Dissecação da Retina humana e RPE coroide para análise proteômica

Resumo

A retina humana é composta de regiões funcionalmente e molecularmente distintas, incluindo a fóvea, mácula e retina periférica. Aqui, descrevemos um método usando o soco de biópsias e remoção manual das camadas de tecido do olho humano para dissecar e coletar estas regiões distintas da retina para análise proteômica a jusante.

Resumo

A retina humana é composta da neuroretina sensorial e o epitélio pigmentado da retina subjacente (RPE), que é complexado com firmeza à camada vascular da coroide. Diferentes regiões da retina são anatomicamente e molecularmente distintas, facilitando as funções originais e demonstrando o diferencial susceptibilidade à doença. Análise proteômica de cada uma destas regiões e camadas pode fornecer insights vitais sobre o processo molecular de muitas doenças, incluindo Age-Related Degeneração Macular (AMD), diabetes mellitus e glaucoma. No entanto, separação de camadas e regiões da retina é essencial antes de análise proteômica quantitativa pode ser realizado. Aqui, descrevemos um método para dissecção e coleção de regiões da retina central, periféricas e maculares e subjacentes RPE coroide complexo, envolvendo regional soco biópsias e remoção manual das camadas de tecido do olho humano. Unidimensional de SDS-PAGE, bem como análise de proteomic a jusante, tais como líquida espectrometria de massa em tandem-cromatografia (LC-MS/MS), pode ser usado para identificar proteínas em cada camada da retina dissecada, revelando moleculares biomarcadores para doenças da retina.

Introdução

A retina, RPE e coroide são tecidos complexos que demonstram diferenças regionais importantes na expressão de proteínas, função fisiológica e patológica suscetibilidades^1,2. Por exemplo, doenças como a Degeneração Macular Age-Related (AMD), retinite pigmentosa e retinopatia serosa central cada demonstram característica localização dentro da fóvea, mácula ou retina periferia^{1,3, 4,6}. Aqui, apresentamos um método demonstrando como distinta da retina regiões podem ser degustadas de forma independente. O objetivo geral deste método é fornecer um guia confiável para coleta de amostras de tecido da região macular, Central e periférica da retina humana e RPE coroide para análise proteômica. A justificativa para o desenvolvimento e a utilização desta técnica é que através da análise de proteomic destas regiões específicas da retina, importante introspecções moleculares podem ser adquiridas para as funções fisiológicas e fisiopatológicas destas regiões.

Esta abordagem promete revelar a base de proteomic para suscetibilidades doença regional relativo e para facilitar a identificação de novos alvos terapêuticos específicos. Com efeito, proteomic investigações sobre o vítreo e suas interações com a retina forneceu insights-chave na composição molecular e função dos tecidos saudáveis e doentes^{5,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13}. no entanto, análises de proteomic nítida de distintas regiões da retina são escassos. A técnica vai ajudar a apoiar estes estudos muito necessária, proporcionando vantagens sobre outros métodos demonstrando uma abordagem de coleta de tecido confiável e reprodutível. Mais ainda, a abordagem é muito acessível, aproveitando-se do ponche de tecido tamanho padrão e prontamente disponíveis a ferramentas de biópsia. Nossa técnica enfatiza a recolha e armazenamento de tecidos para proteomic processamento, fazendo considerações importantes para a estabilidade da proteína e degradação. Assim, este método é mais adequado para os investigadores a jusante análise molecular de proteomic factores a considerar.

Protocolo

este estudo foi aprovado pela Universidade de Iowa ' s Conselho de revisão institucional e adere aos princípios estabelecidos na declaração de Helsinque.

1. Foveal e Macular soco biópsia

1. aberto e borboleta olho humano, que consiste em 4 diferentes retalhos de tecido, conforme descrito em uma publicação anterior. ⁵
2. começando com um borboleta olho humano colocado em uma placa de Petri, centralize uma ferramenta de biópsia do perfurador de 4 mm sobre a fóvea, pressione para baixo e role suavemente até que uma incisão é feita ao redor da fóvea.
3. Em seguida, gerar uma incisão ao redor da mácula centralização e pressionando para baixo uma ferramenta de biópsia do perfurador de 8 mm da pele dentro das arcadas do macula, aplicando uma pressão suave e rolamento. Isto produzirá um anel exterior, segundo do tecido circundante a primeira.

