قياس مستويات مرناً على مر الزمن من خلال "الاستجابة" الخميرة التاكسج S. cerevisiae

Summary

نقدم هنا، بروتوكول باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي لرصد مستويات مرناً على مر الزمن من خلال استجابة الخلايا S. cerevisiae التاكسج. هذا الأسلوب يمكن تكييفها لتحليل التعبير الجيني أثناء أي الاستجابة الخلوية.

Abstract

التغييرات المعقدة في التعبير الجيني التوسط عادة جزءا كبيرا من الاستجابة الخلوية. قد تتغير كل الجينات التعبير مع حركية فريدة الجينات يخضع لتوقيت معين واحد من العديد من المحفزات، مما يشير إلى الممرات أو الآثار الثانوية. من أجل التقاط الجين كامل استخدمت التعبير استجابة لنقص في الخميرة S. cerevisiae، تحليل الحمض النووي الريبي seq لرصد مستويات مرناً لجميع الجينات في أوقات معينة بعد التعرض لنقص. أنشأت نقص نمو الخلايا في الغاز₂ ~ 100% N. الأهم من ذلك، خلافا لغيرها من الدراسات التاكسج، ارجوستيرول، والأحماض الدهنية غير المشبعة لا أضيفت إلى وسائل الإعلام لأن تؤثر هذه المستقلبات في التعبير الجيني. وقد اختيرت النقاط الزمنية في نطاق 0-4 ح بعد نقص نظراً لأن تلك الفترة يلتقط التغييرات الرئيسية في التعبير الجيني. في كل مرة نقطة، سجل منتصف التاكسج الزنزانات بسرعة تصفيتها، وتجميد، والحد من التعرض للتغيرات س₂ وملازم في التعبير الجيني. مجموع الحمض النووي الريبي المستخرج من الخلايا واستخدامه لإثراء مرناً، ثم حولتها إلى كدنا. من هذا كدنا، تم إنشاء مكتبات متعددة وكانت متسلسلة عينات ثمانية أو أكثر في حارة واحدة من المنظم الجيل القادم. يرد وصف خط أنابيب بعد انتهاء تسلسل، التي تشمل نوعية قاعدة التشذيب، قراءة الخرائط وتحديد عدد القراءات كل الجينات. واستخدمت DESeq2 داخل بيئة التطوير الإحصائي لتحديد الجينات التي تتغير بشكل كبير في أي من النقاط الزمنية التاكسج. وكشف تحليل لثلاثة replicates البيولوجي إمكانية تكرار نتائج عالية، وجينات حركية مختلفة وعدد كبير من المتوقع س₂-تنظيم الجينات. هذه الأساليب يمكن استخدامها لدراسة كيفية استجابة خلايا الكائنات الحية المختلفة لنقص على مر الزمن وتكييفها لدراسة التعبير الجيني أثناء الاستجابات الخلوية الأخرى.

Introduction

العديد من الكائنات الحية يستجيب لنقص أو انخفاض س₂، بتغيير الجينات التعبير ^1،،من²³. هذا الرد يساعد على التعامل مع عدم وجود ركيزة حاسمة للتنفس الهوائي وردود الفعل السكروز عدة، ولكن أيضا مع حالة الأكسدة متغيرة ⁴خلايا. تظهر عدة دراسات ميكرواري أداؤها في S. cerevisiae أن مستويات مرناً لمئات جينات تتغير استجابة لنقص ^5،،من^67،،من^{89 , 10 , 11 , 12}-في الآونة الأخيرة، تم استخدام تسلسل الحمض النووي الريبي لوصف التغييرات التعبير الجيني مع مرور الوقت من خلال نقص ¹³. هنا، يتم عرض تفاصيل التجريبية ومناقشتها.

