Disección de la Retina humana y RPE-coroides para análisis proteómico

Resumen

La retina humana está conformada por las regiones funcionalmente y molecularmente distintas, incluyendo la fóvea, mácula y retina periférica. Aquí, describimos un método utilizando las biopsias del sacador y extracción manual de las capas de tejido de un ojo humano para diseccionar y recoger estas regiones retinianas distintas para análisis proteómico aguas abajo.

Resumen

La retina humana se compone de la neuroretina sensorial y el epitelio pigmentado retiniano subyacente (RPE), que es firmemente complexed a la capa vascular de la coroide. Diferentes regiones de la retina son anatómicamente y molecularmente distintas, facilitando funciones únicas y demostrar susceptibilidad diferencial a la enfermedad. Análisis proteómico de cada una de estas regiones y capas pueden proporcionar información vital sobre el proceso molecular de muchas enfermedades, incluyendo degeneración relacionada de Macular (AMD), diabetes mellitus y glaucoma. Sin embargo, la separación de capas y regiones retinianas es esencial antes de proceder con el análisis proteómico cuantitativo. Aquí, describimos un método de disección y recogida de la regiones retinianas periféricas, maculares y foveal y subyacente coroides RPE complejo, involucrando a las biopsias del sacador regional y extracción manual de las capas de tejido de un ojo humano. Unidimensional de SDS-PAGE, así como análisis proteómicos aguas abajo, como líquido cromatografía-tandem espectrometría de masas (LC-MS/MS), pueden utilizarse para identificar proteínas en cada capa retiniana disecada, revelar biomarcadores moleculares de la enfermedad retiniana.

Introducción

La retina, EPR y coroides son tejidos complejos que muestran importantes diferencias regionales en la expresión de proteínas, función fisiológica y patológica susceptibilidad^1,2. Por ejemplo, enfermedades como la degeneración relacionada de Macular (AMD), retinitis pigmentosa y la retinopatía serosa central demuestran características localización dentro de la fóvea, mácula o retina periferia^{1,3, 4,6}. Aquí, presentamos un método de demostración de retina cómo distinta regiones pueden ser muestreadas independientemente. El objetivo general de este método es proporcionar a una guía confiable para la recolección de muestras de tejido de las regiones periféricas, maculares y foveal de la retina humana y la RPE-coroides para análisis proteómico. El fundamento para el desarrollo y uso de esta técnica es a través de análisis proteómico de estas regiones retinianas específicas, importantes penetraciones moleculares pueden obtenerse en las funciones fisiológicas y fisiopatológicas de estas regiones.

Este enfoque promete revelar la base proteómicos para susceptibilidad de enfermedad regional relativa y para facilitar la identificación de nuevas dianas terapéuticas específicas. De hecho, las investigaciones proteómicas de vítreo y sus interacciones con la retina han proporcionado ideas claves en la composición molecular y función del tejido sano y enfermo^{5,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13}. sin embargo, se carecen de análisis proteómicos claro comparativo de distintas regiones retinianas. La técnica ayuda a apoyar estos estudios necesaria, ofreciendo ventajas sobre otros métodos demostrando un enfoque de la colección de tejido fiable y reproducible. Más aún, el enfoque es muy accesible, tomando ventaja de sacador de tejido de tamaño estándar y disponible herramientas de biopsia. Nuestra técnica hace hincapié en la adecuada recolección y almacenamiento de tejidos para proteómica de procesamiento, haciendo consideraciones importantes para la estabilidad de la proteína y la degradación. Así, este método es más apropiado para investigadores teniendo en cuenta posterior análisis molecular de factores proteómicos.

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Protocolo

este estudio fue aprobado por la Universidad de Iowa ' s Junta de revisión institucional y se adhiere a los principios enunciados en la declaración de Helsinki.

1. punzón de biopsia Macular y Foveal

1. libre y mariposa, el ojo humano, que consta de 4 aletas separadas de los tejidos, como se describe en una publicación anterior. ⁵
2. partir de un ojo humano abierto colocado en caja Petri, centro de una herramienta de biopsia punch de 4 mm sobre la fóvea, presione hacia abajo y rodar suavemente hasta que se hace una incisión alrededor de la fóvea.
3. a continuación, generar una incisión alrededor de la mácula centrado y presionando hacia abajo de una herramienta de biopsia punch de piel de 8 mm dentro de las arcadas de la mácula, aplicando una presión suave y balanceo. Esto producirá un anillo de tejido que rodea la primera segunda, exterior.

