מדידת רמות ה-mRNA לאורך זמן במהלך שמרים ס' cerevisiae ובשפתיים התגובה

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול בעזרת RNA-seq לנטר את רמות ה-mRNA לאורך זמן במהלך התגובה שתקבעו של cerevisiae ס תאים. בשיטה זו ניתן להתאים לנתח ביטוי גנים במהלך כל תגובה תאית.

Abstract

מתחם שינויים בביטוי הגנים מתווכים בדרך כלל חלק גדול של תגובה תאית. כל הגן עשויים להשתנות הביטוי קינטיקה ייחודי כמו הגן מוסדר על ידי עיתוי מסוים אחד של גירויים רבים, איתות המסלולים או השפעות משניות. כדי לתפוס את הגן כולו ביטוי בתגובה היפוקסיה ב שמרים cerevisiae ס, ניתוח ה-RNA-seq שימש כדי לנטר את רמות ה-mRNA של כל הגנים במועדים ספציפיים לאחר חשיפה היפוקסיה. היפוקסיה הוקמה על ידי גידול תאי גז₂ ~ 100% N. חשוב, בניגוד מחקרים אחרים שתקבעו, ergosterol, חומצות שומן בלתי רוויות לא נוספו לכלי התקשורת כי מטבוליטים אלה משפיעים על ביטוי גנים. נקודות זמן נבחרו בטווח של 0 - 4 שעות לאחר היפוקסיה כי תקופה זו לוכדת את השינויים העיקריים בביטוי הגנים. בכל נקודה בזמן, היו תאים ובשפתיים יומן אמצע במהירות מסונן, קפוא, הגבלת החשיפה O₂ ו הנלווה שינויים בביטוי הגנים. RNA הכולל היה שחולצו מן התאים, משמש כדי להעשיר את ה-mRNA, אשר לאחר מכן הוסב cDNA. CDNA זו, נוצרו ספריות מולטיפלקס, דגימות 8 או יותר היו וסודרו בנתיב אחד של ברצף הדור הבא. צינור שלאחר רצף מתואר, אשר כוללת חיתוך בסיס איכות, לקרוא מיפוי וקביעת מספר קריאות לכל הגנים. DESeq2 סביבת סטטיסטי של R שימשה לזיהוי גנים לשנות באופן משמעותי בכל אחד של נקודות זמן שתקבעו. ניתוח של משכפל ביולוגי שלושה גילה הפארמצבטית גבוהה, הגנים של קינטיקה שונות ומספר רב של ציפה O₂-מוסדר גנים. שיטות אלה שניתן להשתמש כדי ללמוד כיצד התאים של אורגניזמים שונים מגיבים היפוקסיה לאורך זמן ו הותאם ללמוד ביטוי גנים במהלך תגובות אחרים התאית.

Introduction

אורגניזמים רבים מגיבים היפוקסיה או O נמוך₂, על ידי שינוי גנטי ביטוי ^1,2,3. תגובה זו מסייעת להתמודד עם חוסר קריטי עבור נשימה אירובית, כמה תגובות biosynthetic הוחלף נגזר מצע, אלא גם עם מצב חמצון-חיזור המשתנים ⁴תאים. מספר מחקרים microarray הופיעה cerevisiae ס מראים כי רמות ה-mRNA של מאות גנים שינוי בתגובה היפוקסיה ^5,6,-^7,-^8,-^{9 , 10 , 11 , 12}. לאחרונה, ה-RNA-seq שימש לאפיין שינויים בביטוי הגנים לאורך זמן במהלך היפוקסיה ¹³. כאן מוצגים הפרטים ניסיוני ודן.

היפוקסיה יכול להיעשות בדרכים שונות, כל אחת לייצר רמה שונה של O₂. . הנה, היפוקסיה הוקמה על ידי זורם באופן רציף אולטרא-גבוה-טוהר N₂ לתוך מבחנות, אשר מוריד את [O₂] התפרקה באופן מיידי עם קינטיקה לשחזור ¹⁰. זה אפשרי כי ישנם כמה O₂ מולקולות נוכח שתורמים ביטוי חילוף החומרים, ג'ין אבל סביבה זו נחשבת מאוד קרוב אנאירובית. בהיעדר O₂, תאי שמרים לא biosynthesize heme, ergosterol, חומצות שומן בלתי רוויות ^4,12,14. לכן, מחקרים קודמים כללו מטבוליטים אלה כאשר גדל שמרים ללא חמצן ^5,10,15. עם זאת, תגובות ובשפתיים רבים הם מתווכת על ידי דלדול של מטבוליטים אלה, ובכך חידוש אותם מפלות ^12,16תגובות ביטוי גנים ובשפתיים. כדי לחקות היפוקסיה טבעי, מטבוליטים אלה לא נוספו לכלי התקשורת. בזמן הקצר כי תאים נחשפו היפוקסיה ללא הנוכחות של מטבוליטים חיוניים אלה, היה ללא עלייה ניכרת מוות תאי (נתונים לא מוצג) ולא של מתח ממושך בתגובה ¹³.

