Quadunple Immunostaining של הנורה חוש הריח עבור ויזואליזציה של חוש הריח חושפת אקסון מולקולרית קודי זהות

Summary

חוש הריח נוירונים חושיים מבטאים מגוון רחב של מולקולות מיון האקסון להקים מעגלים עצביים נאותים. פרוטוקול זה מתאר שיטת מכתים immunohistochemical לדמיין ביטויים קומבינטוריים של מולקולות מיון האקסון ב טרמיני האקסון של נוירונים חושית חוש הריח.

Abstract

מערכת חוש הריח של העכבר משמש לעתים קרובות כדי ללמוד מנגנונים של המעגל העצבי היווצרות בגלל המבנה האנטומי הפשוט שלה. חוש הריח נוירון (OSN) הוא תא דו קוטבי עם דנדריט יחיד ואקסון unbranched יחיד. OSN מבטא רק גן אחד קולטן הריח (OR), OSNs להביע סוג נתון של או להתכנס אקסונים שלהם כמה קבוצות של glomeruli קבועים של הנורה חוש הריח (OB). תכונה יוצאת דופן של הקרנת OSN היא כי הביע אורס לשחק תפקידים מאלפת הקרנה axonal. ORs לווסת את הביטוי של מולקולות מיון האקסון מרובים וליצור קוד מולקולרית קומבינטורית של מולקולות מיון האקסון ב Termini האקסון OSN. לכן, כדי להבין את המנגנונים המולקולריים של מנגנוני הדרכה האקסון ספציפי, חשוב לאפיין את פרופילי הביטוי שלהם ב טרמיני האקסון OSN בתוך glomerulus אותו. מטרת מאמר זה היה להציג שיטות לאיסוף כמו glomeruli רבים כמו possiblדואר על סעיף OB בודד ועל ביצוע immunostaining באמצעות נוגדנים מרובים. זה יאפשר השוואה וניתוח של דפוסי הביטוי של אקסון מיון מולקולות ללא מכתים וריאציה בין סעיפים OB.

Introduction

במהלך ההתפתחות, נוירונים מחוברים זה לזה בדיוק כדי ליצור מעגלים עצביים נאותים, קריטיים לתפקוד המוח הרגיל. מאחר שמעגלים עצביים חריגים במוח נחשבים כגורמים להפרעות נפשיות כגון אוטיזם וסכיזופרניה, ההבנה של מנגנוני המעגל העצבי היא אחד האתגרים המרכזיים בתחום מדעי המוח.

במערכת חוש הריח של העכבר, כל נוירון חושני חוש הריח (OSN) באפיתל חוש הריח (OE) מבטא רק גן אחד של קולטן חוש הריחתי (OS) או OSNs המבטאים אותו או מתמזגים עם האקסונים שלהם לצמד מסוים של גלומרולי במיקומים סטריאוטיפיים חוש הריח Bulb (OB) ^{1 , 2} . מערכת הריח העכבר היא מערכת מודל מעולה לחקר המנגנונים המולקולריים של היווצרות מעגל עצבי כי החוקרים יכולים לנצל את הביטוי OR לזהות ספציפייםUbtype של OSNs לדמיין את אתרי ההקרנה של האקסונים OSN כמו מבנים glomerular ברור. תכונה יוצאת דופן של הקרנת OSN היא כי אורס לשחק תפקידים מאלפת הקרנת אקסונים OSN ל OB ^{3 , 4 , 5 , 6} . באופן ספציפי יותר, לאחר שהאקסונים של OSN מודרכים לאזורי יעד משוערים, הם מופרדים ליצירת גלומרולוס באופן תלוי-תלות. מחקרים קודמים הראו כי מולקולות או לשלוט על הביטוי של המולקולות מיון האקסון, אשר להסדיר הפרדה glomerular ^{7 , 8} . יתר על כן, ראיות מצטברות עולה כי מולקולות או לייצר את קוד הזהות העצבית על ידי שילוב ייחודי של מולקולות מיון האקסון ⁹ . לכן, כדי להבין את המנגנון של הפרדת גלומרולרי תלותית, יש צורך לאפיין את הביטוי פרופילים של מיון האקסון molEcules ב OSNs.

