تشريح RPE-المشيمية والشبكية البشرية لتحليل البروتين

Summary

ويتألف من مناطق متميزة وظيفيا وجزيئيا، بما في ذلك منتظمة، والبقعة، والشبكية الطرفية شبكية العين البشرية. هنا، يمكننا وصف أسلوب استخدام الخزعات لكمه والإزالة اليدوية لطبقات الأنسجة من عين بشرية لتشريح وجمع هذه المناطق الشبكية متميزة لتحليل البروتين المتلقين للمعلومات.

Abstract

شبكية العين البشرية تتألف من نيوروريتينا الحسية والكامنة وراء ظهارة المصطبغة الشبكية (RPE)، الذي الرصاصية بشدة على الطبقة تشورويد الأوعية الدموية. مناطق مختلفة من الشبكية تختلف تشريحيا وجزيئيا، تسهيل مهام فريدة من نوعها، ومما يدل على وضعية للمرض. تحليل البروتين لكل من هذه المناطق والطبقات يمكن أن توفر أفكاراً حيوية في العملية الجزيئية للعديد من الأمراض، بما في ذلك ضمور بقعي أجيريلاتيد (AMD) ومرض البول السكري والزرق. ومع ذلك، فصل مناطق الشبكية وطبقات ضروري قبل أن يمكن إنجاز تحليل كمية البروتين. هنا، نحن تصف طريقة للتشريح وجمع المناطق الشبكية نقري والقرنية، والأجهزة الطرفية والكامنة وراء مجمع RPE-المشيمية، والتي تنطوي على خزعات لكمه الإقليمية والإزالة اليدوية لطبقات الأنسجة من عين بشرية. يمكن استخدام صفحة الحزب الديمقراطي الصربي أحادي الأبعاد، فضلا عن تحليل البروتين المتلقين للمعلومات، مثل السائل اللوني-جنبا إلى جنب الكتلي (LC-MS/MS)، لتحديد البروتينات في كل طبقة الشبكية تشريح، الكشف عن المؤشرات الحيوية الجزيئية لأمراض الشبكية.

Introduction

الشبكية و RPE المشيمية هي الأنسجة المعقدة التي توضح الاختلافات الإقليمية الهامة في التعبير البروتين والوظيفة الفسيولوجية والمرضية مخطوطا^1،2. على سبيل المثال، تظهر الأمراض مثل تنكس بقعي أجيريلاتيد (AMD)، والتهاب الشبكية الصباغي، واعتلال الشبكية المصلي وسط كل الترجمة مميزة داخل منتظمة أو البقعة الشبكية الطرفية^{1،3، 4،6}. نقدم هنا، طريقة تثبت الشبكية متميزة كيف يمكن تذوق المناطق بشكل مستقل. والهدف العام لهذا الأسلوب تقديم دليل موثوق به لجمع عينات الأنسجة من المناطق نقري والقرنية والطرفية RPE-المشيمية والشبكية البشرية لتحليل البروتين. الأساس المنطقي لتطوير واستخدام هذا الأسلوب أنه من خلال تحليل البروتين هذه المناطق الشبكية محددة، قد اكتسبت رؤى الجزيئية في الوظائف الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية لهذه المناطق الهامة.

وعود هذا النهج الكشف عن أساس البروتين مخطوطا المرض الإقليمي النسبي، وتيسيرا لتحديد أهداف علاجية محددة جديدة. وفي الواقع، وفرت التحقيقات البروتين الجسم الزجاجي وتفاعلاته مع الشبكية أفكاراً رئيسية في التركيب الجزيئي ووظيفة الأنسجة السليمة والمريضة^5،،من^{78 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13}-ومع ذلك، تفتقر إلى تحليل البروتين مقارنة واضحة لمناطق الشبكية متميزة. التقنية سوف تساعد على دعم هذه الدراسات اللازم، وتوفير مزايا أكثر من غيرها من الأساليب بإظهار نهج جمع أنسجة يمكن الاعتماد عليها واستنساخه. أكثر من ذلك، النهج الوصول للغاية، مع الاستفادة من الحجم العادي ومتاحة بسهولة الأنسجة لكمه أدوات خزعة. ويؤكد لدينا تقنية مناسبة جمع وتخزين الأنسجة للبروتين التجهيز، مما يجعل من الاعتبارات الهامة للبروتين الاستقرار وتدهور. وهكذا، هذا الأسلوب الأنسب للمحققين النظر في المصب التحليل الجزيئي لعوامل البروتين.

Protocol

هذه الدراسة تمت الموافقة بجامعة آيوا ' s "مجلس المراجعة المؤسسية"، وتتمسك بالمبادئ المنصوص عليها في "إعلان هلسنكي".

1-فوفيل والقرنية خزعة لكمه

1. المفتوحة وفراشة العين البشرية، مثل أن تتكون من 4 اللوحات المنفصلة من الأنسجة، كما هو موضح في منشور سابق. ⁵
2. بدءاً بعين بشرية بوتيرفليد توضع في طبق بتري، مركز أداة خزعة لكمه 4 ملم أكثر منتظمة، اضغط لأسفل، ولفه بلطف حتى يتم إجراء شق حول منتظمة.
بعد ذلك، تولد
3. شق حول البقعة بالتوسيط والضغط أسفل أداة خزعة لكمه جلد 8 مم داخل الأروقة البقعة، وتطبيق ضغط لطيف والمتداول. هذا وسوف تنتج الطوق الخارجي، والثانية من الأنسجة المحيطة بالأول-

2. لكمه خزعة الشبكية الطرفية

1. استخدام لكمه الجلد 4 مم خزعة أداة لجعل سلسلة من اللكمات في الشبكية المحيطية، خارج الممرات. هنا، جعل اللكمات اثنين لكل رفرف رباعي-
   ملاحظة: بعد أن تصنع جميع اللكمات والعين سوف يكون اثنين من اللكمات متحدة المركز في الوسط، تمثل منتظمة والبقعة، واللكمات اثنين في قاعدة كل رفرف مجموعها 8 اللكمات في الشبكية المحيطية.