התגובה היא גם תלויה במתח, גנוטיפ שלה. חשוב במיוחד הם אללים של הרגולטורים הידוע של תגובות ובשפתיים ². רקע המתח S288C רצוי מאוד כך ניתן להשוות תוצאות המחקרים גנומית אחרים עם זן זה. עם זאת, S288C מכיל של אלל אובדן-של-פונקציה חלקית מתוך HAP1 ג'ין ¹⁷, הרגולטור תעתיק קריטיים על התגובה ובשפתיים. אלל הזה תוקן ב- S288C באמצעות wildtype העתק מן Σ1278b זן רקע ¹¹.

ביטוי גנים הוא תלוי מאוד הסביבה התאית. לפיכך, בעת ביצוע ניתוח mRNA הגנום כולו, חשוב לשמור על סביבה מתמדת תוך שינוי פרמטר נוסף כגון זמן, גירוי או גנוטיפ. כדי להשיג תוצאות מאוד לשחזור, שקול שיטות עבודה מומלצות שלושה אלה לצורך המחקר ואת כל שלה ביולוגי או טכנית משכפל. קודם כל, experimenter(s) אותו צריך לבצע את המחקר, מאז שיטות טכניות עשויים להשתנות על פני ניסויים. שנית, מאותה אצווה של מרכיבים אמור לשמש בתקשורת צמיחה כמו כל אצווה יש קומפוזיציה שונה במקצת, אשר יכולים להשפיע על ביטוי גנים. שלישית, כדי למזער את ההשפעות מחזור התא, כל נקודת זמן צריכה להכיל תאים אסינכרוני בשלב אמצע יומן של צמיחה (1-2 x 10⁷ תאים/mL).

כאשר אפיון תגובה מורכבים כמו התגובה ביטוי גנים היפוקסיה, קורס זמן הוא יתרון בקביעת את קינטיקה של אירועים שונים. נקודות זמן מסוים צריך להיבחר כי ללכוד את השינויים העיקריים של התגובה. במחקר זה, נצפו נקודות זמן בין 0 ל- 4 שעות, כי ניסויים קודמים חשפו נרחבת שינויים בביטוי הגנים במהלך תקופה זו, ¹³.

כדי למדוד ביטוי גנים גלובלית, RNA-seq היה בשימוש ^18,19. שיטה זו משתמשת הדור הבא רצפי כדי לקבוע שפע יחסי התעתיק של ג'ין כל. לעומת ניתוח microarray DNA, RNA-seq תערוכות רגישות גבוהה יותר (כדי לזהות תעתיקים פחות בשפע), טווח דינמי גדול (למדוד שינויים קיפול גדול), הפארמצבטית סופריור (לעקוב במדויק ביטוי גנים לאורך זמן). בדרך כלל, רנ א ביותר הסלולר היא ribosomal RNA שפותחו שיטות רבות להעשרת RNA ספציפיים מינים ²⁰. . פולי-T חרוזים שימשו לטיהור poly-A-המכיל mRNA תעתיקים, למרות השונות מסחרית - ערכות דלדול rRNA זמינים גם יכול להיות יעיל ב- mRNA העשרה.

כאן, התאפיינה התגובה ביטוי cerevisiae ס גנים היפוקסיה. התאים היו חשופים היפוקסיה, ואז לטעום-8 נקודות זמן (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180, 240 דקות). כדי לאשר הפארמצבטית וכדי לזהות תעתיקים סטטיסטית שהשתנו, משכפל ביולוגי שלוש בוצעו. RNA היה שחולצו על ידי הפרעה מכנית וטיהור עמודה ולאחר מכן מעובד לניתוח RNA-seq. הצינור שלאחר רצף מתואר, תכנות סקריפטים ניתנים לאפשר שכפול מדויק של הניתוחים שבוצעו. באופן ספציפי, Trimmomatic ²¹, TopHat2 ²², HTseq ²³, את הסביבה סטטיסטי R ²⁴, ו DESeq2 חבילה ²⁵ שימשו כדי לעבד את הנתונים RNA-seq לזיהוי גנים ועוד 607 חסימות לשנות באופן משמעותי במהלך היפוקסיה. ניתוח גורמים ראשיים (PCA), ביטוי גנים של משכפל ציינו את הפארמצבטית של הטכניקה. שירות האשכולות, heatmaps גילה ביטוי נרחב קינטיקה, בעוד מפענוח אונטולוגיה (קדימה) הראה כי תהליכים תאיים רבים, כמו נשימה אירובית, מועשרים בערכה של גנים מוסדר חמצן.

