JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الخلايا العصبية الحسية الشمية تعبر عن مجموعة واسعة من جزيئات محوار الفرز لإنشاء الدوائر العصبية المناسبة. يصف هذا البروتوكول طريقة تلطيخ المناعية لتصور التعبيرات كومبيناتوريال من جزيئات الفرز محوار في تيرميني محور عصبي من الخلايا العصبية الحسية الشم.

Abstract

وغالبا ما يستخدم نظام الشمية الماوس لدراسة آليات تشكيل الدائرة العصبية بسبب هيكل تشريحي بسيط لها. الخلايا العصبية الحسية الشمية (أوسن) هي خلية ثنائية القطب مع دندريت واحد و محور عصبي واحد أونبرانشد. وتعبر أوسن عن جينة واحدة فقط من مستقبلات أولفاكتوري (أور)، أوسنز تعبر عن نوع معين من أور تتلاقى محاورها مع بضع مجموعات من الكبيبات الثابتة في لمبة الشم (أوب). وهناك ميزة ملحوظة من إسقاط أوسن هو أن أورس أعرب لعب الأدوار مفيدة في الإسقاط محور عصبي. أورس تنظم التعبير عن جزيئات محورية الفرز متعددة وتوليد رمز الجزيئي كومبيناتوريال من جزيئات الفرز محوار في تيرميني محور أوسن. وهكذا، لفهم الآليات الجزيئية لآليات التوجيه محور عصبي أور، فمن الأهمية بمكان لتوصيف ملامح التعبير في تيرميني محور أوسن داخل الكبيبة نفسها. والهدف من هذه المقالة هو إدخال أساليب لجمع أكبر عدد ممكن من الكبيبات كما بوسيبله على قسم أوب واحد وأداء إمونوستينينغ باستخدام الأجسام المضادة متعددة. وهذا من شأنه أن يسمح للمقارنة وتحليل أنماط التعبير من جزيئات الفرز محوار دون تلطيخ التباين بين أقسام أوب.

Introduction

خلال التنمية، ترتبط الخلايا العصبية على وجه التحديد مع بعضها البعض لتشكيل الدوائر العصبية المناسبة، وهو أمر حاسم لوظيفة الدماغ العادية. منذ الدوائر العصبية الشاذة في الدماغ ويعتقد أن يكون سبب الاضطرابات النفسية مثل التوحد والفصام، فهم آليات تشكيل الدوائر العصبية هي واحدة من التحديات الرئيسية في مجال علم الأعصاب.

في نظام الشمي الماوس، كل الخلايا العصبية الحسية الشم (أوسن) في ظهارة الشمية (أو) يعبر عن واحد فقط الجينات مستقبلات الشفة (أور) و أوسنز التعبير عن نفس أو تلاقى محاورها لزوج معين من الكبيبات في مواقع نمطية في اللمبة الشمية (أوب) 1 ، 2 . نظام شمي الماوس هو نظام نموذج ممتاز لدراسة الآليات الجزيئية لتشكيل الدائرة العصبية لأن الباحثين يمكن الاستفادة من التعبير أو لتحديد ق محددةأوبتيون من أوسنز وتصور مواقع الإسقاط من المحاور أوسن كما هياكل كبيبي واضح. وهناك ميزة ملحوظة من إسقاط أوسن هو أن أورس تلعب الأدوار مفيدة في إسقاط محاور أوسن إلى أوب 3 ، 4 ، 5 ، 6 . وبشكل أكثر تحديدا، بعد توجيه محاور أوسن إلى المناطق المستهدفة التقريبية، يتم فصلها لتشكيل الكبيبات بطريقة تعتمد على أور. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن جزيئات أور السيطرة على التعبير عن جزيئات الفرز محوار، التي تنظم الفصل الكبيبي 7 ، 8 . وعلاوة على ذلك، تشير الأدلة المتراكمة إلى أن جزيئات أور تولد رمز هوية الخلايا العصبية بواسطة مزيج فريد من جزيئات الفرز المحوري 9 . وهكذا، لفهم آلية فصل الكبيبي أو تعتمد، فمن الضروري لتوصيف ملامح التعبير من محوار فرز مولإيكولز في أوسنز.