פלואורסצנטי immunostaining היא שיטה נפוצה לדמיין את הביטוי של גנים ספציפיים. מאז חלבונים של מולקולות מיון האקסון ממוקמים בעיקר על האקסונים OSN, החוקרים צריכים להשתמש סעיפים OB לאפיין את דפוסי הביטוי שלהם OSNs. חתך העטרה של OB שימש באופן שגרתי עבור immunostaining. עם זאת, הכנה זו מאבדת את המידע הטופוגרפי לאורך הציר הקדמי-אחורי באותו קטע OB. לכן פיתחנו הכנה parasagittal של הצד המדיאלי של OB, אשר יכול לעלות כמו glomeruli רבים סביב סביב באותו סעיף OB. בשילוב עם immunostaining באמצעות נוגדנים מרובים, הכנה זו מאפשרת השוואה וניתוח של דפוסי הביטוי של אקסון מיון מולקולות ללא מכתים וריאציה בין סעיפים OB.

יתר על כן, שיטת מכתים immunohistochemical הוצגה ללא קיבוע לאחר עם PFA אטיפול סוכרוז nd. שיטה זו מאפשרת לחוקרים להשיג מספיק נתונים באיכות גבוהה מכתים לניתוח נתונים רב משתנים. הפרוטוקולים המוצגים כאן יספק פרטים על שיטות רבות עוצמה לחוקרים אשר לומדים את היווצרות מעגלים עצביים חוש הריח.

Protocol

כל ההליכים הניסיוניים בוצעו באישור ועדת האתיקה של ניסויים בבעלי חיים באוניברסיטת טוקיו ובהתאם להנחיות של אוניברסיטת טוקיו לטיפול וטיפול בבעלי מעבדה.

1. הכנת פתרונות

1. הכן 0.01 M פוספט שנאגרו מלוחים (PBS): להוסיף טבלית PBS (0.14 M NaCl, 0.0027 M KCl, 0.010 M PO ₄ ^3- , pH 7.4) ל 1 L מים מזוקקים ומערבבים ב RT עד שהוא מומס לחלוטין.
2. הכן paraformaldehyde 4% (PFA) ב PBS: להוסיף 4 גרם של PFA ל 100 מ"ל PBS. מערבבים את הפתרון ב 60 ° C עד שהוא מומס לחלוטין.
   1. לאחר המסת PFA ב PBS, להתאים את ה- pH של הפתרון 7.4 עם 1 N נתרן hydroxide (NaOH). לאחר מכן, מגניב על קרח לסנן את הפתרון באמצעות נייר סינון כדי להסיר כל חומר חלקיקי. חנות ב 4 ° C.
      זהירות: קח את הטיפול המתאים בעת שימוש אלה ריאגנטים. ידיתעם כפפות טיפול ושימוש, משקפי מגן, מעיל מעבדה תחת מכסה המנוע כימי.
      הערה: השתמש טרי 4% PFA פתרון מוכן בתוך 2 ד.
3. הכן 0.01 M PBS השלימו עם 0.3% Triton X-100 (PBST): להוסיף 3 מ"ל של טריטון X- 100 ל 997 מ"ל של PBS. מערבבים את הפתרון ב RT עד שהוא מומס לחלוטין.
4. הכן 1% ו 5% חסימת פתרון: להוסיף 10 גרם של חלב רזה ל 200 מ"ל PBST להכין 5% פתרון חסימה. מערבבים ב RT עד שהוא מומס לחלוטין. לדלל 5% חסימת פתרון חמש פעמים עם PBST להכין פתרון חוסם 1%.