Protocol

1. גרימת היפוקסיה

1. יום אחד או יותר לפני הקורס זמן היפוקסיה: הכנת החממה, תא הסינון מערכת ואקום, מיכל הדלק, מבחנות, פקקים, צינורות זכוכית, אבובים, כמו שולחן חומרים.
2. הנח את N₂ טנק, חממה, ואקום ומערכת סינון בסמיכות, כדי לאפשר עיבוד מהיר של תאים.
3. הכן סטרילי מדיה YPD נוזלי (1% תמצית שמרים, peptone 2%, 2% גלוקוז) על ידי ערבוב המרכיבים בקבוק זכוכית, autoclaving.
4. תכנון הפריסה של מבחנות בחממה.
   הערה: ממיכל₂ N, הבקבוק הראשון תהיה מלכודת מים, הבקבוקון השני תהיה הנקודה בפעם האחרונה, הבקבוק השלישי יהיה נקודת זמן ברגע האחרון וכן הלאה עד הבקבוק האחרון אשר הוא מלכודת מים הסופי. איור 1 מציג את סדר והקשרים בין המבחנות.
5. יום לפני זמן הקורס לחסן מושבה שמרים לתוך תרבות של 5 מ ל נוזל YPD בתוך מבחנה סטרילית. באופן ספציפי, להרים מושבה מלא מצלחת באמצעות מקל המוליך סטרילי. מקם את המקל לתוך YPD נוזלי ומנערים את המקל עד רוב התאים ההשעיה.
6. לסובב את הצינורות ב 30 מעלות צלזיוס למשך הלילה (h ~ 16).
   הערה: אחרי ה' 16, wildtype תאים ישתפרו רוויה (~ 2 x 10⁸ תאים למ"ל), המצוין על-ידי תרבות מעונן מאוד. זנים אחרים עשויה להימשך זמן רב להגיע רוויה, צריך להיבדק על ידי מדידת ריכוז תא עם ספקטרופוטומטרים, כפי שמצוין בשלב 1.9.4.
7. ביום של מסלול הזמן, לאחר 16 h של דגירה, לדלל את התרבות רווי 1:50 על-ידי שימוש של pipet מ למקום 4 מיליליטר לילה תרבות לתוך 196 מ של YPD נוזלי בתוך בקבוקון סטרילי 500 מ"ל. לגדול עם טלטול-~ 200 סל ד במשך 4 שעות ב- 30 ° C.
   הערה: לאחר 4h, תרבות wildtype תגיע ריכוז יומן אמצע של ~ 1-2 x 10⁷ תאים/מ ל....
8. במהלך 4 שעות, תווית המבחנות (ממלכודות היפוקסיה ומים), 50 מ ל אוסף צינורות. אם החממה בשלב 1.7 לעיל אינו בשימוש עבור הקורס זמן היפוקסיה, להפעיל את חממה אחרים ולהגדיר 30 ° C.
9. לפני העמדת תאים היפוקסיה:
   1. להוסיף שתי המבחנות סטרילי 250 מ ל אשר ישמש המלכודות מים ~ 50 מ ל מים.
   2. ממלאים ¹/₃ של קרח דלי עם חנקן נוזלי ויציפו מתלה פוליסטירן מוקצף להחזיק 50 מ ל צנטריפוגה צינורות.
   3. להגדיר את מערכת סינון עבור איסוף תאים. להוסיף דיסק מסנן סטרילי אל יחידת התחתון של מערכת סינון באמצעות פינצטה סטרילי, נזהר רק לגעת קצות התקליטור מסנן. למקם את יחידת מסנן העליון על גבי יחידת התחתון מסנן ולאבטח עם המלחצות מסופק עם המערכת. ודא כי היחידות תחתון ועליון מיושרים, שהוא חותם צר, אין נזילה.
   4. מודדים את ריכוז תא עם ספקטרופוטומטרים. לדלל תאים כך הם ניתן למדוד טווח ספקטרופוטומטרים-OD₆₀₀ בין ~0.2 - 0.6, בהתאם ספקטרופוטומטרים ליניארי.
      הערה: יחידה אחת של₆₀₀ יתר היא ~ 3 x 10⁷ תאים למ"ל, בהתאם ספקטרופוטומטרים ומורפולוגיה של תא. ריכוז של ~ 1-2 x 10⁷ תאים למ"ל צפוי, המתאים OD₆₀₀ של ~0.33 - 0.66.
