事务医疗中心批准, 并遵守 NIH 公共卫生服务政策中提出的人道实验室动物的关心和使用 (2015)。

1. 琼脂糖凝胶微柱的研制

  1. 使琼脂糖3% 重量/体积 (瓦特/v) 溶液通过重3克琼脂糖和转移到一个无菌烧杯含有100毫升的 Dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 (DPBS)。在烧杯中加入无菌磁条, 并将其放在热板/搅拌器的表面上。保持烧杯的覆盖, 以防止它的内容蒸发的下一步。
  2. 在100° c 的温度下加热琼脂糖和 DPBS, 搅拌 60-120 rpm。根据需要调整这些设置, 并不断监测溶解过程的进展, 因为溶液最初从不透明变为清晰的外观, 这意味着琼脂糖已完全溶解。
    注意: 热烧杯和解决方案是热的!
  3. 由于琼脂糖溶液加热和搅拌, 检索四空 10 cm 培养皿, 并添加20毫升的 DPBS 其中两个。地方针灸针 (直径: 300 µm, 长度:40 毫米), 玻璃升毛细管 (直径: 701.04 µm, 长度:65 毫米, 容量: 25.0 µL), 以及在生物安全柜内的灯泡分配器。当液体琼脂糖溶液清除, 保持恒定加热约50° c 和搅拌, 以避免凝胶的琼脂糖。
  4. 将针刺针引入灯泡分配器的底部开口。在针头外露的地方插入一根毛细管。通过进入灯泡分配器气缸的橡胶部分来保护毛细管。
  5. 将1毫升的液体琼脂糖微到空培养皿的表面, 并将毛细管的一端垂直放置 (针插入) 与琼脂糖接触, 而灯泡分配器的橡胶帽正向内挤压。慢慢松开灯泡盖上的压力, 将琼脂糖拉入毛细管中。
    注: 液体琼脂糖转移到毛细管必须迅速执行。如果液体琼脂糖被留在培养皿表面冷却足够的时间 (大约六十年代), 它开始凝胶, 防止琼脂糖的适当的吸痰沿毛细管。
  6. 将每个灯泡管针组件放在一个自由培养皿中, 并让毛细管内的琼脂糖凝胶凝固5分钟. 小心地把你的手从灯泡分配器气缸的橡胶塞子抽出毛细管, 离开针和琼脂糖凝胶的地方内的管。
  7. 将针刺针从毛细管中慢慢抽出, 手工提取;新凝固的琼脂糖缸也滑出的管在这个过程中, 仍然周围的针。轻轻地将微柱沿针刺针与无菌钳尖端移至末端。将针放在一个开放的、DPBS 的培养皿中, 用镊子将微柱推入 DPBS。
    注: 如果琼脂糖微柱在针刺针拔除后仍保持在玻璃毛细管内, 则将琼脂糖微柱缓慢地从毛细管中取出, 用25毫米口径针将其放入 DPBS。
  8. 用热珠消毒器消毒 microscalpels 或镊子。使4% 瓦特/v 琼脂糖通过重4克琼脂糖和转移到100毫升的 DPBS。加热和搅拌, 如步骤1.2 所述, 获得一个明确的4% 液体琼脂糖溶液。在以下步骤中保持加热和搅拌的解决方案。
  9. 将含有微柱的培养皿转移到解剖罩上, 并将微柱与细钳移到空的培养皿中。利用立体的视觉制导和 microscalpel 切割的微列, 以期望的长度。修剪两端以形成从水平到 45o角的斜面两端, 以便在 ECM 和单元格添加过程中方便地处理微列。
  10. 重复前一步的三更多的微列在同一培养皿和排队四结构平行与 < 3 毫米之间的分离, 每个气缸。装载50µL 4% 琼脂糖溶液与微和倒一条条纹/液体线在微列阵列连接和捆绑结构成小组四 (以下称 "微型专栏小船")。避免移动4% 琼脂糖到两端的微柱, 这可能堵塞内部, 通过最小化之间的距离的结构和快速添加琼脂糖在一条细线。
    注: 将四微柱组排成 "艇" 并不需要制造星脚手架。尽管如此, 这些船还是加速了制造过程, 并提供了一种更安全的方法来在以后的步骤中移动和处理微柱。
  11. 让微柱船冷却1-2 分钟, 允许凝胶的添加4% 琼脂糖。通过连接4% 琼脂糖, 用细钳拿起微柱舟, 并将微柱移到1.1.3 中的另一 DPBS 含培养皿中。制造更多的船与剩余的微柱所需的。
  12. 将含有微柱和/或船只的培养皿移至生物安全柜内, 并在紫外线照射下30分钟进行消毒。
    注意: 穿戴适当的防护措施以防止暴露在紫外线下。
  13. 在 DPBS 4 ° c 的情况下, 如果 ECM 添加和细胞电镀不会立即发生, 直到1周, 就会将这些盘子与微柱艇一起储存起来。如果在此时间段内未使用构造, 则重复微列的制作步骤。

