Quadrupla Immunostaining della lampadina olfattiva per la visualizzazione di codici di identificazione molecolare Axon sensoriale olfattiva

Riepilogo

I neuroni sensoriali olfattivi esprimono un'ampia varietà di molecole di selezione dell'assone per stabilire una corretta circuiteria neurale. Questo protocollo descrive un metodo di colorazione immunohistochemical per visualizzare le espressioni combinatorie delle molecole di selezione dell'assone all'estensione degli assoni dei neuroni sensoriali olfattivi.

Abstract

Il sistema olfattivo del mouse è spesso utilizzato per studiare meccanismi di formazione dei circuiti neurali a causa della sua semplice struttura anatomica. Un neurone sensoriale olfattivo (OSN) è una cellula bipolare con un singolo dendrite e un singolo assone sfalsato. Un OSN esprime un solo gene del recettore olfattivo (OR), OSN che esprimono un determinato tipo di OR convergono i loro assoni a pochi insiemi di glomeruli invarianti nella lampadina olfattiva (OB). Una caratteristica notevole della proiezione OSN è che gli OR espressi svolgono ruoli istruttivi nella proiezione assonale. OR regolano l'espressione di molecole multiple di asson-sorting e generano il codice molecolare combinatorio delle molecole di smistamento dell'assone alle terminazioni axon OSN. Pertanto, per comprendere i meccanismi molecolari di meccanismi di orientamento dell'asse specifico OR, è fondamentale caratterizzare i loro profili di espressione ai termini axon OSN all'interno dello stesso glomerulo. Lo scopo di questo articolo è stato quello di introdurre metodi per la raccolta di tanti glomeruli come possibiliE su una singola sezione di OB e per l'esecuzione di immunostaining usando anticorpi multipli. Ciò consentirebbe il confronto e l'analisi dei modelli di espressione delle molecole di smistamento dell'assone senza la variazione di colorazione tra le sezioni OB.

Introduzione

Durante lo sviluppo, i neuroni sono connessi tra loro per formare circuiti neurali appropriati, che sono fondamentali per la normale funzione cerebrale. Poiché i circuiti neurali aberranti nel cervello sono considerati la causa di disturbi mentali come l'autismo e la schizofrenia, la comprensione dei meccanismi di formazione dei circuiti neurali è una delle sfide più importanti nel campo della neuroscienza.

Nel sistema olfattivo del topo, ogni neurone sensoriale olfattivo (OSN) dell'Olteo olfattivo (OE) esprime un solo gene funzionale del recettore olfattivo (OR) e OSN che esprimono gli stessi OR convergono i propri assoni ad una coppia specifica di glomeruli in località stereotipate Olfactory Bulb (OB) ^{1 , 2} . Il sistema olfattivo del mouse è un eccellente sistema di modelli per studiare i meccanismi molecolari della formazione dei circuiti neurali, in quanto i ricercatori possono utilizzare l'espressione OR per identificare una specificaUbtype di OSN e visualizzare i siti di proiezione di assoni OSN come strutture chiare glomerulari. Una caratteristica notevole della proiezione OSN è che gli OR giocano ruoli istruttivi nel proiettare assoni OSN all'OB ^{3 , 4 , 5 , 6} . Più in particolare, dopo che gli assoni OSN vengono guidati per approssimare le regioni target, esse sono segregate per formare glomerulo in un modo OR dipendente. Studi precedenti hanno dimostrato che le molecole OR controllano l'espressione delle molecole di selezione dell'assone, che regolano la segregazione glomerulare ^{7 , 8} . Inoltre, l'accumulo di prove suggerisce che le molecole OR generano il codice di identità neuronale da una combinazione unica di molecole d'asson-sorting ⁹ . Pertanto, per comprendere il meccanismo della segregazione glomerulare dipendente da OR, è necessario caratterizzare i profili di espressione di molEcules in OSNs.

L'immunostaining fluorescente è un metodo comune per visualizzare l'espressione di geni specifici. Poiché le proteine ​​delle molecole di selezione dell'assone sono prevalentemente localizzate agli assoni OSN, i ricercatori devono utilizzare le sezioni OB per caratterizzare i loro pattern di espressione in OSN. La sezionatura coronale dell'OB è stata utilizzata abitualmente per l'immunostaining. Tuttavia, questo preparato perde le informazioni topografiche lungo l'asse anteriore-posteriore nella stessa sezione OB. Abbiamo quindi sviluppato una preparazione parasagittale del lato mediale dell'OB, che può montare il maggior numero possibile di glomeruli circostanti sulla stessa sezione OB. Combinata con immunostaining utilizzando anticorpi multipli, questa preparazione consente il confronto e l'analisi dei pattern di espressione delle molecole di smistamento dell'assone senza la variazione di colorazione tra le sezioni OB.