   5. להשיג במהירות את דוגמת הזמן 0.
      1. להתחבר למערכת מסנן ואקום חזק (~ 10 mbar) דרך צינורות ואקום מלכודת הבקבוק 1,000 מ. הפעל את שואב האבק. שופכים את התרבות (בדרך כלל ~ 20 מ"ל) לתוך יחידת העליון ולחכות נוזלי להילקח דרך המסנן (~ 10 s, סומך על כוחו של שואב האבק).
      2. בזהירות הסר את התקליטור מסנן עם פינצטה נקייה ומניחים לתוך שפופרת צנטרפוגה 50 מ. מיד למקם את צינור צנטריפוגה המדף שקועים חנקן נוזלי. חשוב לציין, לא מראש מקררים הצינורות לפני הוספת המסנן את כל הצינורות תתפוצץ.
      3. לאחר > 30 s, במקום הצינור בפריזר-80 ° C לחילוץ RNA מאוחר יותר. לאחר כל סינון, לנקות ולהרכיב מערכת סינון. לשטוף את המערכת על ידי משיכת מים 10 s ללא דיסק מסנן. לבסוף, לנגב היבש המערכת עם מגבת נייר.
   6. לדלל את התרבות 4 שעות לתוך מבחנות שונות על הנקודות זמן שונים, כך כל הבקבוק מגיע באמצע יומן ריכוז (~ 1-2 x 10⁷ תאים/mL) בנקודת הזמן המצוין של היפוקסיה.
      הערה: טבלה 1 מציגה דילולים ששימשו המתח הפלואידי פראי-סוג S288C HAP1⁺ . מומלץ לבחון כל הזנים בתנאים אלו תרבות ובשפתיים ולהתאים את דילולים בהתאם.
   7. ברגע תאים ומדיה מתווספים מבחנות, החלף את רדיד האלומיניום המכסה את הבקבוק עם פקק המכיל שני צינורות זכוכית מוכנס.
   8. הצב המבחנות בחממה בפריסה נקבע קודם לכן.
   9. להתחבר באופן מאובטח לאורך צינור כמוצג באיור1.
   10. בדוק כל פקקים יידחפו בחוזקה לתוך הפתחים הבקבוק.
10. בזמן 0, פתח את השסתום הרגולטור. לאחר מכן הגדר את מד זרימה 3 L/min.
    הערה: מבעבעים יתקיימו בשני בקבוקי מים, המציינת את זרימת הגז המתאים. אם זה לא המקרה, בדוק כי כל פקקים הדוקות אבובים מחובר כראוי.
11. סגירת החממה ולהגדיר את מהירות חזק ~ 200 סל"ד. להפעיל טיימר.
12. לפני כל נקודת זמן, להגדיר את מערכת הסינון כפי שמתוארות למעלה בשלב 1.9.3.
13. בכל פעם נקודה (למשל, 5 דקות, 10 דקות, וכו '), יש שני אנשים לעבד במהירות את התאים כדלקמן:
    1. האדם הראשון: להסיר את הבקבוק המתאים ממחזיק ולהוציא את הפקק (עם צינורות זכוכית מצורף).
       הערה: זה לא ישברו את הזרימה של N₂ לכל המבחנות תרבות שנותרו אך זמנית ישבור את זרימת למלכודת המים האחרון.
    2. המשתמש השני: Pipet 1 מ"ל של תרבות ונותנות לתוך cuvette. חבר מחדש את הצנרור מן הבקבוק תרבות זה עכשיו בסוף השורה האחרונה מלכודת מים (שפופרת אחת ווויל פקק אחד ניתן להסיר בתהליך.). לאחר מכן, למדוד ריכוז תא cuvette, כפי שתואר לעיל בשלב 1.9.4.
    3. האדם הראשון: שופכים את השארית של התרבות לתוך מערכת סינון אבק, ולאחר מכן לבצע הקפאה כמתואר לעיל בשלב 1.9.5 וסינון.
14. לאחר סיום כל נקודות זמן, לכבות את הגז₂ N. תחילה סגור הרגולטורים ולא לחכות הלחץ לשחרר, ולאחר מכן כבות מד זרימה. לבסוף, לפרק את המערכת ולנקות כל החומרים עם מים, ולאחר מכן 70% אתנול.