2. 原细胞培养与分离

  1. 大鼠皮层星形胶质细胞的分离
    1. 为准备以下步骤, 增加20毫升的汉克的平衡盐溶液 (HBSS) 到四 10 cm 培养皿, 将用作解剖组织的水库。把所有的盘子放在冰上。在热珠消毒器中消毒清洁手术剪刀、镊子、微铲和微手术刀。
    2. Prewarm 0.25% 胰蛋白酶与1毫米乙酸酸 (EDTA) 和0.15 毫克/毫升 deoxyribonuclease (dnasei) I 在 HBSS 在37° c。此外, prewarm 星形胶质细胞培养基在37° c, 由 Dulbecco 氏改良的鹰培养基 (DMEM) 与火腿的 F-12 营养混合物和10% 胎牛血清 (FBS) 组成。
    3. 麻醉产后日0或日1大鼠幼崽暴露于低温条件下, 安乐被斩首。用19毫米口径的针把头部钉进一个舞台, 放在眼睛前面的鼻子里。
    4. 用手术刀在中间的后部做切口, 从颈部的底部到眼睛后面。将另一切口从眼睛的正下方向下进行, 形成 T 形。用细钳把颅骨/头骨拉到侧面。
    5. 将钳头放在动物嘴里, 另一只放在外面的表面上, 以鼻吻 (朝上) 握住头部。用无菌微铲取出大脑, 将其放在一个盛有冷冻 HBSS 的培养皿中。将这种培养皿立即放置在冰上, 并在任何时候, 除非在使用。
    6. 位于-20 ° c 以下的花岗岩块放置在解剖罩内的立体。在解剖过程中, 将培养皿和脑组织放置在花岗岩块的表面以保持其低温。在以下步骤中使用立体作为可视化指导。
    7. 如果嗅球保持完好, 用钳子或 microscalpels 切割。此外, 使用 microscalpel, 以消除小脑和做中线切口分离两个大脑半球。用镊子将半脑移植到一个含有新鲜、冷冻 HBSS 的培养皿中。
    8. 用 microscalpel 解剖大脑中的中脑结构, 只获得分离的皮层。使用优良的镊子剥去脑膜, 一张类似的结构, 从皮质组织脱落, 将孤立的皮质转移到一个新的培养皿中, 用冷 HBSS。使用 microscalpel 切碎的组织, 以增加的表面积为胰蛋白酶的作用, 在下一步。
    9. 使用巴斯德吸管将皮质转移到15毫升离心管中, 其中含有4毫升的 prewarmed 胰蛋白酶-EDTA (每管8皮质)。在37° c 时将皮质组织暴露在胰蛋白酶-EDTA 中5-7 分钟。
    10. 用巴斯德吸管, 小心地去除胰蛋白酶-EDTA 和增加400µl 的0.15 毫克/毫升 dnasei I 溶液对离心管。搅动管或漩涡, 直到所有的组织被离解, 并没有剩余的组织块在液体中。如果不能完全溶解组织, 用巴斯德吸管的尖端除去剩余的碎片。
    11. 离心管包含离解的细胞溶液在 200 x g 为 3 min. 用巴斯德吸管移除上清液而不干扰细胞。添加1毫升的星形胶质细胞培养基 (在步2.1.2 中定义), 以微和鼓动重, 并创造一个均匀的解决方案。
    12. 将10毫升的星形胶质细胞培养基与血清吸管移到 T-75 烧瓶中。添加250µl 1 毫升细胞溶液 (准备在步骤 2.1.11) 与微的烧瓶, 以板一小狗大脑价值的细胞每瓶。均匀地分布在培养基上的释放细胞溶液, 轻轻搅动烧瓶, 进一步促进均匀分布。
    13. 培养在37° c 和 5% CO2的湿恒温箱中的电镀烧瓶。在达到24和 72 h 在文化, 机械上搅动烧瓶分离换药细胞类型, 例如神经元和突。