نقص يمكن أن يتحقق بطرق مختلفة، كل منها مستوى مختلف من س₂إنتاج. هنا، أنشأت تتدفق باستمرار نقص فائقة عالية النقاء ن₂ في قوارير، مما يقلل من [س₂] حله فورا مع حركية استنساخه ¹⁰. فمن الممكن أن هناك بعض س₂ جزيئات الحالية التي تساهم في التعبير الأيض والجينات ولكن هذه البيئة يعتبر جداً قريبة من اللاهوائية. نظراً لغياب س₂، لا خلايا الخميرة الهيم biosynthesize، ارجوستيرول، والأحماض الدهنية غير المشبعة ^4،،من¹²¹⁴. وهكذا، شملت الدراسات السابقة هذه المستقلبات عندما تنمو الخميرة دون أكسجين ^5،،من¹⁰¹⁵. بيد الكثير من الردود التاكسج هي توسط استنفاد هذه المستقلبات وتجديد لهم ومن ثم عكس التعبير الجيني التاكسج الردود ^12،16. أجل تقليد نقص الطبيعية، لم يتم إضافة هذه المستقلبات لوسائل الإعلام. في وقت قصير أن الخلايا قد تعرضت لنقص دون وجود نواتج الأيض الأساسية هذه، كان هناك لا زيادة ملحوظة في موت الخلية (البيانات لا تظهر) ولا استجابة إجهاد طويلة ¹³.

الاستجابة أيضا يعتمد على السلالة وعن النمط الوراثي. أهمية خاصة الآليلات المنظمين المعروفة من الردود التاكسج ². الخلفية سلالة S288C المطلوب هو درجة عالية حيث أن نتائج يمكن مقارنتها بغيرها من الدراسات الجينومية تنفيذها مع هذه السلالة. ومع ذلك، يتضمن S288C اليل فقدان لوظيفة جزئية من HAP1 الجينات ¹⁷، منظم النسخي حرجة للاستجابة التاكسج. تم إصلاح هذا اليل في S288C wildtype باستخدام نسخة من Σ1278b سلالة الخلفية ¹¹.

التعبير الجيني تعتمد اعتماداً كبيرا على البيئة الخلوية. وهكذا، عند إجراء تحليل مرناً على نطاق الجينوم، المهم الحفاظ على بيئة ثابتة بينما متفاوتة معلمة أخرى مثل الوقت أو الحافز أو الوراثي. لتحقيق نتائج عالية استنساخه، النظر في هذه الممارسات الثلاث للدراسة وجميعها لها replicates البيولوجية أو التقنية. أولاً، experimenter(s) نفسه ينبغي الاضطلاع بهذه الدراسة، حيث قد تختلف الممارسات التقنية عبر المجربون. ثانيا، ينبغي استخدام نفس الدفعة من المكونات في وسائط النمو ككل دفعة بتشكيل مختلف قليلاً يمكن أن يؤثر على التعبير الجيني. ثالثا، للتقليل من آثار دورة الخلية، كل نقطة مرة ينبغي أن يتألف من خلايا غير متزامن في سجل منتصف مرحلة النمو (1-2 × 10⁷ خلايا/مل).

عندما وصف استجابة معقدة مثل الاستجابة التعبير الجيني لنقص، دورة وقت مفيد لتحديد حركية الأحداث المختلفة. وينبغي اختيار النقاط الزمنية المحددة التي سيتم التقاط التغييرات الرئيسية للاستجابة. في هذه الدراسة، لوحظت النقاط الزمنية بين 0 وح 4، لأن التجارب الماضية كشفت عن تغييرات واسعة النطاق في التعبير الجيني خلال هذه الفترة ¹³.

وكان تسلسل الحمض النووي الريبي لقياس التعبير الجيني العالمي، المستخدمة ^18،19. يستخدم هذا الأسلوب تسلسل الجيل القادم لتحديد الوفرة النسبية للنسخة الجينات كل. مقارنة لتحليل الحمض النووي ميكرواري، يسلك تسلسل الحمض النووي الريبي حساسية أعلى (للكشف عن النصوص أقل وفرة)، أكبر مجموعة ديناميكية (لقياس أكبر إضعاف التغييرات) وإمكانية تكرار نتائج متفوقة (أن تتبع بدقة التعبير الجيني على مر الزمن). عادة ما يكون هو الحمض النووي الريبي الخلوية الأكثر الرنا الريباسي قد وضعت أساليب كثيرة لإثراء للحمض النووي الريبي محددة الأنواع ²⁰. هنا، واستخدمت خرز بولي-T لتنقية بولي-A التي تحتوي على نصوص مرناً، على الرغم من مختلف تجارياً-مجموعات استنفاد الرنا الريباسي متاح يمكن أيضا أن تكون فعالة في إثراء مرناً.

