Quadruple Immunfärbung der olfaktorischen Glühbirne zur Visualisierung von olfaktorischen sensorischen Axon Molecular Identity Codes

Zusammenfassung

Olfaktorische sensorische Neuronen exprimieren eine Vielzahl von Axon-sortierenden Molekülen, um eine korrekte neuronale Schaltung zu etablieren. Dieses Protokoll beschreibt eine immunhistochemische Färbemethode, um kombinatorische Ausdrücke von Axon-sortierenden Molekülen an den Axon-Termini von olfaktorischen sensorischen Neuronen zu visualisieren.

Zusammenfassung

Das Maus-Geruchs-System wird oft verwendet, um Mechanismen der neuronalen Schaltung Bildung wegen seiner einfachen anatomischen Struktur zu studieren. Ein olfaktorisches sensorisches Neuron (OSN) ist eine bipolare Zelle mit einem einzelnen Dendrit und einem einzigen unverzweigten Axon. Ein OSN exprimiert nur ein Olfactory Receptor (OR) Gen, OSNs, die eine gegebene Art von OR exprimieren, konvergieren ihre Axone zu einigen Sätzen von invarianten Glomeruli in der Olfactory Bulb (OB). Ein bemerkenswertes Merkmal der OSN-Projektion ist, dass die ausgedrückten ORs lehrreiche Rollen in der axonalen Projektion spielen. ODER regulieren die Expression von multiplen axon-sortierenden Molekülen und erzeugen den kombinatorischen molekularen Code von axon-sortierenden Molekülen an den OSN-Axon-Termini. Um also die molekularen Mechanismen von OR-spezifischen Axon-Guidance-Mechanismen zu verstehen, ist es wichtig, ihre Expressionsprofile an den OSN-Axon-Termini innerhalb des gleichen Glomerulus zu charakterisieren. Das Ziel dieses Artikels war es, Methoden zum Sammeln von so vielen Glomeruli wie möglich einzuführenE auf einem einzigen OB-Abschnitt und zur Durchführung von Immunfärbung mit mehreren Antikörpern. Dies würde den Vergleich und die Analyse der Expressionsmuster von axon-sortierenden Molekülen ohne Färbevariation zwischen OB-Abschnitten ermöglichen.

Einleitung

Während der Entwicklung sind die Neuronen genau miteinander verbunden, um korrekte neuronale Schaltkreise zu bilden, was für die normale Hirnfunktion entscheidend ist. Da abweichende neuronale Schaltkreise im Gehirn die Ursache von psychischen Störungen wie Autismus und Schizophrenie sind, ist das Verständnis der Mechanismen der neuronalen Kreislaufbildung eine der größten Herausforderungen auf dem Gebiet der Neurowissenschaften.

Im Maus-olfaktorischen System exprimiert jedes Olfaktorische sensorische Neuron (OSN) im Olfaktorischen Epithel (OE) nur ein funktionelles Olfaktorisches Rezeptor (OR) -Gen und OSNs, die das gleiche OR exprimieren, konvergieren ihre Axone zu einem bestimmten Paar von Glomeruli an stereotypen Stellen in der Olfaktorische Glühbirne (OB) ^{1 , 2} . Das Maus-Geruchs-System ist ein ausgezeichnetes Modellsystem für das Studium der molekularen Mechanismen der neuronalen Schaltungsbildung, da die Forscher die ODER-Expression verwenden können, um eine spezifische s zu identifizierenUbtyp von OSNs und visualisieren die Projektionsstellen von OSN-Axonen als klare glomeruläre Strukturen. Ein bemerkenswertes Merkmal der OSN-Projektion ist, dass ORs lehrreiche Rollen bei der Projektion von OSN-Axonen zum OB ^{3 , 4 , 5 , 6} spielen. Genauer gesagt, nachdem OSN-Axone zu Näherungs-Zielregionen geführt wurden, werden sie in einer ODER-abhängigen Weise zu Glomerulus segregiert. Frühere Studien haben gezeigt, dass ODER-Moleküle die Expression von axon-sortierenden Molekülen steuern, die die glomeruläre Segregation regulieren ^{7 , 8} . Darüber hinaus deutet der akkumulierende Beweis darauf hin, dass OR-Moleküle den neuronalen Identitätscode durch eine einzigartige Kombination von axon-sortierenden Molekülen ⁹ erzeugen. Um also den Mechanismus der OR-abhängigen glomerulären Segregation zu verstehen, ist es notwendig, die Expressionsprofile des axon-sortierenden mol zu charakterisierenEcules in OSNs.