    14. 之后, 在这些 timepoints 中, 执行媒体更改。垂直握住烧瓶, 使培养基位于烧瓶的底部, 不覆盖附着的细胞。用巴斯德吸管吸取培养基, 将吸管的尖端压在烧瓶的下角, 以避免提取细胞。将烧瓶放在原来的水平位置, 并在细胞中用血清学吸管轻轻地加入10毫升。
    15. 每次更换培养基后, 将烧瓶交还孵化箱。在达到 90% 70-100 后, 机械地再次搅动烧瓶以除去任何剩余的 non-adhering 细胞。
    16. 通过带真空和巴斯德吸管的培养基取出星形胶质细胞。在黏附的细胞上加入5毫升的0.25% 胰蛋白酶-EDTA 与血清吸管。轻轻搅动烧瓶, 以确保胰蛋白酶覆盖所有的细胞, 并孵化瓶5-7 分钟在37° c 和 5% CO2。
    17. 将1毫升的星形胶质细胞培养基加入血清学吸管, 使其猝灭胰蛋白酶。用血清吸管从烧瓶中提取细胞溶液, 并将其转移到无菌15毫升离心管。离心管在 200 x g 为3分钟。
    18. 在1毫升的星形胶质细胞培养基中, 用血清吸管移除上清液并重。搅动管, 以确保细胞溶液是均匀的。使用例或自动单元计数器计算解决方案中的单元格数。
      注: 90% 汇合的烧瓶通常产约300万星形胶质细胞。
    19. 在 T-75 瓶中加入10毫升的星形胶质细胞培养基。执行1:4 稀释通过转移250µl 的细胞溶液 (步骤 2.1.18) 与微的 T-75 瓶已经含有培养基。轻轻地搅动, 以确保在烧瓶的整个表面均匀的细胞分布。
    20. 重复步骤 2.1. 16-2. 1.19 每次达到通过细胞的 90% 70-100。
  2. 大鼠胚胎皮质神经元的分离
    1. 跟随相似的准备作为步2.1.1 和 2.1.2, 除 prewarmed 媒介是共培养媒介, 包括 Neurobasal 中等 + 2% B-27 补充 (为神经元) + 1% G-5 无血清补充 (为星形胶质细胞) + 0.25% l-谷氨酰胺。
    2. 安乐定时怀孕的胚胎日18大鼠, 二氧化碳窒息和确认死亡的斩首。
    3. 提取大鼠胎儿和解剖的皮层从其余的大脑组织的培养皿中含有 HBSS 的表面的冷冻花岗岩块, 使用立体的视觉引导和灭菌剪刀, microscalpel 和镊子53.在头颅、大脑、大脑半球和皮质的连续解剖之后, 将每个组织转移到一个新的 HBSS 填充的培养皿中。
    4. 将皮质组织剁碎成更小的片段, 以增加胰蛋白酶的表面积。用巴斯德吸管将4-6 皮质转移到一根管上, 5 毫升的 prewarmed 胰蛋白酶-EDTA, 在37° c 下保持组织的游离。在5-7 分钟, 手动鼓动管混合和防止结块的组织。
    5. 从37° c 去除管子在 10 min 以后。如前所述, 步骤 2.1, 提取胰蛋白酶-EDTA 和替代1.8 毫升0.15 毫克/毫升 dnasei 溶液。然后, 漩涡组织直到溶液出现均匀, 没有组织碎片漂浮在液体中。
    6. 离心分离的组织溶液在 200 x g 为3分钟。除去上清液后, 在2毫升的共培养培养基中重。使用例或自动单元计数器计算此解决方案中的单元格数。
      注: 通常产量为 3.0-5.0 x 106细胞/皮质半球。
    7. 在上述所定义的共培养介质中, 制备一个密度为 2.0-4.0 x 105细胞/毫升的新的细胞溶液。

