Immunomarquage quadruple de l'ampoule olfactive pour la visualisation des codes d'identité moléculaire des axes sensoriels olfactifs

Résumé

Les neurones sensoriels olfactifs expriment une grande variété de molécules de tri d'axones pour établir des circuits neuronaux appropriés. Ce protocole décrit une méthode de coloration immunohistochimique pour visualiser les expressions combinatoires des molécules de tri d'axones aux extrémités axonaires des neurones sensoriels olfactifs.

Résumé

Le système olfactif de souris est souvent utilisé pour étudier les mécanismes de formation de circuits neuronaux en raison de sa structure anatomique simple. Un neurone sensoriel olfactif (OSN) est une cellule bipolaire avec un seul dendrite et un seul axone non ramifié. Un OSN n'exprime qu'un seul gène de récepteur olfactif (OR), les OSN exprimant un type donné d'OR convergent leurs axones à quelques ensembles de glomérules invariants dans l'ampoule olfactive (OB). Une caractéristique remarquable de la projection OSN est que les OR exprimés jouent des rôles instructifs dans la projection axonale. Les ORs régulent l'expression de multiples molécules de tri d'axones et génèrent le code moléculaire combinatoire des molécules de tri d'axones à la terminaison axonale OSN. Ainsi, pour comprendre les mécanismes moléculaires des mécanismes de guidage de l'axone spécifiques à l'OR, il est essentiel de caractériser leurs profils d'expression au terminus de l'axone OSN dans le même glomérule. Le but de cet article était d'introduire des méthodes pour collecter autant de glomérules que possibleE sur une seule section OB et pour effectuer l'immunocoloration en utilisant plusieurs anticorps. Cela permettrait la comparaison et l'analyse des modèles d'expression des molécules de tri d'axones sans variation de coloration entre les sections OB.

Introduction

Pendant le développement, les neurones sont précisément connectés les uns aux autres pour former des circuits neuronaux appropriés, ce qui est essentiel pour la fonction cérébrale normale. Étant donné que les circuits neuronaux aberrants dans le cerveau sont considérés comme la cause de troubles mentaux tels que l'autisme et la schizophrénie, la compréhension des mécanismes de la formation de circuits neuronaux est l'un des principaux défis dans le domaine des neurosciences.

Dans le système olfactif de souris, chaque neurone sensoriel olfactif (OSN) dans l'épithélium olfactif (OE) exprime un seul gène de récepteur olfactif fonctionnel et les OSN exprimant le même OR convergent leurs axones à une paire spécifique de glomérules à des emplacements stéréotypés dans le Ampoule Olfactive (OB) ^{1 , 2} . Le système olfactif de souris est un excellent système modèle pour étudier les mécanismes moléculaires de la formation de circuits neuronaux parce que les chercheurs peuvent utiliser l'expression OR pour identifier une s spécifiqueUbtype des OSN et visualiser les sites de projection des axones OSN comme des structures glomérulaires claires. Une caractéristique remarquable de la projection OSN est que les OR jouent des rôles instructifs dans la projection des axones OSN à l'OB ^{3 , 4 , 5 , 6} . Plus précisément, après que les axones OSN sont guidés pour approximer les régions cibles, ils sont séparés pour former un glomérule de manière dépendant de l'OR. Des études antérieures ont montré que les molécules OR contrôlent l'expression des molécules de tri d'axones, qui régulent la ségrégation glomérulaire ^{7 , 8} . De plus, des preuves accumulées suggèrent que les molécules OR génèrent le code d'identité neuronal par une combinaison unique de molécules de tri axonal ⁹ . Ainsi, pour comprendre le mécanisme de la ségrégation glomérulaire dépendante de l'OR, il est nécessaire de caractériser les profils d'expression du moût de l'axoneDans les OSN.

L'immunocoloration fluorescente est une méthode commune pour visualiser l'expression de gènes spécifiques. Étant donné que les protéines des molécules de tri d'axones sont principalement localisées dans les axones OSN, les chercheurs doivent utiliser des sections OB pour caractériser leurs modèles d'expression dans les OSN. La sectionnement coronaire de l'OB a été habituellement utilisée pour l'immunocoloration. Cependant, cette préparation perd l'information topographique le long de l'axe antérieur-postérieur dans la même section OB. Nous avons donc développé une préparation parasagitique du côté médian de l'OB, qui peut monter autant de glomérules environnants que possible sur la même section OB. Combinée avec l'immunocoloration à l'aide d'anticorps multiples, cette préparation permet de comparer et d'analyser les profils d'expression des molécules de tri d'axones sans variation de coloration entre les sections OB.

En outre, une méthode de coloration immunohistochimique a été présentée sans post-fixation avec PFA aNd traitement au saccharose. Cette méthode permet aux chercheurs d'obtenir suffisamment de données de coloration de haute qualité pour une analyse de données multivariables. Les protocoles présentés ici fourniront des détails sur les méthodes puissantes pour les chercheurs qui étudient la formation du circuit neuronal olfactif.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont été réalisées avec l'approbation du comité d'éthique de l'expérimentation animale à l'Université de Tokyo et selon les directives de l'Université de Tokyo pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.

