דיסקציה של הרשתית האנושית ואת RPE-Choroid לניתוח פרוטיאומיה מבנית

Summary

הרשתית האנושית מורכבת מולקולרי ושאיכות אזורים הנבדלים זה מזה, לרבות fovea, macula, הרשתית ההיקפית. כאן, אנו מתארים שיטה באמצעות ניקוב ביופסיות להסרה ידנית של רקמות שכבות מן העין האנושית כדי לנתח ולאסוף אלה אזורים הנבדלים זה מזה ברשתית לניתוח פרוטיאומיה מבנית במורד הזרם.

Abstract

הרשתית האנושית מורכבת את neuroretina חישה ברשתית כבסיס פיגמנט האפיתל (RPE), אשר הוא ומורכבת בחוזקה על השכבה דמית העין כלי הדם. אזורים שונים של הרשתית מופרדים מבחינה אנטומית, מולקולרי, הקלת פונקציות ייחודיות, הוכחת דיפרנציאלית ולרגישות למחלות. ניתוח פרוטיאומיה מבנית מכל סוג של אזורים אלה שכבות יכול לספק תובנות חיוני לתהליך מולקולריים של מחלות רבות, כולל ז ניוון מקולרי (AMD), סוכרת, גלאוקומה. עם זאת, הפרדת רשתית אזורים שכבות חיוני לפני ניתוח כמותי פרוטיאומיה מבנית יכול להתבצע. כאן נתאר שיטת ניתוח ואוסף של אזורים רשתית foveal מקולרי, ציוד היקפי, שבבסיס RPE-דמית העין מורכבת, מעורבים ביופסיות אגרוף אזוריות ו להסרה ידנית של רקמות שכבות של העין האנושית. עמודים מרחביות חד-ממדי, כמו גם ניתוח פרוטיאומיה מבנית במורד הזרם, כגון ספקטרומטר מסה טנדם-כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS/MS), ניתן להשתמש כדי לזהות חלבונים בכל אחת מהשכבות ברשתית גזור, חשיפת סמנים מולקולריים של מחלות רשתית.

Introduction

הרשתית, RPE דמית העין הן רקמות מורכבות המדגימים חשוב הבדלים אזוריים ביטוי חלבון, תפקיד פיזיולוגי ו susceptibilities פתולוגית^1,2. לדוגמה, מחלות כגון ז ניוון מקולרי (AMD), רטיניטיס פיגמנטוזה, רטינופתיה הצפק במרכז כל להדגים לוקליזציה האופיינית בתוך fovea, macula, או רשתית לפריפריה^{1,3, 4,6}. כאן, אנו מציגים שיטה הוכחת כמה ברורים רשתית אזורים ניתן לטעום באופן עצמאי. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לספק מדריך אמין עבור אוסף של דגימות רקמות מאזורים foveal מקולרי, היקפי של הרשתית האנושית ואת RPE-choroid לניתוח פרוטיאומיה מבנית. הרציונל שבבסיס פיתוח, שיטה זו היא בעזרת ניתוח פרוטיאומיה מבנית מסוימת ברשתית אזורים אלה, חשוב תובנות מולקולרי עשוי להיות מושגת לתוך הפונקציות הפיזיולוגיות ו pathophysiological של אזורים אלה.

גישה זו מבטיחה לחשוף את הבסיס פרוטיאומיה מבנית מחלה אזורית יחסית susceptibilities, וכדי להקל על זיהוי מטרות טיפוליות ספציפיות חדשות. אכן, חקירות פרוטיאומיה מבנית את הזגוגיות והאינטראקציה שלו עם הרשתית סיפקו תובנות מפתח ההרכב המולקולרי והתפקוד של רקמות בריאים וחולים -^5,-^7,-^{8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13}. עם זאת, ברור השוואתי פרוטיאומיה מבנית ניתוחים של אזורים הנבדלים זה מזה ברשתית חסרים. טכניקת יעזור לתמיכה מחקרים אלו נחוצים, במתן יתרונות על פני שיטות אחרות על ידי הפגנת גישה אוסף רקמה לשחזור ואמין. ויותר מכך, הגישה היא מאוד נגיש, ניצול של רקמה בגודל סטנדרטי וזמין אגרוף כלים ביופסיה. הטכניקה שלנו מדגיש את המתאים האיסוף והאחסון של רקמות עבור פרוטיאומיה מבנית, עיבוד, ביצוע שיקולים חשובים עבור חלבון יציבות והשפלה. לפיכך, שיטה זו היא המתאימה ביותר עבור חוקרים בהתחשב במורד הזרם אנליזה מולקולרית של גורמים פרוטיאומיה מבנית.

Protocol

מחקר זה אושרה על-ידי באוניברסיטת איווה ' s מוסדיים המנהלים ונדבקת העיקרים שנקבעו את הצהרת הלסינקי.

1-Foveal ולהחטיף ביופסיה מקולרי

1. פתוח, פרפר, העין האנושית. כזה הוא מורכב 4 מדפים נפרדים של רקמות, כפי שמתואר בפרסום הקודם. ⁵
2. החל מהעין האנושית צלעות מניחים בצלחת פטרי, מרכז כלי ביופסיה אגרוף 4-מ מ מעל fovea לחץ כלפי מטה, לגלגל בעדינות עד חתך מסביב fovea.
3. הבא, יוצרים חתך באזור המקולה על ידי מרכוז, לוחץ כלי ביופסיה ניקוב עור 8 מ מ בתוך אכסדרות המקולה, הפעלת לחץ עדין מתגלגל. זה יהיה לייצר טבעת שנייה, החיצוני של רקמות המקיפים הראשונים.