3. 微型柱内星电缆的研制

  1. ECM 核心制造
    注: 在细胞播种的同一天, 必须将 ECM 添加到水凝胶微柱的内部。
    1. 在一个生物安全柜内, 在无菌离心管中制备1毫克/毫升的大鼠尾型胶原的培养液。保持离心管与 ECM 解决方案在冰上任何时候, 除非在使用。
    2. 转移1-2 µL 的 ECM 解决方案与微到一条试纸, 以估计其 pH 值。添加1µL 1 N 氢氧化钠 (氢氧化钠) 或盐酸 (HCl) 与微, 以增加或降低 ECM 溶液的 pH 值分别和吸管向上和向下到质。验证新的 ph 值的试纸和添加更多的酸或碱, 根据需要, 直到 ph 值是稳定的 7.2-7.4 的范围。
    3. 将培养皿从步骤1.2 移至解剖罩, 并将4-5 微柱或无菌细钳的小船转移到空的、无菌的35或 60 mm 培养皿中。使用立体的指导, 位于每一个微柱的一端的一个微的10µL 尖端和吸空的流明 DPBS 和气泡。确认没有气泡与立体, 以确保在下一步添加的 ECM 可以自由流动的流明。
    4. 充电 P10 微与 ecm 解决方案, 放置10µL 尖端对水凝胶微柱的一端, 并提供足够的解决方案, 以填补流明 (约3-5 µL), 观察到 ecm 进入立体。在微柱的任一端, 在 ECM 溶液中移出一个小的蓄水池 (2-4 µL)。
      注: 始终管理4-5 微型柱或一条船, 以防止长期干燥的构造, 因为这可能导致皱的微柱结构。完全干燥的微柱牢固附着在培养皿的表面上, 防止了它们对细胞苗的利用。过多的共培养介质 (作为水合措施) 不能添加到微列中, 因为这可能导致 ECM 在下面描述的潜伏期内流出。
    5. 在培养皿周围的一个环中, 吸收培养基, 以提供一个湿度水槽, 以防止在孵化过程中干燥的柱子。在37° c 和 5% CO2中孵育含有含有 ECM 的微柱的培养皿, 以促进胶原在加入神经元和/或星形胶质细胞之前的聚合。
      注: ecm 应形成一层涂层的空心腔内表面, 而不是一个坚实的 ecm 核心, 包括内部, 这两者都可以观察使用立体。如果 ECM 形成一个核心, 则继续潜伏期直到只剩下一层。随着这一层的形成, 星形胶质细胞溶液可以在电镀步骤中填充微柱的内部。
    6. 在潜伏期, 准备星形胶质细胞溶液 (如下所述)。
  2. 微柱中星形胶质细胞和神经元的播种
    1. 如步骤 2.1. 16-2. 1.19 所述, 经镀的星形胶质细胞 (在第四至第十二通道之间)。在计算烧瓶中的细胞数后, 在细胞培养介质中悬浮的 9.0-12.0 x 105单元/mL 溶液的密度下制备细胞溶液。
    2. 使用立体, 将 P10 微的尖端放在微柱的一端, 并将足够的细胞溶液 (~ 5 µL) 转移到腔内, 以完全填满它。与 ECM 一样, 在每个微柱的两端都加入小的细胞液库。
    3. 孵育在37° c 和 5% CO2的培养皿上的电镀微柱, 以促进星形胶质细胞与 ECM 的附着。如果不将神经元添加到微列中, 请进行步骤3.2.5。
    4. 在初始潜伏期后, 增加1-2 µL 的皮质神经元解决方案获得的步骤2.2.7 到两端的微柱与微, 而观察下的立体。确保盘子里有足够的培养基以避免干燥, 并在37° c 和 5% CO2中再次孵育40分钟, 以允许神经元黏附。
      注: 皮质神经元溶液也可在束形成后1-2 天内加入, 执行步骤3.2.4 后, 小心地从培养皿中去除培养基中的微。
    5. 潜伏期后, 分别用3或6毫升的培养皿, 在35或60毫米的培育皿中, 仔细地填充含有镀膜的微柱。在37° c 和 5% CO2的区域性中维护电镀微柱, 以促进对齐的星束的自组装, 在 6-10 h 之后应形成捆绑的电缆状结构。
  3. 星形胶质细胞电缆结构的稳定性
    注: 在形成束后, 大约 6-12 h 的培养结构, 执行以下步骤, 以防止星脚手架的对齐构造倒塌。
    1. 在无菌离心管中, 在共培养培养基中制备3毫克/毫升大鼠尾胶原 i 溶液。根据步骤3.1.2 中概述的步骤, 将溶液的 pH 值调整为 7.2-7.4。在不使用的情况下, 在冰上保持胶原蛋白和共培养培养基, 并在冰上随时放置准备好的胶原蛋白溶液。
    2. 从含有微星支架的培养皿中取出培养基, 将一些介质留在盘子的两侧, 以创建一个能保证微柱水化的湿度水槽。把盘子放在立体下, 以帮助形象化。
    3. 用微, 取2-3 µL 的胶原蛋白溶液并排出到每一端的微柱上, 用立体进行视觉引导。确保菜的两侧有足够的介质, 使其在盘子的边缘处有一个潮湿的水槽。用微柱孵育培养皿30分钟在37° c 和 5% CO2在湿化孵化器中, 以促进新添加胶原蛋白的凝胶。
    4. 慢慢地将3或6毫升的共培养培养基 (分别用于35或 60 mm 的培养皿) 添加到带吸管的培皿中, 然后在 37 oC 和 5% co2中, 在湿化恒温箱中培育菜肴。