1. Préparation des solutions

1. Préparer une solution salée tamponnée au phosphate 0,01 M (PBS): ajouter un comprimé PBS (0,14 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,010 M PO ₄ ^3- , pH 7,4) à 1 L d'eau distillée et agiter à TA jusqu'à ce qu'il soit complètement dissous.
2. Préparer 4% de paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS: ajouter 4 g de PFA à 100 ml de PBS. Mélanger la solution à 60 ° C jusqu'à dissolution totale.
   1. Après dissolution du PFA dans le PBS, ajuster le pH de la solution à 7,4 avec de l'hydroxyde de sodium 1 N (NaOH). Ensuite, refroidissez sur de la glace et filtrez la solution à travers un papier filtre pour éliminer toute matière particulaire. Conserver à 4 ° C.
      Attention: prenez soin de l'utiliser lors de l'utilisation de ces réactifs. ManipulerAvec soin et utilisez des gants, des lunettes de sécurité et des manteaux de laboratoire sous un capot chimique.
      REMARQUE: Utilisez une solution fraîche de 4% de PFA préparée dans les 2 jours.
3. Préparer un PBS 0,01 M complété par Triton X-100 à 0,3% (PBST): ajouter 3 ml de Triton X-100 à 997 ml de PBS. Remuer la solution à la température ambiante jusqu'à ce qu'elle soit complètement dissoute.
4. Préparez une solution de blocage de 1% et 5%: ajouter 10 g de lait écrémé à 200 mL de PBST pour préparer une solution de blocage à 5%. Remuer à température ambiante jusqu'à ce qu'il soit complètement dissous. Diluer 5% de solution de blocage cinq fois avec du PBST pour préparer 1% de solution de blocage.

2. Préparation des sections parasagitales OB

1. Utilisez des animaux entre 1-2 semaines d'âge. Ces groupes d'âge conviennent aux expériences suivantes, car les glomérules sont clairement visibles et le cerveau peut être coupé avec le crâne.
2. Anesthésier l'animal avec une injection intrapéritonéale de pentobarbital (50 mg / kg de poids corporel). Perfuser l'animal transcardialement avec 4% de P glacéFA dans PBS. Manipuler avec précaution et utiliser des gants, des lunettes de sécurité et des manteaux de laboratoire sous un capot chimique.
3. Après la perfusion, couper la tête avec des ciseaux et retirer la peau soigneusement. Ensuite, insérez une lame des ciseaux dans l'espace entre les dents supérieures et inférieures et coupez horizontalement pour enlever la mâchoire inférieure. Découper l'excès de tissu avec des pinces et des ciseaux pour laisser le tissu olfactif, y compris l'OB et l'OE.
   REMARQUE: Ne retirez pas le crâne entourant l'OB car cela retient les glomérules médians alignés verticalement directement.
4. Immerger le tissu olfactif dans PBS pour éliminer l'air dans la cavité nasale. Couper la partie postérieure du cerveau verticalement et placer le tissu olfactif sur le fond du moule d'encastrement avec la face de coupe vers le bas. Remplissez le moule avec un composé de température de coupe optimale (OCT) puis immergez le moule dans de l'azote liquide.
   1. Après que le tissu dans le composé est complètement gelé, incuber dans les cryosTat à -20 ° C pendant 1 h.
5. Faire des sections parasagitales en série (10 μm) de l'OB avec un cryostat et les collecter en collant aux glissières en verre revêtues de MAS. Après avoir collé, sécher les glissières immédiatement avec un sèche-cheveux.

3. Jour 1: Immunomarquage Quadruple des tranches d'OB

1. Lavez les diapositives pendant 5 minutes avec du PBS à la température ambiante. Répétez 3 fois.
2. Bloquer les sites de liaison non spécifiques en incubant les diapositives pendant 1 h avec la solution de blocage à 5% à la RT.
3. Incuber les diapositives O / N avec un cocktail d'anticorps primaires (400 μL chaque glissière) dans la solution de blocage à 1% à la RT. Utilisez les anticorps primaires suivants: anticorps anti-Kirrel2 (1: 1000), anticorps contre la chèvre anti-Semaphorine-7A (Sema7A) (1: 500), anticorps anti-OL-protocadhérine (OLPC) anti-OLP (1: 500) Et l'anticorps anti-vésiculaire anti-vésiculaire de souris 2 (VGLUT2) anticorps (1: 500).