2. אגרוף ביופסיה הרשתית ההיקפית

1. שימוש באיומים 4-מ מ עור כלי ביופסיה לעשות סדרה של אגרופים הרשתית ההיקפית, רק מחוץ למעבר. עושה כאן, שני אגרופים על כל מדף רביע.
   הערה: לאחר כל הדיבורים נעשים, העין יהיו שני אגרופים קונצנטריים במרכז, המייצגים את fovea macula, שני אגרופים בבסיס של כל כנף-בהיקף של 8 אגרופים ברשתית ההיקפית.

3. Fovea ואוסף ביופסיה Macula

1. כמו הרקמה עכשיו מוכן לאיסוף, לאסוף את כל ביופסיות רקמות microfuge נפרד צינורות ומקפיאים בעזרת חנקן נוזלי לעיבוד הזרם. לאחסן כל דוגמאות ב-80 מעלות צלזיוס עד ניצול.
2. להשתמש מלקחיים קוליברי 0.12 מעוקל כדי לתפוס את הקצוות של רקמה שקופה של fovea ברשתית. כדי לאסוף, לרומם, להפריד את רקמת foveal דמית-RPE הבסיסית.
באופן דומה,
3. להשתמש המלקחיים קוליברי 0.12 לתפוס את הטבעת החיצונית של הרקמה macula שקוף. אם הרקמה עדיין מחובר הרקמה הבסיסית או סמוכים, השתמש ווסטקוט מספריים לחתוך בזהירות את הקצה, לכידת רק הרכיב ברשתית, לנתח משם כל רקמות עצב הראייה כלול את האגרוף.

4. אוסף הרשתית ההיקפית

1. להשתמש המלקחיים קוליברי 0.12 מעוקל בעדינות להפריד את הדיסקים רקמת הרשתית ההיקפית RPE-דמית העין הבסיסית ואת המקום בתוך צינורות בודדים microfuge.
2. במקרה של ג'ל בזגוגית שיורית, להשתמש המלקחיים להרים ולהפריד את הג'ל משם ככל האפשר לפני אוסף של רקמת רשתית. לאחר הרשתית הוסר, דמית-RPE פיגמנט נשאר מתחת.

5. Foveal ואוסף RPE-Choroid Macula

1. שימוש 0.12 מלקחיים קוליברי לאחוז בקצוות של הרקמה RPE-שכבה דמית כהה שמתחת האזור fovea שהוסר. הפרד בזהירות את הרקמה הזאת מן בסקלרה לאסוף.
2. עם המלקחיים אותו, תופסים את הקצוות של הטבעת החיצונית של רקמות RPE-שכבה דמית כהה שבבסיס מקולרי האזור שהוסר. הפרד בזהירות זה רקמות מן בסקלרה על ידי האוחז את הקצוות בנקודות שונות מסביב לזירה ומושך בקלילות. בסופו של דבר, הטבעת של רקמות RPE-choroid יצא ממקומו, וייתכן שהוא שנאספו.
   הערה: מלקחיים משני ביד הנגדית יכול להיות שימושי לתמרן את הרקמה RPE-שכבה דמית במהלך ההסרה. כמו רקמת רשתית, מספריים Wescott יכול לשמש כדי לסייע בהסרת כל רקמת היה לא מלא חרות באמצעות הכלי אגרוף.

6. אוסף RPE-Choroid הרשתית ההיקפית

1. להשתמש המלקחיים קוליברי 0.12 הקילוף דמית-RPE באזורים היקפיים אגרוף 8.
2. כאמור, למקם את הרקמה RPE-שכבה דמית microfuge צינורות ומקפיאים בעזרת חנקן נוזלי לעיבוד במורד הזרם. לשמור כל דוגמאות ב-80 מעלות צלזיוס עד ניצול.

7. . מספריים דיסקציה

הערה: אם הלהב ביופסיה אגרוף הוא משעמם או הכלי ביופסיה אגרוף לא דחף חזק מספיק, ייתכן שאין סביבה הסוהר הרקמה.

1. במקרים אלה, למשוך את הרקמות החוצה ככל האפשר, ולאחר מכן השתמש ווסטקוט מספריים לחתוך ולהפריד.

תוצאות

אופסין # רטינל ורקמות RPE-choroid יעובד בדרכים שונות שיתאימו חקירה בודדים. לאחר אוסף, החוקר יהיה בעל דוגמאות רשתית ורקמות RPE-choroid מן האזור foveal, macula החיצוני, הרשתית ההיקפית (איור 1). באופן ספציפי, האגרוף אזור foveal יכלול את fovea, parafovea את כמות קטנה של perifovea הסמוך. המכה מק?...

Discussion

לאחר רקמת אוסף, דוגמת טיפול וטיפול הם שיקולים מכריע¹⁴. שימור בחנקן נוזלי הוא המועדף על קיבוע כימי, כפי האחרון עלול לגרום נזק למבנה חלבון, אשר יכול להטות את ניתוח במורד הזרם. בנוסף, חנקן נוזלי השימור היא המועדפת בשיטות שאינן כוללות הקפאת דגימות. ראוי לציין, פרר. et al. הראה הבדל?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-mm skin punch biopsy tool	Miltex	REF 33-34
8-mm skin punch biopsy tool	Miltex	REF 33-37
0.12 Colibri Forceps	Stephens Instruments	S5-1145
Wescott Scissors	Sklar Surgical Instruments	64-3146
Microfuge tubes	Eppendorf	#022364111	1.5 mL
Liquid Nitrogen	Praxair, Inc.	7727-37-9 [R]