2. הכנה של פרזגיטל OB סעיפים

1. השתמש בעלי חיים בין 1-2 שבועות של גיל. קבוצות גיל אלו מתאימות לניסויים הבאים משום שגלומרולי גלויים היטב וניתן לחתוך את המוח עם הגולגולת.
2. להרדים את החיה עם הזרקת intraperitoneal של pentobarbital (50 מ"ג / ק"ג משקל גוף). Perfuse החיה transcardially עם קר כקרח 4% PFA ב PBS. טיפול עם כפפות טיפול ושימוש, משקפי מגן, מעיל מעבדה תחת ברדס כימי.
3. לאחר זלוף, לחתוך את הראש עם מספריים להסיר את העור בזהירות. לאחר מכן, הכנס להב של המספריים לתוך החלל בין השיניים העליונות והתחתונות לחתוך אופקית כדי להסיר את עצם הלסת התחתונה. חתוך משם רקמת עודף עם מלקחיים ומספריים לעזוב את הרקמה חוש הריח כולל OB ו OE.
   הערה: אין להסיר את הגולגולת המקיפה את OB כמו זה שומר על glomeruli המדיאלי מיושר ישר אנכית.
4. לטבול את רקמת הריח PBS כדי להסיר את האוויר בחלל האף. חותכים את החלק האחורי של המוח אנכית ומניחים את הרקמות חוש הריח על החלק התחתון של עובש הטבעת עם הפנים חיתוך למטה. ממלאים את התבנית עם אופטימלית חיתוך טמפרטורה (OCT) המתחם ולאחר מכן לטבול את עובש לתוך חנקן נוזלי.
   1. לאחר הרקמה במתחם הוא קפוא לחלוטין, דגירה אותו cryosטאט ב -20 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות.
5. הפוך סעיפים parasagittal טורי (10 מיקרומטר) של OB עם cryostat ולאסוף אותם על ידי דבק שקופיות זכוכית מצופים MAS. לאחר הדבקה, יבש את השקופיות מיד עם מייבש מכה.

3. יום 1: Immunostaining Quadruple של פרוסות OB

1. לשטוף את השקופיות במשך 5 דקות עם PBS ב RT. חזור 3 פעמים.
2. לחסום את אתרי מחייב ספציפי על ידי דוגרים את השקופיות עבור 1 שעות עם פתרון 5% חסימה ב RT.
3. דגירה שקופיות O / N עם קוקטייל של נוגדנים ראשוניים (400 μL כל שקופית) ב 1% פתרון חסימה ב RT. השתמש בנוגדנים העיקריים הבאים: נוגדנים נגד חנקן אנטי-קירל 2 (1: 1000), נוגדן (7: 500), נוגדן עכברוש אנטי-OL-protocadherin (1: 500) ו עכבר anti-vesicular גלוטמט transporter2 (VGLUT2) נוגדן (1: 500).

4. יום 2: Immunostaining Quadrple של OBפרוסות

1. מחק את הפתרון נוגדן ראשוני לשטוף את השקופיות במשך 5 דקות עם PBST ב RT. חזור 3 פעמים.
2. לדגור את השקופיות עבור 1 שעות עם קוקטייל של נוגדנים משני (400 μL כל שקופית) PBS ב RT. השתמש נוגדנים משני הבאים: חמור אנטי עכבר אלקסה פלואור 405 (1: 400), חמור אנטי עז אלקסה פלואור 488 (1: 400), חמור נגד גינאה חזיר Alexa פלואור 555 (1: 400), חולדה אלקסה פלואורוס 647 (1: 400).
   הערה: כל נוגדנים משני צריך לבוא מאותו המין המארח. בחר אורך גל שונה של הקרינה של נוגדנים משני עבור כל נוגדן ראשוני כדי להבטיח שום חפיפה של אורכי גל.
3. מחק את הפתרון לשטוף את השקופיות במשך 5 דקות עם PBS ב RT. חזור 3 פעמים.
4. Mount coverslips על השקופיות עם המדיום הרכבה. לשם כך, להחיל 2 טיפות של המדיום הרכבה על כל שקופית, ולאחר מכן, לשים coverslip ידי הסרת בועות אוויר.