هنا، اتسم رد التعبير الجيني S. cerevisiae لنقص. كانت تتعرض لنقص الخلايا وثم أخذ عينات في ثماني نقاط زمنية (0، 5، 10، 30، 60، 120، 180 و 240 دقيقة). للتأكد من إمكانية تكرار نتائج وتحديد النصوص المتغيرة إحصائيا، أجريت ثلاث replicates البيولوجية. الجيش الملكي النيبالي المستخرجة بواسطة تعطيل الميكانيكية وتنقية العمود، وثم تجهيزها لتحليل الحمض النووي الريبي seq. يتم وصف خط الأنابيب بعد انتهاء التسلسل وترد البرمجة النصية التي تسمح لإجراء النسخ المتماثل المحدد من التحليلات. تريموماتيك ²¹TopHat2 ²²، هتسيق ²³، البيئة الإحصائية ص ²⁴و حزمة DESeq2 ²⁵ وعلى وجه التحديد، استخدمت لمعالجة البيانات تسلسل الحمض النووي الريبي وتحديد الجينات 607 التي تغير بشكل ملحوظ خلال نقص. تحليل العنصر الرئيسي (PCA) والتعبير الجيني replicates أشارت إلى إمكانية تكرار نتائج هذا الأسلوب. كشف المجموعات و heatmaps حركية التعبير واسعة النطاق، بينما أظهر التحليل الجيني علم الوجود (GO) أن العديد من العمليات الخلوية، مثل التنفس الهوائي، وهي أثرت في مجموعة الجينات التي تنظم الأكسجين.

