Proteomic 분석에 대 한 인간의 망막과 맥락 막의 RPE의 해 부

요약

인간의 망막 fovea, 흑점, 그리고 주변 망막을 포함 하 여 기능 및 분자로 별개 영역 구성 됩니다. 여기, 펀치 생 검 및 인간의 눈에서 조직 층의 수동 제거를 사용 하 여 부하 다운스트림 proteomic 분석이 고유한 망막 영역을 수집 하는 방법을 설명 합니다.

초록

인간의 망막 혈관 맥락 막 층을 단단히 complexed은 감각 neuroretina 및 근본적인 망막 안료 상피 (RPE)의 구성 됩니다. 망막의 다른 영역은 해부학 및 분자로 독특한, 독특한 기능을 촉진 하 고 질병에 차동 민감성을 보여주는입니다. 각 이러한 영역 및 레이어 Proteomic 분석 연령 황 반 변성 (AMD), 녹 내장, 당뇨병, 등 많은 질병의 분자 과정에 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 그러나, 망막 지역과 계층의 분리 정량 proteomic 분석을 수행할 수 있습니다 전에 필수적 이다. 여기, 해 부 및 컬렉션의 시야, 황 반, 및 주변 망막 영역 및 근본적인 RPE 맥락 막 복잡 한, 지역 펀치 생 검 및 인간의 눈에서 조직 층의 수동 제거를 포함 하는 방법을 설명 합니다. 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS) 등 다운스트림 proteomic 분석 뿐만 아니라 1 차원 SDS 페이지 사용할 수 있습니다 각 해 부 망막 층에 단백질을 식별 하기 위해 망막 질환에 대 한 분자 biomarkers를 공개.

서문

망막, RPE, 및 맥락 막 단백질 표정, 생리 적 기능 및 병 적인 감정^1,2에서 중요 한 지역 차이 보여 주는 복잡 한 조직이 있습니다. 예를 들어 등 의학 황 반 변성 (AMD), 망막 화, 중심 장 액 망막 질환 각 질병 특성 지역화 fovea, 흑점, 또는 망막 주변^{1,3, 설명 4,6}. 여기, 우리가 어떻게 다른 망막 영역 수 수 독립적으로 샘플링 하지를 보여주는 방법 제시. 이 방법의 전반적인 목표 proteomic 분석에 대 한 인간의 망막 및 RPE 맥락 막 시야, 황 반, 및 주변 지역에서 조직 샘플의 컬렉션에 대 한 신뢰할 수 있는 가이드를 제공 하는 것입니다. 개발 및이 기술의 사용에 대 한 근거는 이러한 특정 망막 지역, 중요 한 분자 통찰력이이 지역의 생리 및 병 태 생리 기능에 기록 될 수 있습니다의 proteomic 분석을 통해.

이 접근에는 상대 지역 질병 감정, proteomic 기초를 공개 하 고 새로운 구체적인 치료 목표의 식별을 용이 하 게 약속 드립니다. 실제로, 유리 체 및 망막에와 함께 자사의 상호 작용의 proteomic 조사 분자 조성과 건강 하 고 병에 걸리는 조직^5,,78 의 기능에 중요 한 통찰력 제공 ^{, 9 , 10 , 11 , 12 , 그러나 13}. 별개의 망막 영역의 명확한 비교 proteomic 분석 결여 되는. 기술은 안정적이 고 재현 가능한 조직 컬렉션 접근으로 다른 방법 이상의 장점을 제공이 많이 필요한 연구를 지원 하기 위해 도움이 됩니다. 더 많은 그래서, 방식은 매우 접근 하 고, 표준 사이즈와 쉽게 사용할 수 있는 조직 펀치 생 검 도구 활용 합니다. 우리의 기술 강조 적절 한 수집 및 proteomic 처리, 단백질 안정성과 성능 저하에 대 한 중요 한 고려 사항에 대 한 조직의 저장 합니다. 따라서,이 방법은 proteomic 요인의 다운스트림 분자 분석을 고려 하 고 조사에 가장 적합 합니다.

프로토콜

이 연구는 아이오와의 대학에 의해 승인 되었다 ' s 기관 검토 위원회와 헬싱키의 선언에 명시 된 신조에 고착.

1. Foveal 및 황 반 생 검 펀치

오픈 및 나비 인간의 눈, 그것은 조직의 4 별도 플랩의 이전 게시에 설명 된 대로 구성 되어 그런
1. . ⁵
2. butterflied 육안 페 트리 접시에 배치와 함께 시작, 4 m m 펀치 생 검 도구는 fovea에 센터, 누르고는 fovea 주위 절 개를 만든 때까지 부드럽게 롤.
3. 다음, 중심 및 망막의 아케이드 내 8 m m 피부 펀치 생 검 도구를 누르고, 부드러운 압력을 적용 및 압 연 하 여 황 반 주위 절 개를 생성 합니다. 이 조직 둘러싼 첫 번째의 두 번째, 외부 반지를 생산할 예정 이다.