2. RNA החילוץ

1. להכין מאגר RLT RNA עמודות טיהור, כפי שמתואר בטבלה חומרים.
2. להכין הפתרון עובד של DNase על-ידי הוספת 10 µL של הפתרון מניות DNase µL 70 מאגר לקט לבוא איתך לכל דגימה (ראה טבלת חומרים).
3. להסיר את הצינורות 50 מ ל המכיל מסנני ותאים מהמקפיא-80 ° C ומניחים על הקרח להפשיר (~ 15 דקות). בצע את השלבים הבאים עם צינורות על קרח.
4. תווית 2 mL צינורות כובע בורג ומניחים אותם על קרח, שפופרת אחת עבור כל דגימה. להוסיף ~0.6 מ"ל של חרוזים המחומצנים כל שפופרת, באמצעות צינור microcentrifuge 1.5 mL סקופ ולמדוד את החרוזים.
5. להוסיף 0.6 מ"ל של מאגר RLT קר הצינורות 50 מ.
6. Pipet למעלה ולמטה כדי להסיר תאים ממסנן והשהה לתוך פתרון. הימנע נותן את המסנן נשארים בתמיסה כפי המסנן לספוג את הפתרון. להסיר כל פתרון נספג את המסנן על-ידי שימוש בקצה pipet לסחוט את המסנן הקיר של הצינור.
7. העברה כל הנוזל מהצינור 50 מ ל הצינורות בורג-כיפה המכילה חרוזים.
8. למקם את הצינורות בורג-קאפ מהמגן מיל חרוז ולרוץ מין אחד.
   מיד במקום הצינורות על קרח למשך שלוש דקות. שוב, למקם את הצינורות מהמגן ולרוץ מין אחד.
9. הסר את הצינורות מהמגן והמקום בקרח במשך 5 דקות. החרוזים יסדר לתחתית של הצינורות.
10. בצע את שאר השלבים בטמפרטורת החדר.
11. עם pipet, להעביר רק את lysate (~ 350 µL), הימנעות את החרוזים, אל צינור 1.5 מ ל microcentrifuge.
12. Microcentrifuge למשך 2 דקות מהירות מקסימלית, ואז העברת תגובת שיקוע צינור 1.5 מ ל microcentrifuge.
13. להוסיף נפח 1 של 70% אתנול (ייוצרו מאתנול הוכחה לביולוגיה מולקולרית כיתה 200). מערבבים היטב בעזרת pipetting.
14. להעביר את הפתרון וכל precipitate לעמודה ה-RNA הושם בתוך צינור אוסף 2 מ"ל.
15. צנטריפוגה 15 s-≥12, 000 x g , להשליך הזרימה דרך (הנוזל בצינור).
16. µL 350 מאגר RW1 להוסיף העמודה. צנטריפוגה 15 s-≥12, 000 גרם x, להשליך הזרימה דרך.
17. להוסיף 80 µL DNase אני הדגירה מיקס למוח עמודה (לא לעלות על צידי הצינור) מאפשרים לשבת למשך 15 דקות.
18. להוסיף 350 µL מאגר RW1 עמודה. Microcentrifuge s-≥12 15, 000 x g , להשליך הזרימה דרך.
19. להוסיף 500 µL מאגר RPE העמודה. Microcentrifuge s-≥12 15, 000 x g ו להשליך זרימה דרך.
20. להוסיף 500 µL מאגר RPE העמודה. Microcentrifuge למשך 2 דקות ב≥12, 000 x g.
21. בזהירות להסיר את העמודה, למקם את צינור אוסף 2 מ"ל. Microcentrifuge במלוא המהירות עבור 1 דקות (כדי הקרום יבש לחלוטין).
22. למחוק את הצינור אוסף ולמקם את העמודה לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL. להוסיף 30 µL של מים נטולי RNase קרום עמודה.
23. Elute את הרנ א מן העמודה על-ידי microcentrifuging עבור 1 דקות ב≥12, 000 x g. בעת טעינת העמודים לתוך microcentrifuge, ודא שהמכסים של הצינור אוסף פונות לכיוון לצנטריפוגה ספינים, כדי למנוע את המכסים מנתק מגע.
24. להוסיף עוד 30 µL של מים נטולי RNase ממברנה עמודה, תוך שמירה על העמודה בצינור microcentrifuge אותו.
25. Microcentrifuge עבור 1 דקות ב≥12, 000 x g, כך שאמצעי האחסון eluate הסופי 60 µL.
26. לאחסן כל שפופרת 1.5 mL המכיל 60 µL של RNA במקפיא-80 ° C.