Protocol

1-حمل نقص

1. يوم واحد أو أكثر قبل الدورة نقص الوقت: إعداد الحاضنات، والخلية تصفية نظام الفراغ وخزان الغاز، قوارير، سدادات، الأنابيب الزجاجية، والأنابيب، كما هو الحال في جدول المواد.
2. مكان N₂ دبابة وحاضنة، والفراغ وتصفية النظام على مقربة، لتمكين المعالجة السريعة للخلايا.
3. تحضير الوسائط YPD سائل معقم (1% "استخراج الخميرة"، ببتون 2%، 2% جلوكوز) بخلط المكونات في زجاجة والتعقيم.
4. خطة تخطيط قوارير في الحاضنة.
   ملاحظة: من خزان₂ N، ستكون قارورة أول فخ مياه، قارورة الثانية ستكون النقطة المرة الأخيرة، قارورة الثالثة سوف تكون النقطة المرة الثانية والأخيرة وهلم جرا حتى قارورة الأخير الذي فخ مياه نهائية. ويبين الشكل 1 بالترتيب واتصالات بين قوارير.
5. في اليوم السابق أثناء الوقت، تطعيم مستعمرة خميرة إلى ثقافة 5 مل سائل YPD داخل أنبوب اختبار عقيمة. على وجه التحديد، تلتقط مستعمرة كاملة من لوحة باستخدام عصا قضيب عقيمة. ضع العصا في YPD السائلة ويهز العصا حتى معظم الخلايا في التعليق.
6. تدوير أنابيب عند 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها (ح ~ 16).
   ملاحظة: بعد ح 16، ستحقق الخلايا wildtype تشبع (~ 2 × 10⁸ خلايا/مل)، وأشارت إلى قيام ثقافة غائم جداً. قد يستغرق وقتاً أطول للوصول إلى التشبع السلالات الأخرى وينبغي اختبار قياس تركيز الخلية مع جهاز المطياف الضوئي، كما هو مبين في الخطوة 1.9.4.
7. اليوم بالطبع الوقت، بعد ح 16 من الحضانة، تضعف ثقافة مشبعة 01:50 باستخدام بيبيت 5 مل إلى 4 مل من مكان بين عشية وضحاها الثقافة إلى 196 مل من السائل YPD داخل قارورة معقمة 500 مل. تنمو مع الهز ~ 200 لفة في الدقيقة ح 4 في 30 درجة مئوية.
   ملاحظة: بعد ح 4، سيصل إلى ثقافة wildtype تركيز سجل منتصف ~ 1-2 × 10⁷ خلايا/مل.
8. أثناء الاحتضان ح 4، تسمية قوارير (لنقص المياه والفخاخ) و 50 مل أنابيب جمع. إذا لم يتم استخدام الحاضنة في الخطوة 1، 7 أعلاه لنقص الوقت بالطبع، تشغيل حاضنة أخرى وتعيين إلى 30 درجة مئوية.
9. قبل تعريض الخلايا لنقص:
   1. إضافة ~ 50 مل من الماء إلى اثنين من قوارير 250 مل العقيمة التي ستكون بمثابة الفخاخ المياه.
   2. تعبئة ¹/₃ من الثلج دلو مع النتروجين السائل وتغرق رف رغوة البوليسترين بعقد أنابيب الطرد المركزي 50 مل.
   3. إعداد عامل تصفية نظام جمع الخلايا. إضافة قرص تصفية عقيمة على وحدة السفلي منظومة الترشيح باستخدام ملاقط معقمة، مع الحرص على إلا تلمس حواف القرص عامل التصفية. وضع تصفية أعلى وحدة على وحدة أسفل تصفية وقدمت آمنة مع المشابك مع النظام. تأكد من محاذاة وحدات السفلي والعلوي حيث لا يوجد أي تسرب وختم ضيق.
   4. قياس تركيز الخلية مع جهاز المطياف الضوئي. تمييع الخلايا حيث أن ما يمكن أن يقاس في نطاق الخطية من جهاز المطياف الضوئي – OD₆₀₀ بين ~0.2-0.6، اعتماداً جهاز المطياف الضوئي.
      ملاحظة: التطوير التنظيمي من₆₀₀ وحدة هو ~ 3 × 10⁷ خلايا مليلتر، اعتماداً على مورفولوجيا الخلايا وجهاز المطياف الضوئي. ومن المتوقع بتركيز ~ 1-2 × 10⁷ خلايا/مل، المقابلة ل التطوير التنظيمي₆₀₀ من ~0.33-0.66.
   5. الحصول بسرعة على نموذج الوقت 0.