المناعية الفلورسنت هو طريقة شائعة لتصور التعبير عن جينات محددة. منذ البروتينات من جزيئات محوار الفرز هي في الغالب المترجمة إلى محاور أوسن، يحتاج الباحثون إلى استخدام أقسام أوب لتوصيف أنماط التعبير في أوسنز. وقد تم استخدام الاقسام كورونال من أوب بشكل روتيني للمناعية. ومع ذلك، فإن هذا الإعداد يفقد المعلومات الطبوغرافية على طول المحور الأمامي الخلفي في نفس القسم أوب. ولذلك وضعنا إعداد باراساجيتال من الجانب الإنسي من أوب، والتي يمكن تحميل العديد من الكبيبات المحيطة ممكن على نفس القسم أوب. جنبا إلى جنب مع إمونوستينينغ باستخدام الأجسام المضادة متعددة، وهذا التحضير يسمح للمقارنة وتحليل أنماط التعبير من جزيئات الفرز محوار دون تلطيخ التباين بين أقسام أوب.

وعلاوة على ذلك، تم تقديم طريقة تلطيخ المناعية دون تثبيت بعد مع بفا أند العلاج السكروز. هذه الطريقة تسمح للباحثين الحصول على ما يكفي من البيانات تلطيخ عالية الجودة لتحليل البيانات متعددة المتغيرات. البروتوكولات المقدمة هنا سوف توفر تفاصيل أساليب قوية للباحثين الذين يدرسون تشكيل الدائرة العصبية الشمية.

Protocol

وقد أجريت جميع الإجراءات التجريبية بموافقة لجنة أخلاقيات التجارب الحيوانية في جامعة طوكيو ووفقا للمبادئ التوجيهية لجامعة طوكيو لرعاية واستخدام حيوانات المختبر.

1. إعداد الحلول

  1. إعداد 0.01 M الفوسفات مخزنة المالحة (بس): إضافة قرص بس (0.14 M كلوريد الصوديوم، 0.0027 M بوكل، 0.010 M بو 4 3- ، ودرجة الحموضة 7.4) إلى 1 لتر الماء المقطر ويقلب في رت حتى يتم حله تماما.
  2. إعداد بارافورمالدهيد 4٪ (بفا) في برنامج تلفزيوني: إضافة 4 غرام من بفا إلى 100 مل برنامج تلفزيوني. تحريك الحل في 60 درجة مئوية حتى يتم حله تماما.
    1. بعد حل بفا في برنامج تلفزيوني، وضبط درجة الحموضة من الحل إلى 7.4 مع 1 N هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم). ثم، بارد على الجليد وتصفية الحل من خلال ورقة مرشح لإزالة أي الجسيمات. تخزين في 4 درجات مئوية.
      تنبيه: توخ الحذر عند استخدام هذه الكواشف. مقبضمع قفازات العناية والاستخدام، ونظارات السلامة، ومعطف المختبر تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية.
      ملاحظة: استخدام الطازجة بفا الحل 4٪ أعدت في غضون 2 د.
  3. إعداد 0.01 M بس تكمل مع 0.3٪ تريتون X-100 (بست): إضافة 3 مل من تريتون X- 100 إلى 997 مل من برنامج تلفزيوني. تحريك الحل في رت حتى يتم حله تماما.
  4. إعداد 1٪ و 5٪ حجب الحل: إضافة 10 غرام من الحليب الخالي من الدسم إلى 200 مل بست لإعداد 5٪ حجب الحل. يحرك في رت حتى يتم حله تماما. تمييع 5٪ عرقلة حل خمس مرات مع بست لإعداد 1٪ حجب الحل.

2. إعداد أقسام أوب باراساجيتال

  1. استخدام الحيوانات بين 1-2 أسابيع من العمر. هذه الفئات العمرية هي مناسبة للتجارب التالية لأن الكبيبات واضحة للعيان ويمكن قطع الدماغ مع الجمجمة.
  2. تخدير الحيوان مع حقن داخل الصفاق من بينتوباربيتال (50 ملغ / كغ من وزن الجسم). يروي ترانسكارديالي الحيوان مع الجليد الباردة 4٪ Pفا في برنامج تلفزيوني. التعامل مع الرعاية واستخدام القفازات، ونظارات السلامة، ومعطف المختبر تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية.
  3. بعد نضح، وقطع الرأس مع مقص وإزالة الجلد بعناية. ثم، إدراج شفرة من مقص في الفضاء بين الأسنان العلوية والسفلية وقطع أفقيا لإزالة عظم الفك السفلي. تقليم بعيدا الأنسجة الزائدة مع ملقط ومقص لترك الأنسجة الشمية بما في ذلك أوب و أو.
    ملاحظة: لا إزالة الجمجمة المحيطة أوب لأن هذا يحتفظ الكبيبات الإنسية الانحياز عموديا على التوالي.
  4. تزج الأنسجة الشمية في برنامج تلفزيوني لإزالة الهواء في تجويف الأنف. قطع الجزء الخلفي من الدماغ عموديا ووضع الأنسجة حاسة الشم على الجزء السفلي من قالب التضمين مع وجه القطع إلى أسفل. ملء القالب مع الأمثل درجة حرارة القطع (أكتوبر) مجمع ثم تزج القالب في النيتروجين السائل.
    1. بعد أن يتم تجميد الأنسجة في المجمع تماما، احتضانها في البردتات في -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  5. جعل المقاطع الطفيلية المسلسل (10 ميكرون) من أوب مع ناظم البرد وجمعها من خلال التمسك الشرائح الزجاج المغلفة ماس. بعد الشائكة، جفف الشرائح على الفور مع مجفف ضربة.