2. Soco de biópsia da retina periférica

ferramenta de biópsia

1. uso o soco de 4 milímetros da pele para fazer uma série de socos na retina periférica, apenas fora da arcada. Aqui, fazer dois socos para cada aba quadrante.
   Nota: Depois de todos os golpes são feitos, o olho terá dois socos concêntricos no centro, representando a fóvea e macula, e dois socos na base de cada aba-totalizando 8 socos na retina periférica.

3. Fóvea e coleção de biópsia Macula

1. como o tecido está agora pronto para coleta, coletar todas as biópsias de tecido em tubos de microcentrífuga separado e congelamento com nitrogênio líquido para processamento a jusante. Armazenar todas as amostras a-80 ° C até utilização.
2. Use uma pinça de Colibri 0.12 curvo para pegar as bordas do tecido translúcido da fóvea da retina. Para coletar, elevar e separar o tecido central do RPE-coroide subjacente.
3. Da mesma forma, use a pinça Colibri 0,12 para agarrar o anel exterior do tecido translúcido mácula. Se o tecido ainda está anexado ao tecido subjacente ou adjacente, usar um par de tesoura Westcott para aparar cuidadosamente a borda, capturando apenas o componente da retina e dissecando afastado qualquer tecido de nervo óptico incluído no ponche.

4. Coleção de Retina periférica

1. usar os fórceps de Colibri 0,12 curvados delicadamente, separar os discos de tecido da retina periférica da RPE coroide subjacente e coloque dentro de tubos de microcentrífuga individuais.
2. No caso do gel vítreo residual, use a pinça para levantar e separar o gel fora tanto quanto possível antes da coleta do tecido retinal. Uma vez que a retina foi removida, a pigmentada RPE-coroide permanece abaixo.

5. Central e Macula RPE coroide coleção

1. uso a 0,12 Colibri fórceps para apreender as bordas do tecido RPE coroide escuro que se encontra abaixo da área da fóvea removida. Separe com cuidado este tecido da esclera e coletar.
2. Usando a pinça mesma, segure as bordas do anel externo de tecido de RPE coroide escuro subjacente a área macular removida. Separe com cuidado este tecido da esclera, segurando as bordas em pontos diferentes ao redor do anel e puxando levemente. Eventualmente, o anel de tecido RPE coroide vai ser desalojado e podem ser coletado.
   Nota: Fórceps secundário na mão oposta pode ser útil em manipular o tecido RPE coroide durante a remoção. Como o tecido da retina, Wescott tesoura pode ser usada para auxiliar na remoção de qualquer tecido que não foi totalmente incisão usando a ferramenta do perfurador.

6. Coleção de RPE coroide Retina periférica

1. usar a pinça Colibri 0,12 para descascar o RPE-coroide nas 8 áreas periféricas soco.
2. Como anteriormente, coloque o tecido de RPE coroide em tubos de microcentrífuga e congelamento com nitrogênio líquido para processamento a jusante. Manter todas as amostras a-80 ° C até utilização.

7. Dissecação de tesoura

Nota: se a lâmina de biópsia do perfurador é maçante ou a ferramenta de biópsia do perfurador é empurrada não dura o suficiente, pode não haver um Clean-Cut o tecido circundante.

1. Nestes casos, afastar o tecido tanto quanto possível e em seguida, use tesoura Westcott para aparar e separar.

Resultados

Tecido de RPE coroide e da retina podem ser processadas de várias maneiras, de acordo com uma investigação individual. Após a coleta, o pesquisador possuirá amostras da retina e RPE coroide tecido da região central, exterior mácula e retina periférica (Figura 1). Especificamente, o soco de região central incluirá a fóvea, o parafovea e uma pequena quantidade do perifovea adjacente. O soco macular inclui o restante da região perifoveal, bem como um...

Discussão

Depois de tecido recolha, manipulação de amostra e tratamento são cruciais considerações¹⁴. Preservação em nitrogênio líquido é preferida por fixação química, como o último pode resultar em danos à estrutura da proteína, que pode distorcer a análise a jusante. Além disso, a preservação de nitrogênio líquido é preferencial para métodos que não envolvem o congelamento de amostras. Notavelmente, Ferrer et al mostraram diferenças significativas nos níveis de proteí...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-mm skin punch biopsy tool	Miltex	REF 33-34
8-mm skin punch biopsy tool	Miltex	REF 33-37
0.12 Colibri Forceps	Stephens Instruments	S5-1145
Wescott Scissors	Sklar Surgical Instruments	64-3146
Microfuge tubes	Eppendorf	#022364111	1.5 mL
Liquid Nitrogen	Praxair, Inc.	7727-37-9 [R]