Messung der mRNA-Niveaus im Laufe der Zeit während der Hefe S. Cerevisiae hypoxischen Antwort

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll mit RNA-Seq, um mRNA-Niveaus im Laufe der Zeit während der hypoxischen Antwort von S. Cerevisiae Zellen zu überwachen. Diese Methode kann zu analysieren, gen-Expression in eine zelluläre Reaktion angepasst werden.

Zusammenfassung

Komplexe Änderungen in der Genexpression zu vermitteln in der Regel einen Großteil eine zelluläre Reaktion. Jedes Gen kann Ausdruck mit einzigartigen Kinetik ändern, da das Gen durch den bestimmten Zeitpunkt einer der vielen Reize, Signalisierung, Wege oder Nebenwirkungen geregelt ist. Um das gesamte gen einzufangen war Ausdruck Reaktion auf Hypoxie in der Hefe S. Cerevisiae, RNA-Seq-Analyse verwendet, um die mRNA-Niveaus aller Gene zu bestimmten Zeitpunkten nach der Exposition gegenüber Hypoxie zu überwachen. Hypoxie entstand durch wachsenden Zellen in ~ 100 % N₂ Gas. Wichtig ist, wurden im Gegensatz zu anderen hypoxischen Studien, Ergosterin und ungesättigten Fettsäuren nicht zu den Medien hinzugefügt, da dieser Metaboliten Genexpression beeinflussen. Zeitpunkten wurden im Bereich von 0 - 4 h nach Hypoxie ausgewählt, weil damals die wichtigsten Änderungen in der Genexpression erfasst. Zu jedem Zeitpunkt Mitte Log hypoxische Zellen waren schnell gefiltert und eingefroren, Begrenzung der Exposition gegenüber O₂ und damit einhergehende Veränderungen der Genexpression. Gesamt-RNS war aus Zellen extrahiert und verwendet, um bereichern für mRNA, die dann in cDNA umgewandelt wurde. Aus diesem cDNA Multiplex-Bibliotheken erstellt wurden und mindestens acht Proben wurden in einer Spur von einer nächsten Generation Sequenzer sequenziert. Eine Post-Sequenzierung Pipeline wird beschrieben, worunter Qualität Basis trimmen, Kartierung und Bestimmung der Anzahl der Lesevorgänge pro gen zu lesen. DESeq2 innerhalb der statistischen R-Umgebung wurde verwendet, um Gene zu identifizieren, die an einem hypoxischen Zeitpunkten wesentlich verändern. Analyse von drei biologische Wiederholungen zeigte hohen Reproduzierbarkeit, Gene der unterschiedlichen Kinetik und eine große Anzahl von erwartet O₂-Gene reguliert. Diese Methoden können zur Untersuchung, wie die Zellen der verschiedenen Organismen auf Hypoxie im Laufe der Zeit reagieren und angepasst, um gen-Expression in anderen zellulären Reaktionen zu studieren.

Einleitung

Viele Organismen reagieren auf Hypoxie oder niedrigen O₂, durch die Veränderung der gen-Expression- ^1,-^2,-³. Diese Antwort hilft Zellen, die mit dem Mangel an ein Substrat für die aerobe Atmung und für mehrere biosynthetischen Reaktionen von entscheidender Bedeutung, sondern auch mit einem wechselnden Redox-Zustand ⁴zu bewältigen. Mehrere Studien in S. Cerevisiae Microarray zeigen, dass die mRNA-Niveaus von Hunderten von Genen in Erwiderung auf Hypoxie ^5,6,7,8,9 ändern ^{, 10 , 11 , 12}. vor kurzem RNA-Seq wurde verwendet, um Veränderungen der Genexpression im Laufe der Zeit während der Hypoxie ¹³charakterisieren. Hier werden die experimentellen Details präsentiert und diskutiert.

Hypoxie kann auf verschiedene Weise, jeder produziert eine andere Ebene der O₂erreicht werden. Hier, gründete Hypoxie kontinuierlich fließenden ultra-high-Reinheit N₂ in Flaschen, die [O₂] senkt sofort mit reproduzierbaren Kinetik ¹⁰aufgelöst. Es ist möglich, dass es einige O₂ Moleküle, die Stoffwechsel und die Genexpression beitragen, aber dieses Umfeld sehr in der Nähe von anaeroben als. In Ermangelung von O₂nicht Hefezellen Biosynthese Häm, Ergosterin und ungesättigten Fettsäuren ^4,12,14. Frühere Studien haben daher diese Metaboliten aufgenommen, beim Anbau von Hefe ohne Sauerstoff ^5,10,15. Jedoch viele hypoxische Antworten sind durch Erschöpfung dieser Metaboliten vermittelt und somit ergänzen sie kehrt die hypoxischen gen Ausdruck Antworten ^12,16. Um natürliche Hypoxie zu imitieren, waren diese Metaboliten die Medien nicht hinzugefügt. In der kurzen Zeit, dass Zellen Hypoxie ohne das Vorhandensein dieser wichtige Metaboliten ausgesetzt waren gab es keine spürbaren Zelltod (Daten nicht gezeigt) noch ein längerer Stress-Reaktion- ¹³.

Die Antwort ist ebenfalls abhängig von der Belastung und der Genotyp. Besonders wichtig sind die Allele der bekannten Regulatoren von hypoxischen Antworten ². S288C Belastung Hintergrund ist sehr gewünscht, so dass Ergebnisse mit den anderen genomischen Studien mit dieser Sorte verglichen werden können. S288C enthält jedoch ein teilweiser Verlust der Funktion Allel der HAP1 gen ¹⁷, kritische transcriptional Regulator für die hypoxischen Antwort. Dieses Allel wurde repariert, in S288C mit einem Wildtyp Kopie aus dem Σ1278b Stamm Hintergrund ¹¹.

Genexpression ist stark abhängig von der zellulären Umgebung. Genomweite mRNA Analyse durchführen, ist es daher wichtig, eine konstante Umgebung beizubehalten und gleichzeitig die unterschiedlichen ein weiterer Parameter wie Zeit, Anregung oder Genotyp. Um hoch reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen, betrachten Sie diese drei Methoden für die Untersuchung und aller seiner biologischen oder technischen Wiederholungen. Erstens sollten die gleichen Experimenter(s) Durchführung der Studie, da technische Verfahren über Experimentatoren variieren. Zweitens sollte die gleiche Charge von Zutaten in den Wachstumsmedien verwendet werden, da jede Charge hat eine etwas andere Zusammensetzung, die Genexpression beeinflussen können. Drittens um Zellzyklus Auswirkungen zu minimieren, sollte jeden Zeitpunkt des asynchronen Zellen in der Mitte des Log-Phase des Wachstums (1-2 x 10⁷ Zellen/mL) bestehen.

Wenn eine komplexe Antwort wie die gen-Ausdruck-Reaktion auf Hypoxie zu charakterisieren, ist ein zeitlichen Verlauf vorteilhaft für die Bestimmung der Kinetik der verschiedenen Veranstaltungen. Bestimmten Zeitpunkten sollte gewählt werden, die die wichtigsten Änderungen der Antwort zu erfassen. In dieser Studie wurden Zeitpunkten zwischen 0 und 4 h beobachtet, weil letzten Experimente weit verbreitete Änderungen in der Genexpression während diesem Zeitraum ^{13 zeigten}.

Zur Messung der globalen Genexpression wurde RNA-Seq gebrauchte ^18,19. Diese Methode nutzt Next Generation Sequencing, um die relative Häufigkeit jedes Gen Niederschrift zu bestimmen. Im Vergleich zu DNA-Microarray Analyse, weist RNA-Seq höhere Empfindlichkeit (, weniger reichlich Transkripte zu erkennen), einen größeren Dynamikbereich (um größere Falte Veränderungen zu messen) und hervorragende Reproduzierbarkeit (, Genexpression im Laufe der Zeit genau zu folgen). In der Regel ist die zelluläre RNA ribosomalen RNA, die so viele Methoden entwickelt wurden, um für spezifische RNA Arten ²⁰bereichern. Hier, Poly-T Perlen wurden verwendet, um Poly-A-haltige mRNA Transkripte, obwohl die verschiedenen kommerziell zu reinigen - erhältlichen rRNA Erschöpfung Kits könnte auch wirksam bei der mRNA Bereicherung sein.

Hier zeichnete sich die S. Cerevisiae gen Ausdruck Reaktion auf Hypoxie. Zellen Hypoxie ausgesetzt waren und dann zu acht Zeitpunkten abgetastet (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180 und 240 min). Reproduzierbarkeit zu bestätigen und um statistisch veränderte Abschriften zu identifizieren, wurden drei biologische Wiederholungen durchgeführt. RNA wurde durch mechanische Störungen und Spalte Reinigung extrahiert und dann für die Analyse der RNA-Seq verarbeitet. Die Post-Sequenzierung Pipeline wird beschrieben und Programmierung Skripte werden bereitgestellt, mit denen die exakte Replikation der Analysen durchgeführt. Speziell, Trimmomatic ²¹, TopHat2 ²², HTseq ²³, R statistische Umgebung ²⁴und die DESeq2 Paket ²⁵ dienten, die RNA-Seq-Daten verarbeiten und 607 Gene zu identifizieren, die wesentlich zu, während verändern Hypoxie. Hauptkomponentenanalyse (PCA) und Genexpression von der Wiederholungen angegeben die Reproduzierbarkeit der Technik. Clustering und Heatmaps offenbart weit reichende Ausdruck Kinetik, während gen Ontology (gehen Sie) Analyse zeigte, dass viele zelluläre Prozesse, wie Atmung, in den Sauerstoff-regulierten Genen angereichert sind.

Protokoll

1. Induktion Hypoxie

1. Einen Tag oder mehr vor der Hypoxie zeitlicher Verlauf: bereiten Sie den Brutkasten, Zell-Filter System, Vakuum, Gas-Tank, Fläschchen, Stopper, Glasröhren und Schlauch, wie in der Materialtabelle.
2. Ort der N₂ Tank, Inkubator, Vakuum und Filtersystem in unmittelbarer Nähe, schnelle Bearbeitung von Zellen aktivieren.
3. Bereiten Sie sterile Flüssigmedien YPD (1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton, 2 % Glukose) durch Mischen der Komponenten in einer Glasflasche und Autoklavieren.
4. Grundriss der Flaschen in den Inkubator.
   Hinweis: Aus dem N-₂ -Tank, der erste Kolben werden einen Wasserabscheider wird, der zweite Kolben der letzte Zeitpunkt, die dritte Flasche werden bis zum vorletzten Mal Punkt und so weiter bis die letzte Flasche die endgültige Wasserabscheider ist. Abbildung 1 zeigt die Reihenfolge und die Verbindungen zwischen den Kolben.
5. Impfen Sie am Vortag den zeitlichen Verlauf eine Hefe-Kolonie in eine Kultur von 5 mL Flüssigkeit YPD in ein steriles Röhrchen. Holen Sie insbesondere eine vollständige Kolonie von einer Platte mit einem sterilen Applikator-Stick ab. Legen Sie den Stick in die flüssige YPD und schütteln Sie den Stick, bis die meisten Zellen in der Schwebe sind.
6. Drehen Sie die Rohre bei 30 ° C über Nacht (~ 16 h).
   Hinweis: Nach 16 h, werden Wildtyp Zellen Sättigung (~ 2 x 10⁸ Zellen/mL), gekennzeichnet durch eine stark bewölkt Kultur erreichen. Andere Stämme können länger dauern, Sättigung erreichen und sollte durch Messung der Zellkonzentration mit einem Spektrophotometer getestet werden, wie in Schritt 1.9.4 angegeben.
7. Am Tag der zeitliche Verlauf nach 16 h Inkubation, verdünnen die gesättigte Kultur über Nacht 01:50 mithilfe einer 5 mL pipettieren, 4 mL platzieren Kultur in 196 mL flüssige YPD innerhalb einer steril 500 mL Flasche. Wachsen Sie mit Schütteln bei ~ 200 u/min für 4 h bei 30 ° C.
   Hinweis: Nach 4 h erreichen eine Wildtyp-Kultur eine Mid Log Konzentration von ~ 1-2 x 10⁷ Zellen/mL.
8. Während der 4 h Inkubation beschriften Sie die Fläschchen (für Hypoxie und Wasser fallen) und die 50 mL Röhrchen. Wenn der Inkubator in 1.7 Schritt oben nicht für den zeitlichen Verlauf von Hypoxie verwendet wird, schalten Sie die anderen Inkubator und setzen auf 30 ° C.
9. Kurz vor Zellen Hypoxie zu unterwerfen:
   1. Fügen Sie hinzu ~ 50 mL Wasser, zwei sterile 250 mL-Flaschen dienen als die Wasserfallen werden.
   2. Füllen Sie ¹/₃ des Eises Eimer mit flüssigem Stickstoff und Tauchen Sie eine Polystyrol-Hartschaum-Rack um 50 mL Zentrifuge Röhren zu halten.
   3. Richten Sie das Filtersystem für das Sammeln von Zellen. Fügen Sie eine Sterilfilter Disc auf der unteren Einheit des Filtersystems mit einer sterilen Pinzette, achten Sie darauf, nur die Kanten der Filterscheibe berühren. Die Filtereinheit oberen auf die unteren Filtereinheit und mit den Klemmen mit dem System zur Verfügung gestellt. Stellen Sie sicher, dass die unteren und oberen Einheiten ausgerichtet sind, so dass es eine gute Abdichtung und keine Leckage.
   4. Messen Sie die Zellkonzentration mit einem Spektrophotometer. Verdünnen Sie Zellen, so dass sie im linearen Bereich des Spektralphotometers – OD₆₀₀ zwischen ~0.2 - 0,6, je nach dem Spektralphotometer gemessen werden können.
      Hinweis: Eine OD₆₀₀ Einheit ist ~ 3 x 10⁷ Zellen/mL, je nach Zellmorphologie und Spektralfotometer. Eine Konzentration von ~ 1-2 x 10⁷ Zellen/mL wird erwartet, entspricht OD₆₀₀ ~0.33 - 0,66.
   5. Erhalten Sie schnell die Zeitprobe 0.
      1. Verbinden Sie das Filtersystem mit starken (~ 10 Mbar) Vakuum über Vakuumschlauch und 1.000 mL Flasche Falle. Schalten Sie das Vakuum. Die obere Einheit die Kultur (in der Regel ~ 20 mL) gießen und warten, bis die Flüssigkeit durch den Filter gezogen werden (~ 10 s, je nach Stärke des Vakuums).
      2. Vorsichtig entfernen Sie die Filterscheibe mit sauberen Pinzette und setzen Sie in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen. Legen Sie die Zentrifugenröhrchen sofort in das Rack in flüssigen Stickstoff getaucht. Wichtig ist, nicht vorab chill die Rohre vor dem Einsetzen des Filters, da die Rohre explodieren werden.
      3. Nach > 30 s, Ort der Röhre in einem-80 ° C Gefrierschrank für die späteren RNA-Extraktion. Reinigen Sie nach jeder Filtration und wieder zusammenbauen Sie, das Filtersystem. Spülen Sie das System von durchziehen Wasser für 10 s ohne eine Filterscheibe. Zu guter Letzt trocknen Sie das System mit einem Papiertuch.
   6. Verdünnen Sie die 4 h-Kultur in verschiedenen Fläschchen für die verschiedenen Zeitpunkte, damit jedem Kolben Mitte Log Konzentration (~ 1-2 x 10⁷ Zellen/mL) zum angegebenen Zeitpunkt der Hypoxie erreicht.
      Hinweis: Die Tabelle 1 zeigt Verdünnungen, die für die Wildtyp S288C HAP1⁺ haploiden Belastung verwendet wurden. Es wird empfohlen, jede Belastung in diesen hypoxischen Kulturbedingungen zu testen und die Verdünnungen entsprechend anpassen.
   7. Sobald Zellen und Medien Fläschchen hinzugefügt werden, ersetzen Sie die Aluminiumfolie abdecken der Küvette öffnen mit einem Stopfen mit zwei Glasröhren eingefügt.
   8. Platzieren Sie die Fläschchen in den Inkubator in das Layout bestimmt früher.
   9. Sicher verbinden Sie den Schlauch, wie in Abbildung 1dargestellt.
   10. Überprüfen Sie, dass die Stopper fest in die Küvette Öffnungen herausgedrückt werden.
10. Zur Zeit 0 öffnen Sie das Regulierventil. Legen Sie den Durchflussmesser auf 3 L/min.
    Hinweis: Sprudeln wird in beiden Flaschen Wasser beobachtet richtige Gasstrom angibt. Wenn dies nicht der Fall ist, überprüfen Sie alle Verschlüsse sind eng und Schlauch ist ordnungsgemäß angeschlossen.
11. Schließen Sie den Inkubator und die Schütteldrehzahl auf ~ 200 u/min festgelegt. Einen Timer gestartet wird.
12. Richten Sie vor jeden Zeitpunkt das Filter-System wie oben in Schritt 1.9.3 beschreiben.
13. Haben Sie zu jedem Zeitpunkt (z.B., 5 min, 10 min, etc.) zwei Personen schnell die Zellen wie folgt bearbeiten:
    1. Ego: den entsprechende Kolben aus der Halterung zu entfernen und den Stopfen (mit Glasrohr angeschlossen).
       Hinweis: Dies nicht den Fluss der N₂ einer der verbleibenden Kulturflaschen bricht aber unterbricht vorübergehend die Strömung zu der letzten Wasserabscheider.
    2. Zweite Person: Pipettieren 1 mL der Kultur und in eine Küvette zu verzichten. Schließen Sie den Schlauch aus der Kultur-Flasche, die jetzt am Ende der Zeile bis zum letzten Wasserabscheider (eine Röhre und ein Stopfen wird dabei entfernt werden.). Dann messen Sie Zellkonzentration in der Küvette, wie oben in Schritt 1.9.4 beschrieben.
    3. Ego: Gießen Sie den Rest der Kultur in der Vakuumfiltration System, und führen Sie dann filtern und Einfrieren, wie oben in Schritt 1.9.5 beschrieben.
14. Wenn Sie fertig sind mit den Zeitpunkten, schalten Sie das N₂ Gas. Schließen Sie zunächst den Regler und warten Sie, bis der Druck zum lösen, und dann schalten Sie den Durchflussmesser. Schließlich zerlegen Sie das System zu und reinigen Sie alle Materialien mit Wasser und dann 70 % Ethanol.

2. RNA-Extraktion

1. Bereiten Sie RLT-Puffer zur Reinigung von RNA-Spalte, wie in der Materialtabellebeschrieben.
2. Bereiten Sie eine funktionierende Lösung der DNase durch Zugabe von 10 µL der DNase Vorratslösung zu 70 µL Puffer RDD pro Probe (siehe Materialtabelle).
3. Entfernen Sie die 50 mL Röhrchen mit Filter und Zellen von-80 ° C Gefrierschrank zu und auf Eis auftauen (ca. 15 min). Führen Sie die folgenden Schritte mit Röhren auf dem Eis.
4. Beschriften Sie 2 mL Schraubverschluss Röhrchen und legen Sie sie auf dem Eis, eine Röhre für jede Probe. Jedes Rohr, mit einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch zu schöpfen und messen die Perlen fügen Sie ~0.6 mL säuregewaschen Perlen hinzu.
5. Die 50 mL Röhrchen 0,6 mL kaltem Puffer RLT hinzufügen.
6. Pipettieren rauf und runter zu Zellen aus Filter entfernen und suspendieren in Lösung. Lassen Sie den Filter in der Lösung bleiben, da der Filter wird die Lösung einweichen. Entfernen Sie alle Lösung absorbiert in den Filter mithilfe der Pipettieren Spitze, um den Filter gegen die Wand des Rohres zu quetschen.
7. Übertragen Sie alle Flüssigkeit aus der 50 mL-Tube, der Schraubverschluss-Röhrchen mit Perlen.
8. Legen Sie die Schraubverschluss-Röhrchen in eine Korn-Mühle-Homogenisator und 1 min laufen lassen.
   Legen Sie sofort die Röhren für 3 min auf Eis. Wieder, setzen Sie die Rohre in den Homogenisator und 1 min laufen lassen.
9. Entfernen Sie die Rohre aus den Homogenisator und Platz für 5 min auf Eis. Die Perlen werden auf den Boden der Röhrchen abrechnen.
10. Führen Sie die restlichen Schritte bei Raumtemperatur.
11. Mit einem Pipettieren übertragen nur die lysate (~ 350 µL), die Perlen zu einem neuen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch zu vermeiden.
12. Microcentrifuge für 2 min bei max. Drehzahl und übertragen Sie dann den Überstand zu einem neuen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
13. Fügen Sie 1 Volumen von 70 % Ethanol (aus 200 Beweis Molekularbiologie-Klasse Ethanol). Mischen Sie gut durch pipettieren.
14. Übertragen Sie die Lösung und einem Niederschlag einer RNA-Spalte, die in einem 2 mL Sammlung Rohr platziert wurde.
15. Zentrifuge für 15 s bei ≥12, 000 X g und entsorgen der durchströmten (die Flüssigkeit im Rohr).
16. Die Spalte 350 µL Puffer RW1 hinzufügen. Zentrifuge für 15 s bei ≥12, 000 X g und entsorgen der durchströmten.
17. Fügen Sie 80 µL DNase ich Inkubation mischen, um die Spalte-Membran (nicht bekommen, auf Seiten des Rohrs) und für 15 min sitzen lassen.
18. Spalte 350 µL Puffer RW1 hinzufügen. Microcentrifuge für 15 s bei ≥12, 000 X g und entsorgen der durchströmten.
19. Die Spalte 500 µL Puffer RPE hinzufügen. Microcentrifuge für 15 s bei ≥12, 000 X g und entsorgen Durchflussverfahren.
20. Die Spalte 500 µL Puffer RPE hinzufügen. Microcentrifuge für 2 min bei ≥12, 000 X g.
21. Sorgfältig entfernen Sie die Spalte und legen Sie in eine neue 2 mL Sammelröhrchen. Microcentrifuge auf Hochtouren für 1 min (um die Membran vollständig zu trocknen).
22. Entsorgen Sie das Sammelröhrchen und setzen Sie die Säule zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Die Spalte Membran 30 µL RNase-freies Wasser hinzufügen.
23. Eluieren Sie die RNA aus der Spalte von Microcentrifuging für 1 min bei ≥12, 000 X g. Beim Laden der Spalten in der Microcentrifuge sicherstellen Sie, dass die Deckel von dem Sammelrohr in Richtung stehen die Zentrifuge dreht sich um die Lider Abbruch zu verhindern.
24. Hinzu kommt ein weiterer 30 µL RNase-freies Wasser der Spalte Membran, unter Beibehaltung der Spalte in der gleichen Microcentrifuge Schlauch.
25. Microcentrifuge für 1 min bei ≥12, 000 X g, so dass die endgültige Eluat Lautstärke 60 µL.
26. Speichern Sie jede 1,5 mL Röhrchen mit 60 µL RNA in den-80 ° C Gefrierschrank.

3. Bestimmung der RNA-Konzentration und Qualität

1. Messen Sie die Konzentration von RNA und DNA in jeder RNA-Probe mit (a) Fluorometer, (b) DNA und RNA-spezifische fluoreszierende Farbstoffe und (c) Assay Röhren, wie in der Materialtabelleaufgeführt. Folgen Sie den Anweisungen der Fluorometer und Farbstoffe.
2. Alternativ messen die Nukleinsäure-Konzentration mit einem UV-Spektrophotometer setzen bei 260 nm.
   Hinweis: Eine A-₂₆₀ -Lesung von 1,0 entspricht ~ 40 µg/mL einsträngige RNA.
3. RNS-Qualität testen, indem Sie die RNA auf einem kommerziellen Nukleinsäure-Analysator ausgeführt (siehe Materialtabelle) oder auf einem standard Formaldehyd/Agarose gel ²⁶.

(4) RNA-Seq-Analyse

1. Bilden Sie aus den Gesamtbestand der RNA 21 µL von 100 ng/µL RNA in RNase-freies Wasser. Verwenden Sie 1 µL von diesem 21 µL, um die RNA-Konzentration wie oben beschrieben zu testen. Senden Sie die restlichen 20 µL (2 µg) gesamte-RNS eine externe Sequenzierung Center für mRNA Bereicherung, Strang-spezifischen Bibliothek Vorbereitung (mit acht oder mehr Barcodes für multiplexing) und Sequenzierung (siehe Materialtabelle). Alternativ lokal führen Sie mRNA Bereicherung und Bibliothek Vorbereitung aus, und senden Sie die Bibliothek für die Sequenzierung.
2. Pool acht oder mehr gemultiplexten Proben und Sequenz in eine Spur der nächsten Generation Sequenzer.
3. Laden Sie die FASTQ-Datei mit allen von der Sequenz liest und der entsprechende Index liest. Außerdem laden Sie die Textdatei mit den Multiplex-Barcodes.
   Hinweis: Der Index liest können in einer separaten Datei FASTQ vorhanden sein. Legen Sie alle diese Dateien in einem Verzeichnis.
4. Legen Sie das Shell-Skript zur Verfügung gestellt hier, "fastq_pipeline.sh" im gleichen Verzeichnis. Bearbeiten Sie das Skript als angemessen für das Experiment und die Computer-Verzeichnisse.
   Hinweis: dieses Skript enthält umfangreiche Anmerkungen die Schritte erklären. In Kürze die Skript-Qualität trimmt die liest, ordnet der liest das Genom und erzeugt eine tabulatorgetrennte Datei, enthält die Anzahl der Lesevorgänge pro gen für jede Probe.
5. Die FASTQ Dateien und raw lesen Sie Zähldaten auf NCBIs Gene Expression Omnibus vor Veröffentlichung ²⁷einzahlen. Befolgen Sie die Anweisungen für "Submitting Hochdurchsatz-Sequenzdaten, GEO": https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/seq.html.
6. Importieren Sie die gelesenen Daten in R statistische Umwelt und führen Sie statistische Analyse mit dem R-Skript zur Verfügung gestellt hier, "Time_course_script. R". Bearbeiten Sie das Skript als angemessen für das Experiment und die Computer-Verzeichnisse.
   Hinweis: Dieses Skript enthält umfangreiche Anmerkungen die Schritte erklären. Kurz gesagt, dieses Skript importiert die gelesenen Daten, normalisiert das liest, Gene, die im Laufe der Zeit erheblich ändern, führt PCA Analyse und Grafiken die Expression von ausgewählten Genen identifiziert.

Ergebnisse

Die Hypoxie zeitlichen Verlauf und RNA-Seq-Analyse wurden unabhängig dreimal durchgeführt. Um die Reproduzierbarkeit der drei Wiederholungen zu untersuchen, wurde Genexpressionsdaten für alle Gene mit Principal Komponente Analysis (PCA) analysiert. Abbildung 2 zeigt, wie die Proben über die ersten beiden Hauptkomponenten verändern die 58,9 % der Variabilität darstellen. Diese Analyse ergab, dass jeder zeitlichen Verlauf ähnliche Veränderungen zeigt (w...

Diskussion

In dieser Studie wurde die mRNA-Niveaus für alle Gene während Hypoxie in der Hefe S. Cerevisiaegemessen. Ziel war es, wie die globalen Veränderungen der Genexpression durch Wachstum in einer kontrollierten Umgebung in der Nähe von anoxischen analysieren. Mehrere Maßnahmen wurden ergriffen, um sicherzustellen, dass die hier beschriebene Methode sorgfältig kontrolliert und reproduzierbar war. Erstens Zellen einer genau definierten hypoxischen Umgebung ausgesetzt waren: 99,999 % N₂ in rich-Media (Y...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Enclosed dry incubator	Thermo Scientific	MaxQ 4000	Set at 30 °C. Modify the door to allow entry of one Tygon tube. Alternatively, use the New Brunswick G25 incubator, which contains a tube port. Do not use an open-air water shaker, as condensation will collect in the tubes between flasks, possibly cross-contaminating cultures.
Micro-analysis Filter Holder	Millipore	XX1002530	25mm diameter, stainless steel support, no. 5 perforated silicone stopper mounts in standard 125 mL filtering flask
Strong vacuum	Edwards	E-LAB 2	The “house” vacuum may be too weak. Alternatively, use an electric-power portable vacuum pump like the one listed here.
1,000 mL flask			To act as vacuum trap.
~2 foot lengths of Heavy Wall Vacuum Tubing, inner diameter 3/8 in, outer diameter 7/8 in	Tygon	38TT	Two pieces: the first connects vacuum to trap, and the second connects trap to filter system.
High-pressure N2 gas tank			99.999% purity, >1,000 psi, with a regulator and gas flow controller
Autoclaved 500 mL flask			Opening covered with aluminum foil. One for each yeast strain.
Autoclaved 250 mL flasks			Openings covered with aluminum foil. One for each time point plus two for water traps.
Flask stoppers (size 6, two holes with 5 mm diameter)			Sterilized with 70% ethanol. One for each flask.
Glass tubing, length 9 cm or 17 cm, inner diameter 2 mm, outer diameter 5 mm			Sterilized with 70% ethanol. Two tubes for each flask. Place into the holes of each stopper. See Figure 1 for placement of 9- vs 17- cm tubes.
~25 cm lengths of plastic tubing, inner diameter 5 mm	Tygon	E-3603	One piece for each flask. Sterilized with 70% ethanol.
Sterile filter discs	Millipore	HAWP02500	25 mm diameter, 0.45 µm pore size, one for each time point
Sterile dH2O (~100 mL)
1 mL cuvettes			For measuring OD600 (i.e., cell concentration)
50 mL sterile centrifuge tubes			One for each time point
Clean and sterile tweezers
liquid nitrogen			For freezing cells
acid-washed beads	Sigma	G8772	Keep at 4 °C for lysing cells
Qiagen RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	For RNA column purification
Qiagen RLT buffer			Prepare by adding 10 µL of β-Mercaptoethanol per 1 mL of RLT buffer, keep at 4 °C.
2 mL collection tubes	Qiagen		included in the Qiagen Rneasy Mini Kit
Buffer RPE	Qiagen		included in the Qiagen Rneasy Mini Kit
Buffer RW1	Qiagen		included in the Qiagen Rneasy Mini Kit
DNase I stock and working solutions	Qiagen	79254	The DNase I enzyme comes as lyophilized powder in a glass vial. Using a sterile needle and syringe, inject 550 µL of RNase-free water (provided in Qiagen kit) into the vial. Mix by gently inverting the bottle. To avoid denaturing the enzyme, do not vortex. Using a pipet, remove this stock solution from the vial and store in freezer (-20 °C) in single-use aliquots (80 µL each). The stock solution should not be thawed and refrozen.
Buffer RDD	Qiagen		included in the Qiagen DNase Kit
Ice cold 2 mL screw-cap tubes			For lysing cells during RNA extraction
bead mill homogenizer	Biospec Mini-Beadbeater-24	112011	Keep in cold room
Bacto Peptone	BD	DF0118	for liquid YPD media
Bacto Yeast Extract	BD	DF0886	for liquid YPD media
glucose	Fisher	D16	for liquid YPD media
Qubit assay tubes	Thermo Fisher	Q32856	for measuring nucleic acid concentration
Quant-iTTM dsDNA BR Assay Kit	Thermo Fisher	Q32853	for measuring nucleic acid concentration
Quant-iTTM RNA Assay Kit	Thermo Fisher	Q32855	for measuring nucleic acid concentration
Qubit Fluorometer	Thermo Fisher	Q33216	for measuring nucleic acid concentration
Commercial electrophoresis system	Agilent	Bioanalyzer 2100	for measuring nucleic acid quality
Next-generation sequencer	Illumina	HiSeq 2500	for sequencing libraries
automated liquid handling system	Wafergen	Apollo 324	for creating sequencing libraries
PrepX PolyA mRNA Isolation Kit	Wafergen	400047	for isolating mRNA from total RNA
PrepX RNA SEQ for Illumina Library Kit	Wafergen	400039	for creating strand-specific sequencing libraries from total RNA
Barcode Splitter			https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d
Samtools, which includes the gzip command			http://www.htslib.org/download/
Trimmomatic			http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic
Bowtie2 (installed before TopHat)			http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml
TopHat			https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml
HTSeq			http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html
R (installed before R Studio)			https://cran.rstudio.com
R Studio (free version)			https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/