3. يوم 1: إمونوستينينغ رباعية من شرائح أوب

  1. غسل الشرائح لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني في رت. كرر 3 مرات.
  2. منع مواقع ملزمة غير محددة من خلال احتضان الشرائح لمدة 1 ساعة مع حل عرقلة 5٪ في رت.
  3. احتضان الشرائح O / N مع كوكتيل من الأجسام المضادة الأولية (400 ميكرولتر كل شريحة) في حل عرقلة 1٪ في رت. استخدام الأجسام المضادة الأولية التالية: خنزير غينيا المضادة لل Kirrel2 الأجسام المضادة (1: 1000)، والماعز المضادة سيمافورين-7A (Sema7A) الأجسام المضادة (1: 500)، الجرذان المضادة لل أول-بروتوكادرين (أوليك) الأجسام المضادة (1: 500)، والفأر المضادة للحويصلة الغلوتامات الناقل 2 (VGLUT2) الأجسام المضادة (1: 500).

4. يوم 2: إمونوستينينغ رباعية من أوبشرائح

  1. تجاهل الحل الأجسام المضادة الأولية وغسل الشرائح لمدة 5 دقائق مع بست في رت. كرر 3 مرات.
  2. احتضان الشرائح لمدة 1 ساعة مع كوكتيل من الأجسام المضادة الثانوية (400 ميكرولتر كل شريحة) في برنامج تلفزيوني في رت. استخدام الأجسام المضادة الثانوية التالية: حمار مضاد للفأر اليكسا فلور 405 (1: 400)، حمار مضاد للاعز اليكسا فلور 488 (1: 400)، حمار ضد غينيا خنزير اليكسا فلور 555 (1: 400) الفأر اليكسا فلور 647 (1: 400).
    ملاحظة: يجب أن تأتي جميع الأجسام المضادة الثانوية من نفس الأنواع المضيف. اختيار الطول الموجي مختلفة من مضان من الأجسام المضادة الثانوية لكل الأجسام المضادة الأولية لضمان عدم التداخل من الأطوال الموجية.
  3. تجاهل الحل وغسل الشرائح لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني في رت. كرر 3 مرات.
  4. جبل كوفرسليبس على الشرائح مع وسط تصاعد. لهذا، تطبيق 2 قطرات من تصاعد المتوسطة على كل شريحة، ومن ثم، وضع ساترة عن طريق إزالة فقاعات الهواء.

5. كثافة ليasurements

  1. الحصول على صور الفلورسنت مع المجهر مضان. استخدام المكعبات فلتر التالية: دابي مرشح مكعب (360/40 نانومتر الإثارة، 460/50 نانومتر الانبعاثات، و 400 نانومتر مرآة مزدوج اللون) لإشارات اليكسا فلور 405، غفب مرشح مكعب (470/40 نانومتر الإثارة، 525/50 نانومتر الانبعاثات، و 495 نانومتر مرآة مزدوج اللون) لاليكسا فلور 488، تريتك مرشح مكعب (545/25 نانومتر الإثارة، 605/70 نانومتر الانبعاثات، و 565 نانومتر مرآة مزدوج اللون) لاليكسا فلور 555، و CY5 مرشح مكعب (620/60 نانومتر الإثارة، 700 / 75 نانومتر الانبعاثات، و 600 نانومتر مرآة مزدوج اللون) لاليكسا فلور 647.
    ملاحظة: ضبط الوقت التعرض للحصول على إشارات الفلورسنت من الصورة دون التشبع.
  2. تحديد هيكل الكبيبي بواسطة إشارات المناعي من VGLUT2. قياس شدة تلطيخ جزيئات الفرز محوار داخل الكبيبات مع إيماجيج.

6. تحليل البيانات

  1. طرح إشارات الخلفية من شدة تلطيخ جزيئات محوار الفرز.
  2. إعداد ثه مصفوفة بيانات التعبير، الذي يحتوي على أعمدة تتألف من جزيئات محوار الفرز والصفوف تتألف من الكبيبات.
  3. إجراء تحليل المكون الرئيسي (يكا) باستخدام مجموعة بيانات التعبير المعدة. ثم، الحصول على درجات يكا، نسب المساهمة، وتحميل عامل من كل عنصر رئيسي.