5. עוצמת אותיasurements

1. השג תמונות פלורסנט עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי. השתמש קוביות סינון הבאות: קוביית מסנן DAPI (360/40 ננומטר נרגש, 460/50 ננומטר פליטה, 400 ננומטר המראה dichroic) עבור אלקסה פלואור 405 אותות, קוביית GFP סינון (470/40 ננומטר עירור, 525/50 ננומטר פליטה, ו 495 ננומטר המראה dichroic) עבור אלקסה פלואור 488, קוביית המסנן TRITC (545/25 ננומטר עירור, 605/70 ננומטר פליטה, 565 ננומטר המראה dichroic) עבור אלקסה פלואור 555, ו C5 מסנן קובייה (620/60 ננומטר עירור, 700 / 75 ננומטר פליטה, ו 600 ננומטר המראה dichroic) עבור אלקסה פלואורם 647.
   הערה: התאם את זמן החשיפה לקבלת אותות ניאון של התמונה ללא רוויה.
2. הגדרת המבנה glomerular ידי אותות immunofluorescence של VGLUT2. למדוד את עוצמות מכתים של מולקולות מיון האקסון בתוך glomeruli עם ImageJ.

6. ניתוח נתונים

1. הפחתת האותות רקע מן עוצמות מכתים של מולקולות מיון האקסון.
2. הכן את הE נתונים מטריקס נתונים, אשר יש עמודות המורכבות של אקסון מיון מולקולות ושורות המורכבת glomeruli.
3. ביצוע ניתוח רכיב ראשי (PCA) באמצעות מערך ביטוי מוכן. לאחר מכן, לקבל את ציוני PCA, יחסי תרומה, וגורם גורם של כל רכיב העיקרי.

תוצאות

מפת גלומרולארית חוש הריח נוצרת על ידי מיקוד גלובלי ראשוני הפרדה glomerular הבאים של אקסונים OSN ^{1 , 2} . הפרדה גלומרולרית מוסדרת על ידי אינטראקציות אקסונאל דבק / דוחה בתיווך של מולקולות מיון האקסון אשר רמות הביטוי נקבעים על יד?...

Discussion

Quadostple immunostaining של parasagittal סעיפים OB אפשרה להדמיה וכימות של רמות ביטוי של רבים כמו ארבעה מולקולות מיון האקסון בו זמנית במספר גדול יותר של glomeruli. על ידי ניתוח נתונים אלה רב משתנים עם PCA, את המאפיינים של הביטוי של מולקולות אלה ניתן לשער.

?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Tablets, pH7.4	TAKARA BIO	T9181
Skim Milk	nacalai tesque	31149-75
goat anti-Sema7A antibody	R&D Systems	AF2068
rat anti-OLPC antibody	Merck Millipore	MABT20
mouse anti-VGLUT2 antibody	Merck Millipore	MAB5504
goat anti-BIG-2 antibody	R&D Systems	AF2205
gunea pig anti-Kirrel2 antibody	Operon Biotechnologies		Anti-Kirrel2 antibodies were generated by immunizing guinea pigs with KLH-conjugated synthetic peptides (644-673aa): CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP
donkey anti-mouse Alexa Fluor 405	Abcam	ab175658
donkey anti-goat Alexa Fluor 488	Jackson ImmunoResearch	705-545-003
donkey anti-guinea pig Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A21432
donkey anti-rat Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	712-605-153
Paraformaldehyde (PFA)	Wako	162-16065
MAS coated slide glasses	MATSUNAMI	MAS-01
forceps	Fine Science Tools	11253-27
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-00
dissecting scissors	Fine Science Tools	14090-09
fluorescent microscope	KEYENCE	BZ-X700
DAPI filter cube	KEYENCE	OP-87762
GFP filter cube	KEYENCE	OP-87763
TRITC filter cube	KEYENCE	OP-87764
Cy5 filter cube	KEYENCE	OP-87766
filter paper	ADVANTEC	00011185
O.C.T compound	Sakura Finetek	M71484