Fluoreszierende Immunfärbung ist eine gängige Methode, um die Expression spezifischer Gene zu visualisieren. Da Proteine ​​von Axon-Sortiermolekülen überwiegend auf OSN-Axone lokalisiert sind, müssen Forscher OB-Sektionen verwenden, um ihre Expressionsmuster in OSNs zu charakterisieren. Der koronale Schnitt des OB wurde routinemäßig für die Immunfärbung verwendet. Diese Vorbereitung verliert jedoch die topographische Information entlang der anterior-posterioren Achse im gleichen OB-Abschnitt. Wir haben daher eine parasagittale Vorbereitung der medialen Seite des OB entwickelt, die so viele umliegende Glomeruli wie möglich auf dem gleichen OB-Abschnitt aufbringen kann. Kombiniert mit der Immunfärbung unter Verwendung mehrerer Antikörper, ermöglicht dieses Präparat den Vergleich und die Analyse der Expressionsmuster von axon-sortierenden Molekülen ohne Färbevariation zwischen OB-Sektionen.

Weiterhin wurde eine immunhistochemische Färbemethode ohne Nachfixierung mit PFA a vorgestelltSaccharosebehandlung. Diese Methode ermöglicht es Forschern, genügend qualitativ hochwertige Färbedaten für die multivariable Datenanalyse zu erhalten. Die hier vorgestellten Protokolle geben Details für leistungsstarke Methoden für Forscher, die die olfaktorische neuronale Schaltungsbildung untersuchen.

Protokoll

Alle experimentellen Verfahren wurden mit der Genehmigung des Tierversuchs Ethik-Ausschuss an der Universität von Tokio und nach der Universität von Tokio Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt.

1. Vorbereitung von Lösungen

1. 0,01 M Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) zubereiten: Eine PBS-Tablette (0,14 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,010 M PO ₄ ^3- , pH 7,4) auf 1 l destilliertes Wasser geben und bei RT rühren, bis es vollständig aufgelöst ist.
2. 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS vorbereiten: 4 g PFA zu 100 ml PBS zugeben. Die Lösung wird bei 60 ° C gerührt, bis sie vollständig aufgelöst ist.
   1. Nach dem Auflösen des PFA in PBS den pH-Wert der Lösung auf 7,4 mit 1 N Natriumhydroxid (NaOH) einstellen. Dann auf Eis abkühlen und die Lösung durch ein Filterpapier filtrieren, um Partikel zu entfernen. Bei 4 ° C aufbewahren.
      Achtung: Bei der Verwendung dieser Reagenzien Vorsicht walten lassen. GriffMit Sorgfalt und Gebrauch Handschuhen, Schutzbrillen und Laborkittel unter einer chemischen Kapuze.
      HINWEIS: Verwenden Sie frische 4% PFA-Lösung, die innerhalb von 2 d hergestellt wurde.
3. 0,01 M PBS, ergänzt mit 0,3% Triton X-100 (PBST), zubereiten: 3 ml Triton X-100 zu 997 ml PBS zugeben. Rühre die Lösung bei RT, bis sie vollständig aufgelöst ist.
4. 1% und 5% Sperrlösung vorbereiten: 10 g Magermilch zu 200 ml PBST dazugeben, 5% Sperrlösung herzustellen. Rühre auf RT, bis es vollständig aufgelöst ist. 5% Blockierungslösung fünfmal mit PBST verdünnen, um 1% Blockierungslösung herzustellen.