3. منتظمة وجمع خزعة البقعة

1. الأنسجة جاهز الآن لجمع وجمع جميع خزعات الأنسجة في منفصلة [ميكروفوج] أنابيب وتجميد استخدام النتروجين السائل للتجهيز النهائي. تخزين جميع العينات في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
2. استخدام ملقط Colibri منحنى 0.12 للاستيلاء على حواف أنسجة شفافة منتظمة الشبكية. جمع ورفع وفصل الأنسجة نقري من RPE-المشيمية الأساسية-
وبالمثل، استخدم
3. الملقط Colibri 0.12 إلى فهم الحلقة الخارجية لانسجة البقعة شفافة. إذا كان يزال مربوطا الأنسجة للأنسجة المجاورة أو المصدر، استخدام مقص وستكوت بعناية تقليم الحافة، التقاط مجرد عنصر الشبكية وتشريح بعيداً من أي أنسجة العصب البصري وشملت لكمه.

4. جمع الشبكية الطرفية

1. استخدام الملقط Colibri 0.12 منحنية بلطف فصل الأقراص نسيج الشبكية المحيطية RPE-المشيمية ومكان داخل الفردية [ميكروفوج] أنابيب الأساسية-
2. في حالة جل الزجاجي المتبقية، استخدام الملقط رفع وفصل هلام بعيداً بقدر الإمكان قبل جمع نسيج الشبكية. مرة واحدة قد أزيلت الشبكية، RPE-المشيمية المصطبغة لا يزال أدناه.

5. نقري وجمع RPE-المشيمية البقعة

1. الاستخدام 0.12 Colibri الملقط لفهم حواف الأنسجة المشيمية RPE الظلام التي تقع تحت مجال منتظمة إزالة. فصل هذا النسيج بعناية من الصلبة وجمع-
2. استخدام الملقط نفسه، فهم حواف الطوق الخارجي للأنسجة المشيمية RPE الظلام الكامنة في مجال إزالة البقعة الصفراء. عناية منفصلة هذا النسيج من الصلبة العينية باستيعاب الحواف في نقاط مختلفة حول الحلبة وسحب خفيفة. في نهاية المطاف، سوف تكون أخرجت حلقة الأنسجة المشيمية RPE ويمكن الحصول عليها-
   ملاحظة: الملقط الثانوية في الجهة المقابلة يمكن أن تكون مفيدة في معالجة الأنسجة المشيمية RPE أثناء الإزالة. مقص ويسكوت مثل نسيج الشبكية، يمكن أن تستخدم للمساعدة في إزالة أي أنسجة كان غير قطعي تماما باستخدام الأداة لكمه.

6. جمع المشيمية RPE الشبكية الطرفية

1. استخدام الملقط Colibri 0.12 قشر بعيداً RPE-المشيمية في المناطق الطرفية لكمه 8-
2. وضع الأنسجة المشيمية RPE في [ميكروفوج] أنابيب كما في السابق، وتجميد استخدام النتروجين السائل للتجهيز النهائي. تبقى جميع العينات في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

7. مقص التشريح

ملاحظة: إذا كانت شفرة خزعة لكمه مملة أو أداة خزعة لكمه لم يدفع ما يكفي من الثابت، قد لا توجد في الأنسجة المحيطة عمليات التطهير قطع.

1. في هذه الحالات، سيتم سحب الأنسجة بعيداً بقدر الإمكان، ومن ثم استخدام مقص وستكوت تقليم وفصل.

النتائج

يمكن معالجة الشبكية والأنسجة المشيمية RPE بطرق مختلفة لتناسب تحقيق فردية. بعد جمع، والباحث سوف تمتلك عينات من الشبكية والأنسجة المشيمية RPE من منطقة نقري والبقعة الخارجي، والشبكية الطرفية (الشكل 1). على وجه التحديد، سوف تشمل لكمه المنطقة نقري منتظمة وبارافو...

Discussion

بعد الأنسجة يتم جمع ومعالجة عينة ومعالجة الاعتبارات الحاسمة¹⁴. يفضل حفظها في النتروجين السائل على التثبيت الكيميائي، كما هذا الأخير قد ينتج عنه تلف لهيكل البروتين، التي يمكن أن تحرف تحليل المتلقين للمعلومات. بالإضافة إلى ذلك، يفضل الحفاظ على النتروجين السائل للأساليب التي ل?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-mm skin punch biopsy tool	Miltex	REF 33-34
8-mm skin punch biopsy tool	Miltex	REF 33-37
0.12 Colibri Forceps	Stephens Instruments	S5-1145
Wescott Scissors	Sklar Surgical Instruments	64-3146
Microfuge tubes	Eppendorf	#022364111	1.5 mL
Liquid Nitrogen	Praxair, Inc.	7727-37-9 [R]