4. 从水凝胶内部提取星束

  1. 在高压釜中消毒玻璃片。在无菌细胞培养液中制备20µg/毫升的聚 l-赖氨酸 (PLL) 溶液。
  2. 在生物安全柜内, 手动将灭菌的玻璃片到不育的 10 cm 培养皿中, 并添加足够的 PLL 解决方案以覆盖片。
  3. 孵育片, 覆盖与锁相环解决方案, 30 分钟在37° c 的外衣表面。30分钟后, 用巴斯德吸管移除 PLL 溶液, 将细胞培养液添加到片中, 然后用巴斯德吸管将其除去。
  4. 在对齐的胶质束形成后, 将微柱巧妙地转移到无菌的无菌培养皿中, 并加入一小池10µL 的共培养培养基, 微以防止脱水, 确保束健康。用无菌手术钳从一端轻轻拉动, 用立体进行视觉引导, 从水凝胶微柱中提取星束。
  5. 用钳子夹住星束, 将其贴在 PLL 涂层的片上。修复和染色与下面的协议。

5.体外研究的免疫细胞化学

注: 本研究主要抗体为家兔 anti-glial 酸性纤维蛋白 (1:500)、小鼠抗β蛋白 III (1:500)、兔 anti-collagen I (1:500)、小鼠 anti-nestin (1:200) 和兔 anti-vimentin (1:100)。次要抗体是驴 anti-mouse 568, 驴兔 568, 驴子兔488和驴 anti-mouse 568 (1:500 为所有)。在所有情况下, 添加足够数量的每个解决方案, 以完全覆盖微列。