Inoltre, un metodo di colorazione immunohistochemica è stato presentato senza post-fissazione con PFA aIl trattamento con saccarosio. Questo metodo consente ai ricercatori di ottenere sufficienti dati di colorazione di alta qualità per l'analisi dei dati multivariabili. I protocolli qui presentati forniranno dettagli di potenti metodi per i ricercatori che studiano la formazione del circuito neurale olfattivo.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite con l'approvazione del comitato di etica per l'esperimento animale presso l'Università di Tokyo e secondo le linee guida dell'Università di Tokyo per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.

1. Preparazione delle soluzioni

1. Preparare una soluzione salina a base di fosfato 0,01 M (PBS): aggiungere una compressa PBS (0,14 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,010 M PO4-3, pH 7,4) a 1 L di acqua distillata e mescolare a RT finché non sia completamente sciolta.
2. Preparare 4% di paraformaldeide (PFA) in PBS: aggiungere 4 g di PFA a 100 ml di PBS. Mescolare la soluzione a 60 ° C finché non sia completamente sciolta.
   1. Dopo aver sciolto il PFA in PBS, regolare il pH della soluzione a 7,4 con 1 N idrossido di sodio (NaOH). Quindi, raffreddare sul ghiaccio e filtrare la soluzione attraverso una carta filtrante per rimuovere qualsiasi particolato. Conservare a 4 ° C.
      Attenzione: Prestare attenzione quando si utilizza questi reagenti. ManigliaCon cura e usare guanti, occhiali di sicurezza e cappotto di laboratorio sotto un cappuccio chimico.
      NOTA: Utilizzare una soluzione PFA fresca al 4% preparata entro 2 giorni.
3. Preparare 0,01 M PBS completato con 0,3% Triton X-100 (PBST): aggiungere 3 mL di Triton X-100 a 997 mL di PBS. Mescolare la soluzione a RT finché non sia completamente sciolta.
4. Preparare una soluzione di blocco del 1% e del 5%: aggiungere 10 g di latte scremato a 200 mL di PBST per preparare una soluzione di blocco del 5%. Mescolare a RT finché non sia completamente sciolto. Diluire 5 volte la soluzione di blocco del 5% con PBST per preparare una soluzione di blocco dell'1%.

2. Preparazione delle Sezioni OB Parasagittali

1. Usi animali tra 1-2 settimane di età. Questi gruppi di età sono adatti per i seguenti esperimenti perché i glomeruli sono chiaramente visibili e il cervello può essere tagliato con il cranio.
2. Anestetizzare l'animale con un'iniezione intraperitoneale di pentobarbital (50 mg / kg di peso corporeo). Perfuse l'animale transcardalmente con il ghiaccio freddo del 4% PFA in PBS. Maneggiare con cura e usare guanti, occhiali di protezione e cappotto di laboratorio sotto un cappuccio chimico.
3. Dopo la perfusione, tagliare la testa con le forbici e rimuovere la pelle con cura. Quindi, inserire una lama delle forbici nello spazio tra i denti superiore e inferiore e tagliare orizzontalmente per rimuovere la mascella inferiore. Togliere il tessuto in eccesso con pinze e forbici per lasciare il tessuto olfattivo tra cui l'OB e l'OE.
   NOTA: non rimuovere il cranio che circonda l'OB in quanto mantiene i glomeruli mediali allineati verticalmente verticalmente.
4. Immergere il tessuto olfattivo in PBS per rimuovere l'aria nella cavità nasale. Tagliare verticalmente la parte posteriore del cervello e posizionare il tessuto olfattivo sul fondo dello stampo di inserimento con il taglio verso il basso. Riempire lo stampo con il composto ottimale della temperatura di taglio (OCT) e poi immergere lo stampo in azoto liquido.
   1. Dopo che il tessuto nel composto è completamente congelato, incubarlo nel criosoTat a -20 ° C per 1 h.
5. Fare delle sezioni parasagittali seriali (10 μm) dell'OB con un criostato e li raccoglie attaccando ai vetrini MAS rivestiti di vetro. Dopo aver attaccato, asciugare le diapositive immediatamente con un essiccatore.

3. Giorno 1: Quadrupla Immunostaining delle Fibre OB

1. Lavare le diapositive per 5 min con PBS a RT. Ripetere 3 volte.
2. Bloccare i siti di legame non specifico incubando le diapositive per 1 ora con la soluzione di blocco del 5% a RT.
3. Incubare le diapositive O / N con un cocktail di anticorpi primari (400 μL ciascuna slitta) nella soluzione di blocco dell'1% a RT. Utilizzare i seguenti anticorpi primari: anticorpi anti-Kirrel2 (1: 1000), anticorpo anti-Semaphorin-7A (Sema7A) di capra (1: 500), anticorpo anti-OL-protocadherina (OLPC) di ratto (1: 500) E anti-vesicolo glutammato transporter2 (VGLUT2) anti-vescicola (1: 500).