      1. قم بتوصيل نظام تصفية فراغ قوي (~ 10 [مبر]) عبر أنابيب الشفط وفخ قارورة مل 1,000. بدوره على الفراغ. من أجل الثقافة (عادة ~ 20 مل) إلى أعلى وحدة والانتظار للسائل ليتم سحبها من خلال عامل التصفية (~ 10 ق، تبعاً لقوة الفراغ).
      2. بعناية إزالة القرص عامل التصفية مع ملاقط نظيفة ووضع في أنبوب 50 مل أجهزة الطرد مركزي. فورا وضع أنبوب الطرد المركزي في الرف مغمورة في سائل النيتروجين. الأهم من ذلك، لا قبل البرد الأنابيب قبل إدراج عامل التصفية كما سوف تنفجر الأنابيب.
      3. بعد > 30 ثانية، مكان الأنبوبة في ثلاجة-80 درجة مئوية لاستخراج الحمض النووي الريبي لاحقاً. بعد كل الترشيح، وتنظيف وإعادة تجميع النظام عامل تصفية. شطف النظام عن طريق سحب المياه من خلال 10 ق دون قرص عامل تصفية. وأخيراً، يمسح الجافة النظام مع منشفة ورقية.
   6. تمييع ثقافة ح 4 في قوارير مختلفة لمختلف النقاط الزمنية، حيث أن كل قارورة يصل إلى تركيز سجل منتصف (~ 1-2 × 10⁷ خلايا/مل) في النقطة الزمنية المشار إليها من نقص.
      ملاحظة: يبين الجدول 1 تخفيف التي استخدمت للضغط فرداني البرية من نوع S288C HAP1⁺ . من المستحسن اختبار كل سلالة في هذه الظروف الثقافة التاكسج وضبط تخفيف تبعاً لذلك.
   7. حالما تتم إضافة الخلايا ووسائل الإعلام إلى قوارير، استبدال رقائق الألومنيوم تغطي قارورة فتح مع سداده الذي يحتوي على اثنين من أنابيب زجاجية إدراجها.
   8. مكان في قوارير في الحاضنة في تخطيط قرر في وقت سابق.
   9. الاتصال بشكل أمن الأنبوب كما هو مبين في الشكل 1.
   10. التحقق من أن جميع السدادات يتم الضغط محكم في فتحات قارورة.
10. في الساعة 0، فتح صمام منظم. قم بتعيين مقياس تدفق إلى 3 لتر في الدقيقة.
    ملاحظة: محتدما سيتبع في قوارير الماء على حد سواء، مما يشير إلى تدفق الغاز المناسب. إذا كان هذا ليس هو الحال، تحقق من أن جميع السدادات ضيقة وأنابيب موصولة بشكل صحيح.
11. إغلاق الحاضنة وتعيين سرعة الهز إلى ~ 200 لفة في الدقيقة. بدء تشغيل جهاز ضبط وقت.
12. قبل كل نقطة الوقت، إعداد نظام التصفية كما وصف أعلاه في الخطوة 1.9.3.
13. في كل مرة نقطة (مثلاً، 5 دقائق، 10 دقيقة، إلخ)، وقد شخصين بسرعة عملية الخلايا كما يلي:
    1. الشخص الأول: إزالة قارورة المناسبة من صاحب وإخراج السدادة (مع أنابيب الزجاج المرفقة).
       ملاحظة: هذا لن كسر تدفق ن₂ لأي من قوارير الثقافة المتبقية ولكن مؤقتاً كسر التدفق إلى فخ المياه الأخير.
    2. الشخص الثاني: بيبيت 1 مل ثقافة والاستغناء عن في ومبومو. إعادة توصيل الأنابيب من قارورة الثقافة التي الآن في نهاية السطر الأخير مصيدة المياه (أنبوب واحد وإرادة واحدة سداده إزالتها في العملية).. ثم قياس تركيز الخلية في ومبومو، كما هو موضح أعلاه في الخطوة 1.9.4.
    3. أول شخص: صب ما تبقى الثقافة في نظام الترشيح فراغ، ثم قم بإجراء التصفية والتجميد كما هو موضح أعلاه في الخطوة 1.9.5.
14. عند الانتهاء من جميع النقاط الزمنية، إيقاف الغاز₂ ن. قم أولاً بإغلاق الجهة المنظمة والانتظار للضغط من أجل إطلاق سراح ثم إيقاف تدفق متر. وأخيراً، تفكيك النظام وتنظيف جميع المواد مع الماء ومن ثم الإيثانول 70%.