  1. 准备一个4% 卷/体积 (v/v) 甲醛溶液在 1x DPBS 内的化学油烟罩。
    注意: 甲醛是一种已知致癌的有毒化合物, 必须在单独的容器中处理。总是在化学油烟机内操作这种化合物, 并利用个人防护设备 (PPE), 如实验室大衣、安全眼镜和手套。
  2. 在微柱的情况下, 从含有该结构的培养皿中丢弃培养基, 用巴斯德吸管, 而不会意外地吸水凝胶钢瓶。添加足够的甲醛溶液, 以覆盖微柱或安装片 (两者都留在培养皿) 和孵化35分钟在18-24 ° c。
  3. 用血清吸管从固定的微柱或片中提取4.0% 甲醛溶液。通过快速添加和去除 pbs 两次, 用 pbs 冲洗固定的微柱三次, 然后让它们第三次浸泡10分钟。
  4. 在 PBS 中溶解正常的马血清 (nhs) 浓度为4% 伏/五, 用 NHS 溶液作为溶剂, 在浓度为0.3% 伏/v 的情况下, 用非离子洗涤剂制备溶液。
  5. 用吸管将 PBS 从含有微柱或片的培养皿中取出。添加足够的0.3% 洗涤剂解决方案覆盖的微柱/片60分钟, 在18-24 ° c permeabilize 的细胞。
  6. 取出洗涤剂溶液, 用 PBS 快速冲洗两次, 三次浸泡5分钟. 计算 4% NHS 和每一个主要抗体的需要量, 以准备一个溶液与所需的抗体浓度。
  7. 从培养皿中取出 PBS, 添加足够的初级抗体 (稀释在 4% NHS-DPBS) 溶液中, 以覆盖微柱或提取的星束。在4° c 的夜间孵育 (12-16 小时)。
  8. 取出主抗体溶液, 并快速冲洗两次 PBS 和三次浸泡5分钟。在黑暗中制备二次抗体溶液, 每种抗体在 4.0% NHS 溶液中稀释1:500。
  9. 孵育细胞与第二抗体溶液为2小时在18-24 ° c。在整个孵化过程中, 用铝箔覆盖含有微柱的培养皿, 避免暴露在光线下。
  10. 去除二次抗体溶液, 并加入赫斯特溶液 (1:10,000) 为10分钟, 在18-24 ° c 染色核。
    注意: 赫斯特是一种已知的诱变, 应被视为致癌物。因此, 它必须在单独的容器中处理, 并且在操作此代理时应始终使用 PPE。
  11. 用 pbs 冲洗五次, 每次5-10 分钟后, 将染色的微柱存放在 pbs 4 ° c, 用铝箔盖上。在安装的星束的情况下, 添加一滴水的安装介质的捆绑, 放置另一个玻璃片超过固定捆绑, 并密封两片与指甲油长期储存和后续成像。

6. 活死人 (素/溴 Homodimer) 染色的活性测定法

  1. 通过添加5μ l 素 AM (4 毫米无水二甲基亚砜) 和20μ l 溴 homodimer-1 (EthD-1) (2 毫米的亚砜/H2O 1:4 v/v) 到10毫升的 1x DPBS 来制备试剂溶液。用铝箔或在黑暗中存储解决方案, 以保护它免受光线的覆盖。
  2. 从培养皿中吸取含有带有巴斯德吸管的微柱的培养基, 并加入足够的溶液 (上面所述) 来盖住结构。孵育30分钟, 在37° c 和 5% CO2, 保持培养皿覆盖, 以保护解决方案从光。
  3. 用微或巴斯德吸管移除溶液。用 DPBS 冲洗2-3 次, 如步骤5.3 所述。根据菜肴的大小, DPBS 培养皿。图像细胞之后立即使用荧光或共聚焦成像。
    注: 新陈代谢活性细胞对素膜通透素的转化率为素的绿色荧光。死细胞被标记为细胞膜受损的细胞, 允许 EthD-1 进入细胞并与核酸结合, 导致红色荧光。

结果

最初, 用相衬显微镜监测星形胶质细胞黏附和束形成的进展, 以及细胞的整体稳定性作为时间的函数。在1小时的电镀后, 星形胶质细胞在微柱的腔内被发现球形形态 (图 2A)。在5小时, 星形胶质细胞开始扩展过程和收缩, 而由 8 h 电池展示了一个完整的过程-轴承形态, 并形成了电缆状结构, 沿纵向轴线的微柱 (图 2A)。值得注意的是, ?...

讨论

与三七总皂苷的支持环境相比, 中枢神经系统在处理神经和神经的有害后果方面特别有限。在对哺乳动物中枢神经系统的严重侮辱后, 形成了一个神经胶质瘢痕, 由纤维化和炎症细胞的核心组成, 由一个致密网状的无条理的反应性星形胶质组织所包围, 分泌轴突生长抑制蛋白14。此疤痕作为一个物理和生物化学的障碍, 反对再生轴突结束12。此外, 成年哺乳动物中枢?...