2. Vorbereitung der Parasagittalen OB-Sektionen

1. Verwenden Sie Tiere zwischen 1-2 Wochen alt. Diese Altersgruppen eignen sich für folgende Experimente, weil Glomeruli deutlich sichtbar sind und das Gehirn mit dem Schädel geschnitten werden kann.
2. Betäubt das Tier mit einer intraperitonealen Injektion von Pentobarbital (50 mg / kg Körpergewicht). Perfekt das Tier transkardial mit eiskalter 4% PFA in PBS. Handhabung mit Vorsicht und Handschuh, Schutzbrille und Laborkittel unter einer Chemikalienhaube.
3. Nach der Perfusion den Kopf mit einer Schere abschneiden und die Haut sorgfältig entfernen. Dann legen Sie eine Klinge der Schere in den Raum zwischen den oberen und unteren Zähnen und schneiden Sie horizontal, um den unteren Kieferknochen zu entfernen. Schneiden Sie überschüssiges Gewebe mit Pinzette und Schere ab, um das olfaktorische Gewebe einschließlich des OB und OE zu verlassen.
   HINWEIS: Entfernen Sie nicht den Schädel um den OB, da dieser die medialen Glomeruli, die vertikal gerade ausgerichtet sind, behält.
4. Tauchen Sie das olfaktorische Gewebe in PBS ein, um die Luft in der Nasenhöhle zu entfernen. Den hinteren Teil des Gehirns vertikal abschneiden und das olfaktorische Gewebe auf den Boden der Einbettungsform mit der Schneidfläche nach unten stellen. Füllen Sie die Form mit Optimal Cutting Temperature (OCT) Verbindung und tauchen Sie die Form in flüssigen Stickstoff ein.
   1. Nachdem das Gewebe in der Verbindung vollständig eingefroren ist, inkubieren Sie es in den KryosTat bei -20 ° C für 1 h.
5. Machen Sie serielle parasagittale Abschnitte (10 μm) des OB mit einem Kryostat und sammeln Sie sie, indem Sie an MAS-beschichtete Glasscheiben kleben. Nach dem Verkleben trocknen Sie die Folien sofort mit einem Fön.

3. Tag 1: Vierfache Immunfärbung der OB-Scheiben

1. Die Folien für 5 min mit PBS bei RT waschen. Wiederholen Sie 3 mal.
2. Blockieren Sie die unspezifischen Bindungsstellen durch Inkubieren der Objektträger für 1 h mit der 5% Blockierungslösung bei RT.
3. Inkubieren Sie die Folien O / N mit einem Cocktail von primären Antikörpern (400 μl jede Folie) in der 1% Blockierungslösung bei RT. Verwenden Sie die folgenden primären Antikörper: Guinea Schwein Anti-Kirrel2 Antikörper (1: 1000), Ziegen-Anti-Semaphorin-7A (Sema7A) Antikörper (1: 500), Ratten Anti-OL-Protocadherin (OLPC) Antikörper (1: 500), Und Maus anti-vesikulärer Glutamattransporter2 (VGLUT2) Antikörper (1: 500).

4. Tag 2: Vierfache Immunfärbung des OBScheiben

1. Verwerfen Sie die primäre Antikörperlösung und waschen Sie die Objektträger für 5 min mit PBST bei RT. Wiederholen Sie 3 mal.
2. Inkubieren Sie die Objektträger für 1 h mit einem Cocktail aus sekundären Antikörpern (400 μl pro Folie) in PBS bei RT. Verwenden Sie die folgenden Sekundärantikörper: Esel Anti-Maus Alexa Fluor 405 (1: 400), Esel Anti-Ziege Alexa Fluor 488 (1: 400), Esel Anti-Meerschweinchen Alexa Fluor 555 (1: 400) und Esel Anti- Ratte Alexa Fluor 647 (1: 400).
   HINWEIS: Alle sekundären Antikörper sollten von denselben Wirtsarten kommen. Wählen Sie eine andere Wellenlänge der Fluoreszenz von sekundären Antikörpern für jeden primären Antikörper, um keine Überlappung von Wellenlängen zu gewährleisten.
3. Die Lösung verwerfen und die Folien für 5 min mit PBS bei RT waschen. Wiederholen Sie 3 mal.
4. Montieren Sie die Deckel auf den Objektträgern mit dem Montagemedium. Hierzu 2 Tropfen des Aufnahmemediums auf jede Folie auftragen und dann ein Deckglas legen, indem du die Luftblasen entfernst.