2. استخراج الحمض النووي الريبي

1. إعداد المخزن المؤقت RLT لتنقية الحمض النووي الريبي العمود، كما هو موضح في الجدول المواد.
2. يعد إيجاد حل عملي من الدناز بإضافة 10 ميليلتر من الحل الدناز الأسهم إلى 70 ميليلتر من المخزن المؤقت هي كل عينة (انظر الجدول المواد).
3. إزالة أنابيب 50 مل يحتوي على خلايا من الثلاجة-80 درجة مئوية وعوامل التصفية ووضع على الجليد الذوبان (~ 15 دقيقة). نفذ الخطوات التالية مع أنابيب على الجليد.
4. قم بتسمية 2 مل أنابيب ملولبة ووضعها على الجليد، وأنبوب واحد لكل عينة. إضافة مل ~0.6 من حمض تغسل حبات لكل أنبوبة، باستخدام أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل لحلج القطن وقياس الخرز.
5. إضافة 0.6 مل من البرد RLT العازلة للأنابيب 50 مل.
6. بيبيت صعودا وهبوطاً لإزالة خلايا من تصفية وتعليق إلى الحل. تجنب ترك عامل التصفية تظل في الحل كعامل التصفية سوف أشعة الحل. إزالة كل حل استيعابهم في عامل التصفية باستخدام تلميح بيبيت للضغط على عامل التصفية ضد جدار الأنبوبة.
7. نقل كل من السائل من أنبوب 50 مل إلى أنابيب ملولبة المحتوية على خرز.
8. وضع أنابيب ملولبة في الخالطون طاحونة حبة وتشغيلها لمدة دقيقة واحدة.
   فورا بوضع الأنابيب على الجليد لمدة ثلاث دقائق. مرة أخرى، وضع الأنابيب في الخالطون وتشغيل لمدة دقيقة واحدة.
9. إزالة الأنابيب من الخالطون ومكان على الجليد لمدة 5 دقائق. وسوف تستقر الخرز إلى الجزء السفلي من الأنابيب.
10. تنفيذ ما تبقى الخطوات في درجة حرارة الغرفة.
11. مع بيبيت، نقل فقط ليستي (~ 350 ميليلتر)، تجنب الخرز، لأنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل جديدة.
12. ميكروسينتريفوجي لمدة 2 دقيقة في أقصى سرعة ونقل ثم المادة طافية على أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل جديدة.
13. إضافة إلى حجم 1 من الإيثانول 70% (مصنوعة من 200 دليل على البيولوجيا الجزيئية-الصف الإيثانول). مزيج جيد من قبل بيبيتينج.
14. نقل الحل وأي اندفاع إلى عمود الحمض النووي الريبي التي وضعت داخل أنبوب جمع 2 مل.
15. الطرد المركزي 15 s في إيه وان تو، 000 x ز وتجاهل التدفق من خلال (السائل في الأنبوب).
16. إضافة 350 ميليلتر من المخزن المؤقت RW1 للعمود. أجهزة الطرد المركزي 15 s في إيه وان تو، 000 x ز وتجاهل التدفق من خلال.
17. إضافة ميليلتر 80 الدناز أنا مزيج الحضانة للغشاء العمود (لا تحصل على جانبي الأنبوب) والسماح للجلوس لمدة 15 دقيقة.
18. إضافة 350 ميليلتر من المخزن المؤقت RW1 للعمود. ميكروسينتريفوجي 15 s في إيه وان تو، 000 x ز وتجاهل التدفق من خلال.
19. إضافة 500 ميليلتر من المخزن المؤقت RPE إلى العمود. ميكروسينتريفوجي 15 ثانية في إيه وان تو، 000 x ز وتجاهل التدفق من خلال.
20. إضافة 500 ميليلتر من المخزن المؤقت RPE إلى العمود. ميكروسينتريفوجي لمدة 2 دقيقة في إيه وان تو، 000 x ز.
21. إزالة العمود ووضع في أنبوب جمع 2 مل جديدة بعناية. ميكروسينتريفوجي بأقصى سرعة لمدة 1 دقيقة (لتجف تماما الغشاء).
22. تجاهل أنبوب جمع ووضع العمود في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل. إضافة 30 ميليلتر من المياه خالية من رناسي للغشاء العمود.
23. الوت الجيش الملكي النيبالي من العمود قبل ميكروسينتريفوجينج لمدة 1 دقيقة في إيه وان تو، 000 x ز. عند تحميل الأعمدة إلى ميكروسينتريفوجي، تأكد من الأغطية لأنبوب جمع تواجه في اتجاه يدور أجهزة الطرد المركزي، لمنع قطع الأغطية.
24. إضافة ميليلتر 30 أخرى من المياه خالية من رناسي للغشاء العمود، مع إبقاء العمود في أنبوب ميكروسينتريفوجي نفسه.
25. ميكروسينتريفوجي لمدة 1 دقيقة في إيه وان تو، 000 x ز، حيث يكون حجم النذرة النهائي 60 ميليلتر.
26. تخزين كل أنبوبة 1.5 مل تحتوي على 60 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي في الثلاجة-80 درجة مئوية.

3-تحديد تركيز الحمض النووي الريبي والجودة

1. قياس تركيز الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي في كل عينة من الحمض النووي الريبي، باستخدام فلوروميتير (أ)، (ب) الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي على حدة الفلورية الأصباغ وأنابيب (ج) المقايسة، كما هو موضح في الجدول المواد. اتبع الإرشادات في فلوروميتير وفي الأصباغ.
2. وبدلاً من ذلك، قياس تركيز الحمض النووي مع جهاز المطياف الضوئي الأشعة فوق البنفسجية مبلغ 260 نيوتن متر.
   ملاحظة: أن قراءة₂₆₀ ألف من 1.0 يكافئ ~ 40 ميكروغرام/مل واحد-الذين تقطعت بهم السبل الجيش الملكي النيبالي.
3. اختبار نوعية الجيش الملكي النيبالي بتشغيل الجيش الملكي النيبالي هو محلل حمض النووي تجاري (انظر الجدول المواد) أو على فورمالدهايد قياسية/[اغروس] هلام ²⁶.