النتائج

يتم تشكيل خريطة الكبيبي الشمي عن طريق الاستهداف العالمي الأولي والفصل الكبيبي لاحق من المحاور أوسن 1 ، 2 . وينظم الفصل الكبيبي عن طريق التفاعلات المحاور / محاذاة متهورة بوساطة جزيئات الفرز محوار التي يتم تحديد مستويات...

Discussion

تمكنت المناعية رباعية من أقسام أوب باراساجيتال التصور والتقدير الكمي لمستويات التعبير من ما يصل إلى أربعة جزيئات محوار الفرز في وقت واحد في عدد أكبر من الكبيبات. من خلال تحليل هذه البيانات متعددة المتغيرات مع يكا، يمكن التكهن بخصائص التعبير عن تلك الجزيئات.

Disclosures

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل من قبل مؤسسة ميتسوبيشي، ومؤسسة تاكيدا للعلوم، جست بريستو و جسبس كاكينهي رقم المنحة 16H06144.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Tablets, pH7.4TAKARA BIOT9181
Skim Milknacalai tesque31149-75
goat anti-Sema7A antibodyR&D SystemsAF2068
rat anti-OLPC antibodyMerck MilliporeMABT20
mouse anti-VGLUT2 antibodyMerck MilliporeMAB5504
goat anti-BIG-2 antibodyR&D SystemsAF2205
gunea pig anti-Kirrel2 antibodyOperon BiotechnologiesAnti-Kirrel2 antibodies were generated by immunizing guinea pigs with KLH-conjugated synthetic peptides (644-673aa): CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP
donkey anti-mouse Alexa Fluor 405Abcamab175658
donkey anti-goat Alexa Fluor 488 Jackson ImmunoResearch705-545-003
donkey anti-guinea pig Alexa Fluor 555Thermo Fisher ScientificA21432
donkey anti-rat Alexa Fluor 647Jackson ImmunoResearch712-605-153
Paraformaldehyde (PFA)Wako162-16065
MAS coated slide glassesMATSUNAMIMAS-01
forcepsFine Science Tools11253-27
Vannas Spring ScissorsFine Science Tools15000-00
dissecting scissorsFine Science Tools14090-09
fluorescent microscopeKEYENCEBZ-X700
DAPI filter cubeKEYENCEOP-87762
GFP filter cubeKEYENCEOP-87763
TRITC filter cubeKEYENCEOP-87764
Cy5 filter cubeKEYENCEOP-87766
filter paperADVANTEC00011185
O.C.T compoundSakura FinetekM71484

References

  1. Mori, K., Sakano, H. How is the olfactory map formed and interpreted in the mammalian brain?. Annu Rev Neurosci. 34, 467-499 (2011).
  2. Takeuchi, H., Sakano, H. Neural map formation in the mouse olfactory system. Cell Mol Life Sci. 71, 3049-3057 (2014).
  3. Mombaerts, P., et al. Visualizing an olfactory sensory map. Cell. 87, 675-686 (1996).
  4. Feinstein, P., Mombaerts, P. A contextual model for axonal sorting into glomeruli in the mouse olfactory system. Cell. 117, 817-831 (2004).
  5. Ishii, T., et al. Monoallelic expression of the odourant receptor gene and axonal projection of olfactory sensory neurones. Genes Cell. 6, 71-78 (2001).
  6. Nakashima, A., et al. Agonist-independent GPCR activity regulates anterior-posterior targeting of olfactory sensory neurons. Cell. 154, 1314-1325 (2013).
  7. Serizawa, S., et al. A neuronal identity code for the odorant receptor-specific and activity-dependent axon sorting. Cell. 127, 1057-1069 (2006).
  8. Kaneko-Goto, T., Yoshihara, S., Miyazaki, H., Yoshihara, Y. BIG-2 mediates olfactory axon convergence to target glomeruli. Neuron. 57, 834-846 (2008).
  9. Ihara, N., Nakashima, A., Hoshina, N., Ikegaya, Y., Takeuchi, H. Differential expression of axon-sorting molecules in mouse olfactory sensory neurons. Eur J Neuro. 44, 1998-2003 (2016).
  10. Williams, E. O., et al. Delta Protocadherin 10 is Regulated by Activity in the Mouse Main Olfactory System. Front Neural Circuits. 5, 9 (2011).
  11. Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel. Neuron. 17, 681-693 (1996).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

124

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved