Misurazione dei livelli di mRNA nel tempo durante la risposta Hypoxic lievito s. cerevisiae

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo utilizzando RNA-seq per monitorare i livelli di mRNA nel tempo durante la risposta hypoxic delle cellule di S. cerevisiae . Questo metodo può essere adattato per l'analisi di espressione genica durante qualsiasi risposta cellulare.

Abstract

Complessi cambiamenti nell'espressione genica mediano in genere una grande porzione di una risposta cellulare. Ogni gene può cambiare espressione con la cinetica unico come il gene è regolato tramite la sincronizzazione particolare di uno dei molti stimoli, segnalazione vie o effetti secondari. Al fine di catturare l'intero gene espressione risposta all'ipossia nel lievito S. cerevisiae, analisi di RNA-seq è stata usata per monitorare i livelli di mRNA di geni tutti in momenti specifici dopo l'esposizione all'ipossia. L'ipossia è stato stabilito coltivando cellule in ~ 100% N₂ gas. Cosa importante, a differenza di altri studi hypoxic, ergosterolo e acidi grassi insaturi non sono stati aggiunti ai media perché questi metaboliti influenzano l'espressione genica. Intervalli di tempo sono stati scelti nella gamma di 0 - 4 h dopo ipossia perché quel periodo acquisisce i principali cambiamenti nell'espressione genica. In ogni punto del tempo, le cellule hypoxic Mid-registro erano rapidamente filtrata e congelati, limitando l'esposizione di O₂ e concomitanti cambiamenti nell'espressione genica. RNA totale è stato estratto dalle cellule e utilizzato per arricchire per mRNA, che è stato poi convertito in cDNA. Da questo cDNA, multisala librerie sono state create e otto o più campioni sono stati sequenziati in una corsia di un sequencer di prossima generazione. Una pipeline di post-sequenziamento è descritta, che include guarnizione base di qualità, leggere mapping e determinazione del numero di letture al gene. DESeq2 all'interno dell'ambiente statistico R è stato utilizzato per identificare i geni che cambiano significativamente in uno qualsiasi dei punti tempo ipossica. Analisi di tre replicati biologici ha rivelato alta riproducibilità, geni della cinetica differente e un gran numero di previsto O₂-regolato geni. Questi metodi possono essere utilizzati per studiare come le cellule di vari organismi rispondono all'ipossia nel tempo e adattati per lo studio di espressione genica durante altre risposte cellulari.

Introduzione

Molti organismi rispondono all'ipossia, o basso O₂, alterando gene expression ^1,2,3. Questa risposta aiuta le cellule a fronte della mancanza di un substrato fondamentale per la respirazione aerobica e per parecchie reazioni biosintetiche, ma anche con un cambiamento di stato redox ⁴. Parecchi studi di microarray eseguiti in S. cerevisiae mostrano che i livelli di mRNA di centinaia di geni cambiano in risposta all'ipossia ^{5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12}. recentemente, RNA-seq è stata utilizzata per caratterizzare i cambiamenti di espressione genica nel corso del tempo durante l'ipossia ¹³. Qui, i dettagli sperimentali sono presentati e discussi.

L'ipossia può essere realizzato in vari modi, ciascuno producendo un diverso livello di O₂. Qui, l'ipossia è stato stabilito dal continuo fluire ultra-alto-purezza N₂ in boccette, che abbassa [O₂] dissolto immediatamente con cinetica riproducibile ¹⁰. È possibile che ci sono alcune molecole di₂ O presenti che contribuiscono al metabolismo e nell'espressione genica ma questo ambiente è considerato molto vicino anaerobica. In assenza di O₂, cellule di lievito non possono biosintetizzare eme, ergosterolo e acidi grassi insaturi ^4,12,14. Così, gli studi precedenti hanno incluso questi metaboliti quando crescente lievito senza ossigeno ^5,10,15. Tuttavia, molte risposte ipossiche sono mediate da svuotamento di questi metaboliti e così loro reintegro inverte il gene hypoxic espressione risposte ^12,16. Al fine di imitare naturale ipossia, questi metaboliti non sono stati aggiunti ai media. Nel breve tempo che le cellule sono state esposte all'ipossia senza la presenza di questi metaboliti essenziali, non c'era nessun notevole aumento della morte cellulare (dati non mostrati) né una risposta di stress prolungato ¹³.

La risposta dipende anche il ceppo e il suo genotipo. Particolarmente importanti sono gli alleli dei regolatori noti di risposte ipossiche ². Sullo sfondo di ceppo S288C è altamente desiderato in modo che risultati possono essere confrontati agli altri studi genomici eseguite con questo ceppo. Tuttavia, S288C contiene un allele di perdita-de-funzione parziale del HAP1 gene ¹⁷, un regolatore trascrizionale critico per la risposta hypoxic. Questo allele è stato riparato in S288C utilizzando un wildtype copia dal Σ1278b ceppo sfondo ¹¹.

Espressione genica è altamente dipendente l'ambiente cellulare. Così, quando si esegue l'analisi del mRNA di genoma, è importante mantenere un ambiente costante pur variando un altro parametro come tempo, stimolo o genotipo. Per ottenere risultati altamente riproducibili, considera queste tre pratiche per lo studio e tutte le sue repliche biologiche o tecnici. In primo luogo, il experimenter(s) stesso dovrebbe svolgere lo studio, poiché pratiche tecniche possono variare tra gli sperimentatori. In secondo luogo, la stessa serie di ingredienti da utilizzarsi nei media crescita quanto ogni partita ha una composizione leggermente differente che possa influenzare l'espressione genica. In terzo luogo, per ridurre al minimo gli effetti del ciclo cellulare, ogni punto di tempo dovrebbe consistere asincrone cellule nella fase di Mid-registro di crescita (1-2 x 10⁷ cellule/mL).

Quando che caratterizzano una risposta complessa come la risposta di espressione genica all'ipossia, un corso di tempo è vantaggioso per determinare la cinetica di vari eventi. Intervalli di tempo specifici dovrebbero essere scelti che catturerà i principali cambiamenti della risposta. In questo studio, sono stati osservati punti di tempo compreso tra 0 e 4 h, perché ultimi esperimenti ha rivelato i cambiamenti diffusi nell'espressione genica durante questo periodo ¹³.

Per misurare l'espressione genica globale, RNA-seq è stato usato ^18,19. Questo metodo utilizza il sequenziamento di nuova generazione per determinare l'abbondanza relativa di trascrizione di ogni gene. Rispetto all'analisi di microarray del DNA, il RNA-seq esibisce maggiore sensibilità (per rilevare le trascrizioni meno abbondanti), una maggiore gamma dinamica (per misurare le variazioni di piega maggiore) e riproducibilità superiore (a seguire con precisione l'espressione genica nel corso del tempo). In genere, più cellulare del RNA è RNA ribosomiale così molti metodi sono stati sviluppati per arricchire per specifici RNA specie ²⁰. Qui, poli-T sfere sono stati utilizzati per purificare poli-A-contenenti trascrizioni del mRNA, però i vari commercialmente - Kit di svuotamento di rRNA disponibili potrebbe anche essere efficace nel arricchimento di mRNA.

Qui, la risposta di espressione del gene di S. cerevisiae all'ipossia è stata caratterizzata. Le cellule erano esposti ad ipossia e poi provate a otto punti di tempo (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180 e 240 min). Per confermare la riproducibilità e per identificare le trascrizioni statisticamente modificate, sono stati effettuati tre replicati biologici. RNA è stato estratte da rottura meccanica e purificazione di colonna e poi elaborato per l'analisi di RNA-seq. La pipeline di post-sequenziamento è descritta e sono gli script di programmazione che consentono di eseguire la replica esatta delle analisi. In particolare, Trimmomatic ²¹, TopHat2 ²², HTseq ²³, l' ambiente statistico R ²⁴e il DESeq2 pacchetto ²⁵ sono stati utilizzati per elaborare i dati di RNA-seq e per identificare 607 geni che cambiano in modo significativo durante ipossia. Analisi delle componenti principali (PCA) e l'espressione genica dei replicati indicato la riproducibilità della tecnica. Clustering e heatmaps ha rivelato la cinetica di espressione ad ampio raggio, mentre l'analisi del gene ontology (GO) ha mostrato che molti processi cellulari, come respirazione aerobica, sono arricchiti nel set di geni regolati da ossigeno.

Protocollo

1. indurre ipossia

1. Un giorno o più prima del corso di tempo di ipossia: preparare l'incubatrice, cellula filtraggio sistema, vuoto, serbatoio di gas, boccette, tappi, tubazione di vetro e tubi, come indicato nella Tabella dei materiali.
2. Posizionare il serbatoio₂ N, incubatrice, sistema di aspirazione e filtraggio nelle immediate vicinanze, per attivare l'elaborazione rapida delle cellule.
3. Preparare terreno YPD liquido sterile (1%, Estratto di lievito, 2% di peptone, 2% glucosio) con i componenti in una bottiglia di vetro e la sterilizzazione in autoclave.
4. Planimetria di boccette in incubatrice.
   Nota: Dal serbatoio N₂ , il primo pallone sarà una trappola d'acqua, la seconda beuta sarà l'ultimo punto di tempo, il terzo pallone sarà il punto di secondo all'ultimo momento e così via fino al ultimo pallone che è una trappola finale dell'acqua. La figura 1 Mostra l'ordine e le connessioni tra le boccette.
5. Il giorno prima del corso di tempo, inoculare una Colonia del lievito in una cultura di 5 mL di liquido YPD all'interno di una provetta sterile. In particolare, di raccogliere una colonia completa da una piastra con un bastoncino sterile. Inserire la chiavetta nel YPD liquido e agitare il bastone fino a quando la maggior parte delle cellule sono in sospensione.
6. Ruotare i tubi a 30 ° C durante la notte (~ 16 h).
   Nota: Dopo le 16h, wildtype cellule raggiungerà saturazione (~ 2 x 10⁸ cellule/mL), indicato da una cultura molto nuvolosa. Altri ceppi potrebbero richiedere più tempo per raggiungere la saturazione e dovrebbero essere testati misurando la concentrazione cellulare con uno spettrofotometro, come indicato nel passaggio 1.9.4.
7. Il giorno del corso di tempo, dopo 16 h di incubazione, diluire la cultura saturata 01:50 utilizzando una pipetta da 5 mL per porre 4 mL di pernottamento cultura in 196 mL di YPD liquido all'interno di un pallone da mL 500 sterile. Crescere con agitazione a ~ 200 giri/min per 4 ore a 30 ° C.
   Nota: Dopo 4 h, una cultura di wildtype raggiungerà una concentrazione di Mid-registro di ~ 1-2 x 10⁷ cellule/mL.
8. Durante l'incubazione di 4 h, etichettare le beute (per ipossia e acqua trappole) e i 50 mL provette per il prelievo. Se l'incubatore nel passaggio 1.7 sopra non viene utilizzato per il corso di tempo di ipossia, accendere l'altro incubatore e impostato su 30 ° C.
9. Appena prima di sottoporre le cellule ad ipossia:
   1. Aggiungere ~ 50 mL di acqua a due delle beute sterili 250 mL che serviranno come le trappole di acqua.
   2. Riempire ¹/₃ di un ghiaccio secchio con azoto liquido e immergere un rack di polistirolo espanso per contenere provette centrifuga da 50 mL.
   3. Impostare il sistema di filtro per la raccolta di cellule. Aggiungere un filtro sterile disco sull'unità di fondo del sistema di filtrazione con pinzette sterili, facendo attenzione a toccare solo i bordi del disco filtro. Posizionare l'unità superiore filtro sul gruppo filtro inferiore e fissarlo con le fascette fornite con il sistema. Assicurarsi che l'unità superiore e inferiore siano allineati in modo che vi sia una tenuta ottimale e senza perdite.
   4. Misurare la concentrazione di cellule con uno spettrofotometro. Diluire le cellule in modo che possono essere misurati in campo lineare dello spettrofotometro – OD₆₀₀ tra ~0.2 - 0.6, a seconda dello spettrofotometro.
      Nota: Un'unità di₆₀₀ OD è ~ 3 x 10⁷ cellule/mL, a seconda della morfologia delle cellule e spettrofotometro. È prevista una concentrazione di ~ 1-2 x 10⁷ cellule/mL, corrispondenti a OD₆₀₀ di ~0.33 - 0,66.
   5. Ottenere rapidamente il campione di tempo 0.
      1. Collegare il sistema di filtro a un vuoto forte (~ 10 mbar) tramite tubo del vuoto e una trappola di boccetta di 1.000 mL. Applicare il vuoto. La cultura (solitamente ~ 20 mL) versare il sopralzo e attendere per liquido di essere tirato attraverso il filtro (~ 10 s, a seconda della forza del vuoto).
      2. Rimuovere il disco filtro con pinzette pulite delicatamente e posto in una provetta da centrifuga 50 mL. Posizionare immediatamente la provetta nel rack immerso in azoto liquido. D'importanza, non pre-raffreddare i tubi prima di inserire il filtro come i tubi esploderà.
      3. Dopo > 30 s, posto il tubo in un congelatore-80 ° C per la successiva estrazione del RNA. Dopo ogni filtrazione, pulire e rimontare il sistema filtrante. Sciacquare il sistema tirando acqua attraverso per 10 s senza un disco di filtro. Infine, asciugare il sistema con un tovagliolo di carta.
   6. Diluire la cultura di 4h in boccette differenti per i vari punti di tempo, affinché ciascuna beuta raggiunge metà log concentrazione (~ 1-2 x 10⁷ cellule/mL) presso il punto di tempo indicato di ipossia.
      Nota: La tabella 1 Mostra le diluizioni che sono state utilizzate per il ceppo aploide di selvaggio-tipo S288C HAP1⁺ . Si consiglia di testare ogni ceppo in queste condizioni ipossiche cultura e regolare di conseguenza le diluizioni.
   7. Una volta che le cellule e i media vengono aggiunti a boccette, sostituire il foglio di alluminio che copre il matraccio di apertura con tappo contenente due tubi di vetro inseriti.
   8. Posizionare le beute nell'incubatore nel layout determinato in precedenza.
   9. Collegare saldamente il tubo come illustrato nella Figura 1.
   10. Verificare che tutti i tappi sono strettamente inseriti nelle aperture del pallone.
10. Al tempo 0, aprire la valvola del regolatore. Quindi impostare il misuratore di portata a 3 L/min.
    Nota: Bubbling sarà osservato in due flaconi di acqua, che indica il flusso di gas corretto. Se questo non è il caso, verificare che tutti i tappi sono stretti e tubazione sia collegata correttamente.
11. Chiudere l'incubatrice e impostare la velocità di agitazione a ~ 200 giri/min. Avviare un timer.
12. Prima di ogni punto del tempo, è possibile impostare il sistema di filtro come descritto sopra al punto 1.9.3.
13. Ogni punto di tempo (ad es., 5min, 10min, ecc.), sono due persone di elaborare rapidamente le cellule come segue:
    1. Prima persona: togliere il matraccio appropriato da parte del titolare e togliere il tappo (con tubo di vetro collegato).
       Nota: Questo non interromperà il flusso di N₂ a uno qualsiasi dei restanti matracci di cultura ma interromperà temporaneamente il flusso all'ultima trappola di acqua.
    2. Seconda persona: dispensare 1 mL di coltura e pipettare in una provetta. Ricollegare il tubo nel matraccio di cultura che è ora alla fine della riga all'ultima trappola di acqua (un tubo e un tappo volontà essere rimossi nel processo.). Quindi, misurare la concentrazione di cellule in provetta, come descritto in precedenza nel passaggio 1.9.4.
    3. Prima persona: versare il resto della cultura il sistema di filtrazione sotto vuoto e quindi eseguire il filtro e congelamento come descritto in precedenza nel passaggio 1.9.5.
14. Al termine tutti i punti di tempo, spegnere il gas₂ N. Prima chiudere il regolatore e attendere che la pressione rilasciare e quindi spegnere il misuratore di portata. Infine, smontare il sistema e pulire tutti i materiali con acqua e poi con etanolo al 70%.

2. estrazione del RNA

1. Preparare il tampone di RLT per purificazione di RNA colonna, come descritto nella Tabella dei materiali.
2. Preparare una soluzione di lavoro di dnasi aggiungendo 10 µ l di soluzione madre dnasi a 70 µ l di tampone RDD per campione (Vedi Materiali tavolo).
3. Rimuovere le provette da 50 mL contenente filtri e cellule dal congelatore-80 ° C e metterli su ghiaccio a scongelare (~ 15 min). Procedere come segue con tubi sul ghiaccio.
4. Etichetta 2 mL provette con tappo a vite e metterli sul ghiaccio, una provetta per ogni campione. Aggiungere mL ~0.6 di perline lavata con acido in ogni provetta, utilizzando un tubo per microcentrifuga da 1,5 mL di scoop e misurare le perline.
5. Aggiungere 0,6 mL di tampone di RLT refrigerato per le provette da 50 mL.
6. Dispensare su e giù per rimuovere le cellule dal filtro e sospendere in soluzione. Evitare di lasciare il filtro rimangono nella soluzione come il filtro sarà assorbire la soluzione. Rimuovere tutte le soluzione assorbita nel filtro utilizzando il puntale per spremere il filtro contro la parete del tubo.
7. Trasferire tutto il liquido dal tubo 50 mL nelle provette con tappo a vite contenente microsfere.
8. Disporre le provette con tappo a vite in un omogeneizzatore del mulino di perlina e correre per un minuto.
   Posizionare immediatamente le provette in ghiaccio per tre minuti. Ancora una volta, inserire i tubi l'omogeneizzatore e correre per un minuto.
9. Rimuovere i tubi dal omogeneizzatore e posto in ghiaccio per 5 min. Le perline si depositano alla parte inferiore dei tubi.
10. Eseguire il resto dei passaggi a temperatura ambiente.
11. Con una pipetta, trasferire solo il lisato (~ 350 µ l), evitando le perle, ad un nuovo tubo per microcentrifuga da 1,5 mL.
12. Microcentrifuga per 2 min a velocità massima e quindi trasferimento il surnatante in un nuovo tubo per microcentrifuga da 1,5 mL.
13. Aggiungere 1 volume di etanolo al 70% (fatto da 200 etanolo di biologia molecolare-grado della prova). Mescolare bene il pipettaggio.
14. Trasferire la soluzione e dell'eventuale precipitato a una colonna di RNA che è stata inserita all'interno di un tubo di raccolta da 2 mL.
15. Centrifuga per 15 s a ≥ 12, 000 x g e scartare il flusso continuo (il liquido nel tubo).
16. Aggiungere 350 µ l di tampone RW1 alla colonna. Centrifuga per 15 s a ≥ 12, 000 x g e scartare il flusso continuo.
17. Aggiungere 80 µ l dnasi I mix di incubazione per la membrana di colonna (non fare i lati del tubo) e lasciar per riposare per 15 min.
18. Aggiungere 350 µ l di tampone RW1 alla colonna. Microcentrifuga per 15 s a ≥ 12, 000 x g e scartare il flusso continuo.
19. Aggiungere 500 µ l di tampone RPE alla colonna. Flusso continuo del microcentrifuge per 15 s a ≥ 12, 000 x g e scartare.
20. Aggiungere 500 µ l di tampone RPE alla colonna. Microcentrifuga per 2 min a ≥ 12, 000 x g.
21. Rimuovere la colonna delicatamente e inserire un nuovo tubo di raccolta da 2 mL. Microcentrifuga a tutta velocità per 1 minuto (per asciugare completamente la membrana).
22. Gettare la provetta di raccolta e posizionare la colonna in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL. Aggiungere 30 µ l di acqua RNAsi-libera alla membrana colonna.
23. Eluire il RNA dalla colonna di microcentrifuging per 1 min ≥ 12, 000 x g. Quando si caricano le colonne in microcentrifuga, assicurarsi che i coperchi del tubo di raccolta si trovano ad affrontare in direzione centrifuga giri, per evitare che i coperchi di rottura.
24. Aggiungere un altro 30 µ l di acqua RNAsi-libera alla membrana colonna, mantenendo la colonna nello stesso tubo del microcentrifuge.
25. Microcentrifuga per 1 min ≥ 12, 000 x g, affinché il volume finale eluato è 60 µ l.
26. Memorizzare ogni provetta da 1,5 mL contenente 60 µ l di RNA nel congelatore-80 ° C.

3. determinare la qualità e la concentrazione di RNA

1. Misurare la concentrazione di RNA e DNA in ogni campione di RNA, utilizzando (a) un fluorimetro, (b) fluorescente a DNA e RNA specifico coloranti e (c) provette, come elencato nella Tabella dei materiali. Seguire le istruzioni del fluorimetro e i coloranti.
2. In alternativa, misurare la concentrazione di acido nucleico con uno spettrofotometro di UV a 260 nm.
   Nota: Una₂₆₀ una lettura di 1.0 è equivalente a ~ 40 µ g/mL single-stranded RNA.
3. Verificare la qualità di RNA eseguendo il RNA su un analizzatore di acido nucleico commerciale (Vedi Materiali tavolo) o su una valore standard di formaldeide / dell'agarosi gel ²⁶.

4. RNA-seq analisi

1. Dallo stock di RNA totale, compongono 21 µ l di 100 ng / µ l RNA in acqua RNAsi-libera. Utilizzare 1 µ l di questo 21 µ l per testare la concentrazione di RNA come sopra. Presentare i rimanenti 20 µ l (2 µ g) RNA totale ad un centro di sequenziamento esterno per arricchimento di mRNA, preparazione libreria strand-specifica (con otto o più codici a barre per multiplexing) e sequenziamento (Vedi Materiali tavolo). In alternativa, eseguire localmente mRNA arricchimento e preparazione di libreria e quindi inviare la libreria per il sequenziamento.
2. Piscina otto o più campioni di multiplexati e sequenza in una corsia di un sequencer di prossima generazione.
3. Scaricare il file FASTQ che contiene tutte le letture di sequenza e l'indice corrispondente legge. Inoltre, scaricare il file di testo contenente i codici a barre multiplex.
   Nota: Le letture di indice possono essere presenti in un file FASTQ separato. Inserire tutti questi file in una directory.
4. Inserire lo script di shell fornito qui, "fastq_pipeline.sh", nella stessa directory. Modificare lo script come appropriato per l'esperimento e le directory del computer.
   Nota: questo script contiene vaste annotazioni che spiega i passaggi. In breve, la qualità di script taglia le letture, mappe le letture al genoma e genera un file delimitato da tabulazioni contenente il numero di letture al gene per ogni campione.
5. Depositare i file FASTQ e crudo conteggio lettura dati in Omnibus di espressione di Gene di NCBI prima pubblicazione ²⁷. Seguire le istruzioni per "Invio dati di sequenza di high-throughput di GEO": https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/seq.html.
6. Importare i dati di lettura conteggio nell'ambiente statistico R ed effettuare analisi statistiche, utilizzando lo script di R fornito qui, "time_course_script. R". Modificare lo script come appropriato per l'esperimento e le directory del computer.
   Nota: Questo script contiene vaste annotazioni che spiega i passaggi. In breve, questo script consente di importare i dati letti, normalizza le letture, individua i geni che cambiano in modo significativo nel corso del tempo, esegue analisi PCA e grafici l'espressione di geni selezionati.

Risultati

Il decorso di ipossia e RNA-seq analisi sono state eseguite in modo indipendente tre volte. Per esaminare la riproducibilità dei tre replicati, dati di espressione genica per tutti i geni è stati analizzati utilizzando Principal Component Analysis (PCA). La figura 2 Mostra come i campioni cambiano sopra i primi due componenti principali, che insieme rappresentano il 58,9% della variabilità. Questa analisi ha indicato che ogni corso tempo esibisce i cambiam...