4-الجيش الملكي النيبالي-seq التحليل

1. من مجموع رصيد الجيش الملكي النيبالي، يشكلون 21 ميليلتر من 100 نانوغرام/ميليلتر الجيش الملكي النيبالي في المياه خالية من رناسي. استخدم 1 ميليلتر من هذا ميليلتر 21 لاختبار تركيز الحمض النووي الريبي المذكورة أعلاه. يقدم المتبقية 20 ميليلتر (2 ميكروغرام) مجموع الجيش الملكي النيبالي مركز تسلسل خارجي لإثراء مرناً، وإعداد مكتبة حبلا على حدة (مع الرموز الشريطية ثمانية أو أكثر للإرسال المتعدد)، والتسلسل (انظر الجدول المواد). وبدلاً من ذلك، محلياً إجراء تخصيب مرناً وإعداد مكتبة، وثم تقدم المكتبة للتسلسل.
2. تجمع ثمانية أو أكثر من عينات متعدد والتسلسل في حارة واحدة من المنظم الجيل القادم.
3. تحميل الملف فاستق الذي يحتوي على كل من يقرأ التسلسل ويقرأ الفهرس المطابق. كما أن تحميل الملف النصي الذي يحتوي على الرموز الشريطية تعدد الإرسال.
   ملاحظة: قد تكون موجودة في ملف منفصل فستق يقرأ الفهرس. وضع كل من هذه الملفات في دليل واحد.
4. ضع شيل المقدمة هنا، "fastq_pipeline.sh"، في نفس الدليل. تحرير البرنامج النصي هذا حسب الاقتضاء للتجربة والدلائل الكمبيوتر.
   ملاحظة: هذا البرنامج النصي يحتوي على شروح مستفيضة شرح الخطوات. وباختصار، نوعية البرنامج النصي الديكورات على ما يلي، والخرائط على ما يلي للجينوم، وينشئ ملف المفصول الذي يحتوي على عدد يقرأ كل الجينات لكل عينة.
5. إيداع الملفات فستق والبيانات الخام عدد مرات القراءة في "الجامع التعبير الجيني" في نكبي قبل نشر ²⁷. اتبع الإرشادات التي تظهر في "تقديم تسلسل الفائق لبيانات توقعات البيئة العالمية": https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/seq.html.
6. استيراد بيانات عدد مرات القراءة في البيئة الإحصائية في البحث والتطوير وإجراء التحليل الإحصائي، باستخدام البرنامج النصي ص المقدمة هنا، "time_course_script. R ". تحرير البرنامج النصي هذا حسب الاقتضاء للتجربة والدلائل الكمبيوتر.
   ملاحظة: هذا البرنامج النصي يحتوي على شروح مستفيضة شرح الخطوات. باختصار، هذا البرنامج النصي استيراد البيانات القراءة، وطبيعتها على ما يلي، يحدد الجينات التي تغير بشكل ملحوظ خلال الوقت، ويقوم بتحليل محكمة التحكيم الدائمة، والرسوم البيانية الجينات المحددة.

النتائج

نقص وقت الدورة وتحليل الحمض النووي الريبي seq أجريت ثلاث مرات بشكل مستقل. للنظر في إمكانية تكرار نتائج replicates الثلاثة، وقد تم تحليل البيانات التعبير الجيني لجينات كل استخدام تحليل المكونات الرئيسية (PCA). ويبين الشكل 2 كيفية تغيير العينات على المكونات الرئيس?...