2. Punch de biopsia retiniana periférica

1. uso el punch de piel de 4 mm herramienta de biopsia a realizar una serie de golpes en la retina periférica, a las afueras de la galería. Aquí, hacer dos golpes para cada aleta del cuadrante.
   Nota: Después de que se hacen todos los golpes, el ojo tendrá dos golpes concéntricos en el centro, representando a la fóvea y la mácula, y dos golpes en la base de cada aleta-un total de 8 golpes en la retina periférica.

3. Fóvea y la mácula biopsia colección

1. el tejido está listo para la colección, recoge todas las biopsias de tejido en los tubos del microfuge separado como congelación con nitrógeno líquido para el proceso aguas abajo. Almacenar las muestras a-80 ° C hasta utilización.
2. Utilizar un fórceps curvo de Colibri 0.12 para agarrar los bordes del tejido translúcido de la fóvea retiniana. Recopilar, elevar y separar el tejido foveal de la RPE-coroides subyacente.
3. Del mismo modo, usar la pinza Colibri 0,12 agarrar el anillo externo de tejido translúcido de la mácula. Si el tejido está todavía conectado a tejidos adyacentes o subyacentes, utilice un par de tijeras de Westcott para cortar cuidadosamente el borde, capturar sólo el componente retiniano y disección a cualquier tejido del nervio óptico en el punzón.

4. Colección de Retina periférica

1. utilizar el fórceps curvado de Colibri 0,12 suavemente separar los discos de tejido retiniano periférico de la RPE-coroides subyacente y el lugar dentro de los tubos del microfuge individuales.
2. En el caso del gel vítreo residual, utilizar el fórceps para levantar y separar el gel lejos tanto como sea posible antes del tejido retiniano. Una vez que la retina se ha eliminado, la RPE-coroides pigmentada es inferior a.

5. Foveal y mácula RPE-coroides colección

1. pinzas de Colibri uso el 0.12 que sujete los bordes del tejido coroides RPE oscuro que se encuentra debajo de la zona de la fóvea quitada. Separar cuidadosamente este tejido de la esclerótica y la recoge.
2. Utilizando las mismas pinzas, sujete los bordes del anillo externo de oscuro tejido de RPE-coroides subyacente del área macular quitado. Cuidadosamente Separe este tejido de la esclerótica sujetando los bordes en diferentes puntos alrededor del anillo y tirar suavemente. Finalmente, el anillo de tejido coroides RPE se retirar y se puede recoger.
   Nota: Secundarias pinzas en la mano contraria pueden ser útiles en la manipulación del tejido coroides RPE durante la extracción. Como el tejido retiniano, tijeras de Wescott se pueden utilizar para ayudar en la eliminación de cualquier tejido que no fue incidida completamente usando la herramienta del sacador.

6. Colección de RPE-coroides Retina periférica

1. utilizar el fórceps Colibri 0,12 para despegar la coroides RPE en las áreas periféricas punch 8.
2. Anteriormente, coloque el tejido de RPE-coroides en tubos de microcentrífuga y congelar con nitrógeno líquido para el proceso aguas abajo. No todas las muestras a-80 ° C hasta su utilización.

7. Tijera de disección

Nota: si las cuchillas de biopsia punch es embotada o la herramienta de biopsia punch no es empujada lo suficientemente dura, puede que no haya un corte limpio que rodea el tejido.

1. En estos casos, separe el tejido lo más posible y luego usar tijeras de Westcott para recortar y separar.

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Resultados

Tejido de RPE-coroides y retiniana pueden procesarse de varias maneras a una investigación individual. Después de la recolección, el investigador contará con muestras de retina y coroides RPE tejido de la región foveal, exterior mácula y retina periférica (figura 1). Específicamente, el golpe de la región foveal incluirá la fóvea, el parafovea y una pequeña cantidad de la perifovea adyacente. El punzón macular incluye el resto de la región perif...

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Discusión

Después de tejido obtención muestra y tratamiento son consideraciones cruciales¹⁴. Conservación en nitrógeno líquido se prefiere sobre la fijación química, como este último puede resultar en daños a la estructura de la proteína, que podría sesgar el análisis descendente. Además, conservación de nitrógeno líquido se prefiere a los métodos que no implican la congelación de las muestras. En particular, Ferrer et al mostraron diferencias significativas en los niveles de prot...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-mm skin punch biopsy tool	Miltex	REF 33-34
8-mm skin punch biopsy tool	Miltex	REF 33-37
0.12 Colibri Forceps	Stephens Instruments	S5-1145
Wescott Scissors	Sklar Surgical Instruments	64-3146
Microfuge tubes	Eppendorf	#022364111	1.5 mL
Liquid Nitrogen	Praxair, Inc.	7727-37-9 [R]