Discussione

In questo studio, i livelli di mRNA per tutti i geni è stata misurata durante l'ipossia nel lievito S. cerevisiae. L'obiettivo era di analizzare i cambiamenti di espressione genica globale a causa della crescita in un ambiente controllato vicino-anossico. Sono state adottate numerose misure per garantire che il metodo qui descritto è stato attentamente controllato e riproducibile. In primo luogo, le cellule sono state esposte ad un ambiente ipossico precisamente definito: 99,999% N₂ in contenuti mul...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Enclosed dry incubator	Thermo Scientific	MaxQ 4000	Set at 30 °C. Modify the door to allow entry of one Tygon tube. Alternatively, use the New Brunswick G25 incubator, which contains a tube port. Do not use an open-air water shaker, as condensation will collect in the tubes between flasks, possibly cross-contaminating cultures.
Micro-analysis Filter Holder	Millipore	XX1002530	25mm diameter, stainless steel support, no. 5 perforated silicone stopper mounts in standard 125 mL filtering flask
Strong vacuum	Edwards	E-LAB 2	The “house” vacuum may be too weak. Alternatively, use an electric-power portable vacuum pump like the one listed here.
1,000 mL flask			To act as vacuum trap.
~2 foot lengths of Heavy Wall Vacuum Tubing, inner diameter 3/8 in, outer diameter 7/8 in	Tygon	38TT	Two pieces: the first connects vacuum to trap, and the second connects trap to filter system.
High-pressure N2 gas tank			99.999% purity, >1,000 psi, with a regulator and gas flow controller
Autoclaved 500 mL flask			Opening covered with aluminum foil. One for each yeast strain.
Autoclaved 250 mL flasks			Openings covered with aluminum foil. One for each time point plus two for water traps.
Flask stoppers (size 6, two holes with 5 mm diameter)			Sterilized with 70% ethanol. One for each flask.
Glass tubing, length 9 cm or 17 cm, inner diameter 2 mm, outer diameter 5 mm			Sterilized with 70% ethanol. Two tubes for each flask. Place into the holes of each stopper. See Figure 1 for placement of 9- vs 17- cm tubes.
~25 cm lengths of plastic tubing, inner diameter 5 mm	Tygon	E-3603	One piece for each flask. Sterilized with 70% ethanol.
Sterile filter discs	Millipore	HAWP02500	25 mm diameter, 0.45 µm pore size, one for each time point
Sterile dH2O (~100 mL)
1 mL cuvettes			For measuring OD600 (i.e., cell concentration)
50 mL sterile centrifuge tubes			One for each time point
Clean and sterile tweezers
liquid nitrogen			For freezing cells
acid-washed beads	Sigma	G8772	Keep at 4 °C for lysing cells
Qiagen RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	For RNA column purification
Qiagen RLT buffer			Prepare by adding 10 µL of β-Mercaptoethanol per 1 mL of RLT buffer, keep at 4 °C.
2 mL collection tubes	Qiagen		included in the Qiagen Rneasy Mini Kit
Buffer RPE	Qiagen		included in the Qiagen Rneasy Mini Kit
Buffer RW1	Qiagen		included in the Qiagen Rneasy Mini Kit
DNase I stock and working solutions	Qiagen	79254	The DNase I enzyme comes as lyophilized powder in a glass vial. Using a sterile needle and syringe, inject 550 µL of RNase-free water (provided in Qiagen kit) into the vial. Mix by gently inverting the bottle. To avoid denaturing the enzyme, do not vortex. Using a pipet, remove this stock solution from the vial and store in freezer (-20 °C) in single-use aliquots (80 µL each). The stock solution should not be thawed and refrozen.
Buffer RDD	Qiagen		included in the Qiagen DNase Kit
Ice cold 2 mL screw-cap tubes			For lysing cells during RNA extraction
bead mill homogenizer	Biospec Mini-Beadbeater-24	112011	Keep in cold room
Bacto Peptone	BD	DF0118	for liquid YPD media
Bacto Yeast Extract	BD	DF0886	for liquid YPD media
glucose	Fisher	D16	for liquid YPD media
Qubit assay tubes	Thermo Fisher	Q32856	for measuring nucleic acid concentration
Quant-iTTM dsDNA BR Assay Kit	Thermo Fisher	Q32853	for measuring nucleic acid concentration
Quant-iTTM RNA Assay Kit	Thermo Fisher	Q32855	for measuring nucleic acid concentration
Qubit Fluorometer	Thermo Fisher	Q33216	for measuring nucleic acid concentration
Commercial electrophoresis system	Agilent	Bioanalyzer 2100	for measuring nucleic acid quality
Next-generation sequencer	Illumina	HiSeq 2500	for sequencing libraries
automated liquid handling system	Wafergen	Apollo 324	for creating sequencing libraries
PrepX PolyA mRNA Isolation Kit	Wafergen	400047	for isolating mRNA from total RNA
PrepX RNA SEQ for Illumina Library Kit	Wafergen	400039	for creating strand-specific sequencing libraries from total RNA
Barcode Splitter			https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d
Samtools, which includes the gzip command			http://www.htslib.org/download/
Trimmomatic			http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic
Bowtie2 (installed before TopHat)			http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml
TopHat			https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml
HTSeq			http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html
R (installed before R Studio)			https://cran.rstudio.com
R Studio (free version)			https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/