Discussion

في هذه الدراسة، وتم قياس مستويات مرناً لجميع الجينات أثناء نقص في الخميرة S. cerevisiae. وكان الهدف تحليل التغيرات التعبير الجيني العالمي نتيجة للنمو في بيئة تسيطر عليها قرب وصول. اتخذت عدة خطوات لضمان أن الطريقة الموصوفة هنا التي تسيطر عليها بعناية واستنساخه. أولاً، تعرض الخلايا لبيئة ال?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Enclosed dry incubator	Thermo Scientific	MaxQ 4000	Set at 30 °C. Modify the door to allow entry of one Tygon tube. Alternatively, use the New Brunswick G25 incubator, which contains a tube port. Do not use an open-air water shaker, as condensation will collect in the tubes between flasks, possibly cross-contaminating cultures.
Micro-analysis Filter Holder	Millipore	XX1002530	25mm diameter, stainless steel support, no. 5 perforated silicone stopper mounts in standard 125 mL filtering flask
Strong vacuum	Edwards	E-LAB 2	The “house” vacuum may be too weak. Alternatively, use an electric-power portable vacuum pump like the one listed here.
1,000 mL flask			To act as vacuum trap.
~2 foot lengths of Heavy Wall Vacuum Tubing, inner diameter 3/8 in, outer diameter 7/8 in	Tygon	38TT	Two pieces: the first connects vacuum to trap, and the second connects trap to filter system.
High-pressure N2 gas tank			99.999% purity, >1,000 psi, with a regulator and gas flow controller
Autoclaved 500 mL flask			Opening covered with aluminum foil. One for each yeast strain.
Autoclaved 250 mL flasks			Openings covered with aluminum foil. One for each time point plus two for water traps.
Flask stoppers (size 6, two holes with 5 mm diameter)			Sterilized with 70% ethanol. One for each flask.
Glass tubing, length 9 cm or 17 cm, inner diameter 2 mm, outer diameter 5 mm			Sterilized with 70% ethanol. Two tubes for each flask. Place into the holes of each stopper. See Figure 1 for placement of 9- vs 17- cm tubes.
~25 cm lengths of plastic tubing, inner diameter 5 mm	Tygon	E-3603	One piece for each flask. Sterilized with 70% ethanol.
Sterile filter discs	Millipore	HAWP02500	25 mm diameter, 0.45 µm pore size, one for each time point
Sterile dH2O (~100 mL)
1 mL cuvettes			For measuring OD600 (i.e., cell concentration)
50 mL sterile centrifuge tubes			One for each time point
Clean and sterile tweezers
liquid nitrogen			For freezing cells
acid-washed beads	Sigma	G8772	Keep at 4 °C for lysing cells
Qiagen RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	For RNA column purification
Qiagen RLT buffer			Prepare by adding 10 µL of β-Mercaptoethanol per 1 mL of RLT buffer, keep at 4 °C.
2 mL collection tubes	Qiagen		included in the Qiagen Rneasy Mini Kit
Buffer RPE	Qiagen		included in the Qiagen Rneasy Mini Kit
Buffer RW1	Qiagen		included in the Qiagen Rneasy Mini Kit
DNase I stock and working solutions	Qiagen	79254	The DNase I enzyme comes as lyophilized powder in a glass vial. Using a sterile needle and syringe, inject 550 µL of RNase-free water (provided in Qiagen kit) into the vial. Mix by gently inverting the bottle. To avoid denaturing the enzyme, do not vortex. Using a pipet, remove this stock solution from the vial and store in freezer (-20 °C) in single-use aliquots (80 µL each). The stock solution should not be thawed and refrozen.
Buffer RDD	Qiagen		included in the Qiagen DNase Kit
Ice cold 2 mL screw-cap tubes			For lysing cells during RNA extraction
bead mill homogenizer	Biospec Mini-Beadbeater-24	112011	Keep in cold room
Bacto Peptone	BD	DF0118	for liquid YPD media
Bacto Yeast Extract	BD	DF0886	for liquid YPD media
glucose	Fisher	D16	for liquid YPD media
Qubit assay tubes	Thermo Fisher	Q32856	for measuring nucleic acid concentration
Quant-iTTM dsDNA BR Assay Kit	Thermo Fisher	Q32853	for measuring nucleic acid concentration
Quant-iTTM RNA Assay Kit	Thermo Fisher	Q32855	for measuring nucleic acid concentration
Qubit Fluorometer	Thermo Fisher	Q33216	for measuring nucleic acid concentration
Commercial electrophoresis system	Agilent	Bioanalyzer 2100	for measuring nucleic acid quality
Next-generation sequencer	Illumina	HiSeq 2500	for sequencing libraries
automated liquid handling system	Wafergen	Apollo 324	for creating sequencing libraries
PrepX PolyA mRNA Isolation Kit	Wafergen	400047	for isolating mRNA from total RNA
PrepX RNA SEQ for Illumina Library Kit	Wafergen	400039	for creating strand-specific sequencing libraries from total RNA
Barcode Splitter			https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d
Samtools, which includes the gzip command			http://www.htslib.org/download/
Trimmomatic			http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic
Bowtie2 (installed before TopHat)			http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml
TopHat			https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml
HTSeq			http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html
R (installed before R Studio)			https://cran.rstudio.com
R Studio (free version)			https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/