2. 주변 망막 생 검 펀치

아케이드 밖에 주변 망막에서 펀치의 시리즈를 만들기 위하여

1. 사용 4 mm 피부 펀치 생 검 도구. 여기, 각 사분면 플랩에 대 한 두 개의 펀치를 확인.
   참고: 모든 펀치 만들어집니다, 눈 fovea 및 망막, 대표 센터, 2 개의 동심 펀치를 가질 것이 고 두 각 플랩 총의 기지에서 펀치 후 8 펀치 주변 망막에서.

3. Fovea 및 망막 생 컬렉션

1. 조직 완충, 이제는 별도 microfuge 관에 모든 조직 생 검을 수집 하 고 액체 질소를 사용 하 여 다운스트림 처리에 대 한 고정. 활용도까지-80 ° C에서 모든 샘플을 저장.
2. 곡선된 0.12 Colibri 집게를 사용 하 여 망막 fovea의 반투명 직물의 가장자리를 잡아. 수집, 상승 하 고 근본적인 RPE 맥락 막에서 시야 조직 분리.
3. 에서는 마찬가지로 0.12 Colibri 집게를 사용 하 여 반투명 망막 직물의 외부 반지를 파악. 조직 내부 또는 인접 조직에 연결 아직도, Westcott가 위를 사용 하 여 신중 하 게 그냥 망막 구성 요소를 캡처하는 펀치에 포함 된 모든 시 신경 조직을 멀리 해 부 가장자리 트림.

4. 주변 망막 컬렉션

1. 곡선된 0.12 Colibri 집게를 사용 하 여 부드럽게 근본적인 RPE 맥락 막 및 개별 microfuge 관 내에서 주변 망막 조직 디스크 구분.
2. 잔여 유리 체 젤의 경우 리프트 젤 멀리 분리 하는 겸 자 사용 망막 직물의 수집 하기 전에 가능한 만큼 많이. 일단 망막 제거 된 안료 RPE 맥락 막 아래 남아.

5. 시야와 망막 RPE 맥락 막 컬렉션

1. 제거 fovea의 영역 아래 어두운 RPE 맥락 막 조직의 가장자리 파악 하 사용은 0.12 Colibri 집게. 조심 스럽게 sclera 및 수집에서이 조직 분리.
2. 어두운 RPE 맥락 막 조직의 제거 된 황 반 지역 기본 외부 링의 가장자리를 잡고 같은 집게를 사용 하 여. 조심 스럽게 반지 주위 다른 지점에서 가장자리를 파악 하 고 가볍게 당겨 여는 sclera에서이 조직을 구분 합니다. 결국, RPE 맥락 막 조직의 반지 dislodged 됩니다 및 수집 될 수 있습니다.
   참고: 반대 손으로 보조 겸 RPE 맥락 막 조직을 제거 하는 동안 조작에 유용할 수 있습니다. 망막 조직 처럼 웨스 콧은 위 펀치 도구를 사용 하 여 완전히 베 하지는 모든 조직을 제거에 도움을 사용할 수 있습니다.

6. 주변 망막 RPE 맥락 막 컬렉션

1. 0.12 Colibri 집게를 사용 하 여 벗 겨 8 주변 펀치 영역에서 RPE 맥락 막.
2. 이전, RPE 맥락 막 조직 microfuge 관에서 놓고 다운스트림 처리에 대 한 액체 질소를 사용 하 여 고정 합니다. 활용도까지-80 ° C에서 모든 샘플을 유지.

7. 해 부가 위

참고: 펀치 생 검 칼 날이 무딘 또는 펀치 생 검 도구는 충분히 열심히 강요 하지, 있을 수 있습니다 하지 맵시 주변 조직.

1. 이러한 경우 멀리 당겨 조직을 가능한 한 많이, 다음 Westcott가 위를 사용 하 여 장식 하 고 분리.

결과

망막 및 맥락 막의 RPE 조직 개별 조사에 맞게 다양 한 방법으로 처리할 수 있습니다. 수령 후, 연구원 망막 및 RPE 맥락 막 시야 지역, 외부 망막 및 주변 망막 (그림 1)에서 조직 샘플을가지고 것입니다. 특히, 시야 지역 펀치는 fovea, parafovea, 및 인접 한 perifovea의 작은 금액을 포함 됩니다. 황 반 펀치 perifoveal 지역 뿐만 아니라 인접 한 근처 주변 지역의 ?...

토론

조직 후 컬렉션, 샘플 처리 및 치료입니다 중요 한 고려 사항¹⁴. 액체 질소에 보존은 선호 화학 기정에 후자 손상 될 수 있습니다 다운스트림 분석을 기울일 수 있는 단백질 구조. 또한, 액체 질소 보존 샘플의 포함 하지 않는 방법을 선호입니다. 특히, 페 러 외. 4 ° C 또는 0 ° C¹⁵에 저장에 비해 상 온에서 보존 하는 뇌 샘플 사이 단백질 수준에서 큰 차이가 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-mm skin punch biopsy tool	Miltex	REF 33-34
8-mm skin punch biopsy tool	Miltex	REF 33-37
0.12 Colibri Forceps	Stephens Instruments	S5-1145
Wescott Scissors	Sklar Surgical Instruments	64-3146
Microfuge tubes	Eppendorf	#022364111	1.5 mL
Liquid Nitrogen	Praxair, Inc.	7727-37-9 [R]