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

财政支持由国立卫生研究院提供 [U01-NS094340 (卡伦) & F31-NS090746 (Katiyar)], 迈克尔 j ·福克斯基金会 [治疗管道计划 #9998 (卡伦)], 佩恩医学神经科学中心试点奖 (卡伦),国家科学基金会 [研究生研究金 DGE-1321851 (Struzyna)], 退伍军人事务部 [RR & D 值得审查 #B1097 I (卡伦)] 和美国陆军医学研究和装备司令部 [#W81XWH-13-207004 (卡伦) &W81XWH-15-1-0466 (卡伦)]。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Acupuncture needle (300 µm diameter)Lhasa MedicalHS.30x40The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dishFisher08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)Invitrogen14200075
Polystyrene disposable serological pipetFisher13-678-11D
AgaroseSigmaA9539-50G
Microliter glass capillary tube (701 µm)Fisher21-170JThe diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Microcap bulb dispenserFisher21-170JBulb comes with the microcap tubes.
Hot plateFisherSP88857200
Magnetic barFisher1451352
MicropipetteSigmaZ683884-1EA
25 mm gauge needleFisher14-826-49
MicroscalpelRoboz SurgicalRS-6270
ScissorsFine Science Tools14081-09
ForcepsWorld Precision Instruments501985
Hot bead sterilizerSigmaZ378550-1EA
StereoscopeNikonSMZ800N
Micro-spatulaFisherS50821
Rat tail type I collagenCorning354236Maintain at 4 ºC and remove only when needed. Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tubeFisher02-681-256
Sodium hydroxide (NaOH)FisherSS2661
Hydrochloric acid (HCl)FisherSA48-1
Litmus paperFisher09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS)Invitrogen14170112Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTAInvitrogen25200056Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (Dnase) ISigma10104159001Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with Ham's F-12 Nutrient MixtureGibco11330-032Store at 4 ºC.
Fetal bovine serum (FBS)Atlanta BiologicalsS11195Store at -20ºC.
Postnatal day 0 or day 1 Sprague Dawley rat pupsCharles RiverStrain 001
Neurobasal embryonic neuron basal mediumInvitrogen21103049Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 serum free supplementInvitrogen12587010Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamineInvitrogen35050061Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
G5 astrocytic supplementInvitrogen17503012
Sprague Dawley embryonic day 18 ratsCharles RiverStrain 001
Pasteur pipetteFisher22-042816
15 mL centrifuge tubeEMESCO1194-352099
VortexFisher02-215-414
CentrifugeFisher05-413-115
HemocytometerFisher02-671-6
IncubatorFisher13 998 076
Formaldehyde 40%FisherF77P-4Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.
Glass cover slipFisher12-548-5M
Nail polishElectron Microscopy Sciences (EMS)72180
Fluoromont mounting mediumSouthern Biotech0100-01
Poly-L-lysineSigmaP4707
Phosphate buffered salineFisherBP3994
Triton X-100SigmaT8787
Normal horse serumGibco16050-122
Rabbit anti-glial acidic fibrillary protein (GFAP) primary antibodyMilliporeAB5804Store at -20ºC.
Mouse anti-beta-tubulin III primary antibodySigmaT8578Store at -20ºC.
Rabbit anti-collagen I primary antibodyAbcamab34710Store at -20ºC.
Rabbit anti-vimentinMilliporeAB3400Store at -20ºC.
Mouse anti-nestinMilliporeAB5326Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibodyInvitrogenA10037Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 568 secondary antibodyInvitrogenA10042Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibodyInvitrogenA21206Store at 4ºC.
Hoechst 33342, TrihydrochlorideInvitrogenH3570Store at 4ºC. Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen. Therefore, it must be disposed of in a separate container.
Calcein AMSigmaC13594 mM in anhydrous DMSO
Ethidium homodimer-1Life TechnologiesE11692 mM in DMSO/H2O 1:4 (v/v)
Dimethyl sulfoxane (DMSO)Sigma276855
A1RSI Laser Scanning Confocal MicroscopeNikon--------------Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S MicroscopeNikon--------------Used for taking the phase-contrast images. With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).

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