4. Jour 2: Immunomarquage Quadruple de l'OBTranches

1. Jeter la solution primaire d'anticorps et laver les diapositives pendant 5 minutes avec du PBST à la température ambiante. Répétez 3 fois.
2. Incuber les diapositives pendant 1 h avec un cocktail d'anticorps secondaires (400 μL par coulissement) dans du PBS à la RT. Utilisez les anticorps secondaires suivants: Alexa Fluor 405 (1: 400) anti-souris et anti-souris Alexa Fluor 488 (1: 400), Alexa Fluor 488 (1: 400), coquin d'angule d'âne Alexa Fluor 555 (1: 400) Rat Alexa Fluor 647 (1: 400).
   NOTE: Tous les anticorps secondaires doivent provenir des mêmes espèces hôtes. Choisissez une longueur d'onde différente de la fluorescence des anticorps secondaires pour chaque anticorps primaire afin d'éviter tout chevauchement des longueurs d'onde.
3. Jeter la solution et laver les diapositives pendant 5 minutes avec du PBS à la température ambiante. Répétez 3 fois.
4. Monter les lamelles sur les diapositives avec le support de montage. Pour cela, appliquer 2 gouttes du support de montage sur chaque glissière, puis mettre une lamelle en retirant les bulles d'air.

5. Intensity MeAsurances

1. Obtenir des images fluorescentes avec un microscope à fluorescence. Utilisez les cubes de filtre suivants: cube de filtre DAPI (excitation 360/40 nm, émission 460/50 nm et miroir dichroïque 400 nm) pour les signaux Alexa Fluor 405, cube de filtre GFP (excitation 470/40 nm, émission 525/50 nm, Et un miroir dichroïque de 495 nm) pour Alexa Fluor 488, cube de filtre TRITC (excitation de 545/25 nm, émission de 605/70 nm et miroir dichroïque de 565 nm) pour Alexa Fluor 555 et cube de filtre Cy5 (excitation de 620/60 nm, 700 / Émission de 75 nm et miroir dichroïque de 600 nm) pour Alexa Fluor 647.
   Remarque: Réglez le temps d'exposition pour obtenir des signaux fluorescents de l'image sans saturation.
2. Définir la structure glomérulaire par des signaux d'immunofluorescence de VGLUT2. Mesurer les intensités de coloration des molécules de tri d'axones dans les glomérules avec ImageJ.

6. Analyse des données

1. Soustraire les signaux de fond des intensités de coloration des molécules de tri d'axones.
2. Préparez-vousMatrice de données d'expression e, qui comporte des colonnes composées de molécules et de lignes de tri axones composées de glomérules.
3. Effectuez une analyse de composant principal (PCA) en utilisant l'ensemble de données d'expression préparé. Ensuite, obtenez les scores PCA, les ratios de cotisation et les charges factorielles de chaque composante principale.

Résultats

La carte glomérulaire olfactive est formée par un ciblage global initial et une ségrégation glomérulaire subséquente des axones ^{1 , 2} de l'OSN. La ségrégation glomérulaire est régulée par les interactions axiales adhésives / répulsives médiées par des molécules de tri axonomique dont les niveaux d'expression sont déterminés par des molécules OU ⁷ exprimées. Les molécules de tri...

Discussion

L'immunocoloration quadruple des sections OB parasagitales a permis de visualiser et de quantifier les niveaux d'expression jusqu'à quatre molécules de tri axones simultanément dans un plus grand nombre de glomérules. En analysant ces données multivariables avec PCA, les caractéristiques de l'expression de ces molécules peuvent être spéculées.

Pour une coloration réussie, la préparation des échantillons de tissu est d'une importance critique. Certains protoco...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Tablets, pH7.4	TAKARA BIO	T9181
Skim Milk	nacalai tesque	31149-75
goat anti-Sema7A antibody	R&D Systems	AF2068
rat anti-OLPC antibody	Merck Millipore	MABT20
mouse anti-VGLUT2 antibody	Merck Millipore	MAB5504
goat anti-BIG-2 antibody	R&D Systems	AF2205
gunea pig anti-Kirrel2 antibody	Operon Biotechnologies		Anti-Kirrel2 antibodies were generated by immunizing guinea pigs with KLH-conjugated synthetic peptides (644-673aa): CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP
donkey anti-mouse Alexa Fluor 405	Abcam	ab175658
donkey anti-goat Alexa Fluor 488	Jackson ImmunoResearch	705-545-003
donkey anti-guinea pig Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A21432
donkey anti-rat Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	712-605-153
Paraformaldehyde (PFA)	Wako	162-16065
MAS coated slide glasses	MATSUNAMI	MAS-01
forceps	Fine Science Tools	11253-27
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-00
dissecting scissors	Fine Science Tools	14090-09
fluorescent microscope	KEYENCE	BZ-X700
DAPI filter cube	KEYENCE	OP-87762
GFP filter cube	KEYENCE	OP-87763
TRITC filter cube	KEYENCE	OP-87764
Cy5 filter cube	KEYENCE	OP-87766
filter paper	ADVANTEC	00011185
O.C.T compound	Sakura Finetek	M71484