5. Intensität ichAsurements

1. Erhalten Sie fluoreszierende Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop. Verwenden Sie folgende Filterwürfel: DAPI-Filterwürfel (360/40 nm Erregung, 460/50 nm Emission und 400 nm dichroitischer Spiegel) für Alexa Fluor 405 Signale, GFP Filterwürfel (470/40 nm Erregung, 525/50 nm Emission, Und 495 nm dichroitischer Spiegel) für Alexa Fluor 488, TRITC Filterwürfel (545/25 nm Erregung, 605/70 nm Emission und 565 nm dichroitischer Spiegel) für Alexa Fluor 555 und Cy5 Filterwürfel (620/60 nm Erregung, 700 / 75 nm Emission und 600 nm dichroitischer Spiegel) für Alexa Fluor 647.
   Hinweis: Stellen Sie die Belichtungszeit ein, um Fluoreszenzsignale des Bildes ohne Sättigung zu erhalten.
2. Definiere die glomeruläre Struktur durch Immunfluoreszenzsignale von VGLUT2. Messen Sie Färbungsintensitäten von axon-sortierenden Molekülen innerhalb von Glomeruli mit ImageJ.

6. Datenanalyse

1. Subtrahieren Sie Hintergrundsignale von den Färbungsintensitäten von Axon-Sortiermolekülen.
2. Vorbereitung thE-Expressions-Matrix, die Spalten aufweist, die aus axon-sortierenden Molekülen und aus den Glomeruli zusammengesetzten Zeilen bestehen.
3. Führen Sie eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) mit dem vorbereiteten Expressionsdatensatz durch. Dann erhalten Sie die PCA-Scores, Beitragsverhältnisse und Faktorbelastungen jeder Hauptkomponente.

Ergebnisse

Die olfaktorische glomeruläre Karte wird durch anfängliches globales Targeting und anschließende glomeruläre Segregation von OSN-Axonen ^{1 , 2 gebildet} . Die glomeruläre Segregation wird durch die durch axon-sortierende Moleküle vermittelten adhäsiven / abstoßenden axonalen Wechselwirkungen reguliert, deren Expressionsniveaus durch exprimierte ODER-Moleküle bestimmt werden ⁷ . Die an der glomerulä...

Diskussion

Die Quadruple-Immunfärbung von parasagittalen OB-Sektionen ermöglichte die Visualisierung und Quantifizierung der Expressionsniveaus von bis zu vier Axon-Sortiermolekülen gleichzeitig in einer größeren Anzahl von Glomeruli. Durch die Analyse dieser multivariablen Daten mit PCA können die Eigenschaften für die Expression dieser Moleküle spekuliert werden.

Für eine erfolgreiche Färbung ist die Gewebeprobenpräparation von entscheidender Bedeutung. Einige Protokolle deuten darauf hin,...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Tablets, pH7.4	TAKARA BIO	T9181
Skim Milk	nacalai tesque	31149-75
goat anti-Sema7A antibody	R&D Systems	AF2068
rat anti-OLPC antibody	Merck Millipore	MABT20
mouse anti-VGLUT2 antibody	Merck Millipore	MAB5504
goat anti-BIG-2 antibody	R&D Systems	AF2205
gunea pig anti-Kirrel2 antibody	Operon Biotechnologies		Anti-Kirrel2 antibodies were generated by immunizing guinea pigs with KLH-conjugated synthetic peptides (644-673aa): CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP
donkey anti-mouse Alexa Fluor 405	Abcam	ab175658
donkey anti-goat Alexa Fluor 488	Jackson ImmunoResearch	705-545-003
donkey anti-guinea pig Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A21432
donkey anti-rat Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	712-605-153
Paraformaldehyde (PFA)	Wako	162-16065
MAS coated slide glasses	MATSUNAMI	MAS-01
forceps	Fine Science Tools	11253-27
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-00
dissecting scissors	Fine Science Tools	14090-09
fluorescent microscope	KEYENCE	BZ-X700
DAPI filter cube	KEYENCE	OP-87762
GFP filter cube	KEYENCE	OP-87763
TRITC filter cube	KEYENCE	OP-87764
Cy5 filter cube	KEYENCE	OP-87766
filter paper	ADVANTEC	00011185
O.C.T compound	Sakura Finetek	M71484