4. Giorno 2: Quadrupla Immunostaining dell'OBfette

1. Scartare la soluzione anticorpale primaria e lavare le diapositive per 5 min con PBST a RT. Ripetere 3 volte.
2. Incubare le diapositive per 1 ora con un cocktail di anticorpi secondari (400 μL ciascuno scivolo) in PBS a RT. Utilizzare gli anticorpi secondari seguenti: anti-mouse Alexa Fluor 405 (1: 400), anti-capra di Alexa Fluor 488 (1: 400), asino antiappannamento Alexa Fluor 555 (1: 400) Ratto Alexa Fluor 647 (1: 400).
   NOTA: Tutti gli anticorpi secondari dovrebbero provenire dalla stessa specie ospitante. Scegliere una diversa lunghezza d'onda della fluorescenza degli anticorpi secondari per ogni anticorpo primario per garantire che non si sovrappongano le lunghezze d'onda.
3. Scartare la soluzione e lavare le diapositive per 5 min con PBS a RT. Ripetere 3 volte.
4. Montare le copertine sui vetrini con il supporto di montaggio. Per questo, applicare 2 gocce del supporto di montaggio su ciascuna diapositiva e quindi mettere un coperchio rimuovendo le bolle d'aria.

5. Intensità Measurements

1. Ottieni immagini fluorescenti con un microscopio a fluorescenza. Utilizzare i seguenti cubetti di filtri: cubo filtro DAPI (eccitazione 360/40 nm, emissione di 460/50 nm e specchio dicroico da 400 nm) per segnali Alexa Fluor 405, cubo filtro GFP (eccitazione 470/40 nm, emissione di 525/50 nm, E specchio dicroico da 495 nm) per Alexa Fluor 488, cubo filtrante TRITC (eccitazione 545/25 nm, emissione di 605/70 nm e specchio dicroico da 565 nm) per Alexa Fluor 555 e cubo filtro Cy5 (eccitazione 620/60 nm, 700 / Emissione di 75 nm e specchio dicroico da 600 nm) per Alexa Fluor 647.
   Nota: regolare il tempo di esposizione per ottenere segnali fluorescenti dell'immagine senza saturazione.
2. Definire la struttura glomerulare mediante segnali di immunofluorescenza di VGLUT2. Misurare le intensità di colorazione delle molecole di smistamento dell'assone all'interno di glomeruli con ImageJ.

6. Analisi dei dati

1. Sottrai i segnali di sfondo dalle intensità di colorazione delle molecole di smistamento dell'assone.
2. Preparare thE la matrice di dati di espressione, che contiene colonne composte da molecole di selezione dell'assone e da righe composte dai glomeruli.
3. Eseguire un'analisi dei componenti principali (PCA) utilizzando il set di dati espresso. Quindi, ottenere i punteggi PCA, i rapporti di contributo e carichi di fattori di ogni componente principale.

Risultati

La mappa glomerulare olfattiva è formata dal targeting globale iniziale e dalla successiva segregazione glomerulare degli assoni OSN ^{1 , 2} . La segregazione glomerulare è regolata dalle interazioni axonali adesive / repulsive mediate dalle molecole di smistamento dell'assone i cui livelli di espressione sono determinati da molecole espresse OR ⁷ . Le molecole di selezione dell'assone coinvolte ne...

Discussione

L'immunostaining quadruple delle sezioni OB parasagittali ha permesso la visualizzazione e la quantificazione dei livelli di espressione di ben quattro molecole di selezione dell'assone contemporaneamente in un numero maggiore di glomeruli. Analizzando questi dati multivariabili con PCA, le caratteristiche per l'espressione di queste molecole possono essere speculate.

Per una colorazione efficace, la preparazione del campione di tessuti è di importanza cruciale. Alcuni protocoll...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Tablets, pH7.4	TAKARA BIO	T9181
Skim Milk	nacalai tesque	31149-75
goat anti-Sema7A antibody	R&D Systems	AF2068
rat anti-OLPC antibody	Merck Millipore	MABT20
mouse anti-VGLUT2 antibody	Merck Millipore	MAB5504
goat anti-BIG-2 antibody	R&D Systems	AF2205
gunea pig anti-Kirrel2 antibody	Operon Biotechnologies		Anti-Kirrel2 antibodies were generated by immunizing guinea pigs with KLH-conjugated synthetic peptides (644-673aa): CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP
donkey anti-mouse Alexa Fluor 405	Abcam	ab175658
donkey anti-goat Alexa Fluor 488	Jackson ImmunoResearch	705-545-003
donkey anti-guinea pig Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A21432
donkey anti-rat Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	712-605-153
Paraformaldehyde (PFA)	Wako	162-16065
MAS coated slide glasses	MATSUNAMI	MAS-01
forceps	Fine Science Tools	11253-27
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-00
dissecting scissors	Fine Science Tools	14090-09
fluorescent microscope	KEYENCE	BZ-X700
DAPI filter cube	KEYENCE	OP-87762
GFP filter cube	KEYENCE	OP-87763
TRITC filter cube	KEYENCE	OP-87764
Cy5 filter cube	KEYENCE	OP-87766
filter paper	ADVANTEC	00011185
O.C.T compound	Sakura Finetek	M71484