3. קביעת ריכוז ה-RNA ואיכות

1. למדוד את הריכוז של RNA ו- DNA בכל מדגם ה-RNA, באמצעות fluorometer (a), צבע (b) DNA ו RNA-ספציפי פלורסנט וצינורות assay (ג), כפי שמפורט בטבלה חומרים. בצע את ההוראות של fluorometer ושל הצבעים.
2. לחלופין, מודדים את ריכוז חומצת גרעין עם ספקטרופוטומטרים UV שוכן בגובה 260 ננומטר.
   הערה: קריאת₂₆₀ A של 1.0 הוא שווה ערך ל RNA חד-גדילי ~ 40 µg/mL.
3. מבחן RNA איכות על ידי הפעלת את הרנ א על מנתח מסחרי חומצת גרעין (ראה טבלת חומרים) או על תקן פורמלדהיד/agarose ג'ל ²⁶.

4. RNA-seq ניתוח

1. מן המלאי RNA הכולל, לפצות µL 21 של 100 ng/µL RNA במים נטולי RNase. השתמש µL 1 של זו µL 21 כדי לבדוק את ריכוז ה-RNA כמפורט לעיל. שלח את הנותרים 20 µL (2 µg) הכולל רנ א רצף חיצוני מרכז העשרה mRNA, הכנת ספריה ספציפית סטרנד (עם 8 או יותר ברקודים עבור ריבוב) ורצף (ראה טבלת חומרים). לחלופין, לבצע באופן מקומי mRNA העשרה והכנה ספריה, ולאחר מכן לשלוח לספרייה. רצף.
2. בריכת 8 או יותר דוגמאות מרובבת ואת רצף בנתיב אחד של ברצף הדור הבא.
3. הורד את הקובץ FASTQ המכיל את כל הקריאות רצף וקורא האינדקס המתאים. כמו כן, הורד את קובץ הטקסט המכיל את מולטיפלקס ברקודים.
   הערה: קריאות אינדקס עשוי להיות נוכח קובץ נפרד FASTQ. מקם את כל הקבצים האלה לתוך ספרייה אחת.
4. במקום ה-script של מעטפת שסופק כאן, "fastq_pipeline.sh", באותה ספריה. ערוך את התסריט הזה לפי הצורך את הניסוי וספריות המחשב.
   הערה: קובץ script זה מכיל הסברים נרחבים להסביר את הצעדים. בקצרה, איכות התסריט שמקצרת את הקריאות ממפה את הקריאות הגנום, יוצרת קובץ מופרד באמצעות טאב המכיל את מספר קריאות לפי ג'ין עבור כל דגימה.
5. להפקיד את FASTQ קבצים ונתונים גולמיים ספירת קריאה לתוך Omnibus ביטוי גנים של NCBI לפני פרסום ²⁷. בצע את ההוראות עבור "Submitting נתונים תפוקה גבוהה רצף גיאוגרפי": https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/seq.html.
6. ייבוא נתוני ספירת קריאה לסביבת סטטיסטי של R ולבצע ניתוח סטטיסטי, שימוש ב- script של R שסופק כאן, "time_course_script. R". ערוך את התסריט הזה לפי הצורך את הניסוי וספריות המחשב.
   הערה: קובץ script זה מכיל הסברים נרחבים להסביר את הצעדים. בקצרה, קובץ script זה מייבא את הנתונים קריאה, מווסת את הקריאות, מזהה את הגנים לשנות בצורה משמעותית במהלך הזמן, מבצע ניתוח PCA וגרפים את הביטוי של גנים שנבחרו.

תוצאות

מסלול הזמן היפוקסיה וניתוח RNA-seq בוצעו באופן עצמאי שלוש פעמים. כדי לבחון את הפארמצבטית של משכפל שלוש, ג'ין ביטוי נתונים עבור כל הגנים היה נותחה באמצעות ניתוח הרכיב העיקרי (PCA). איור 2 מציג כיצד לשנות הדוגמאות על הרכיבים העיקריים שני הראשונים, אשר ביחד מייצגים...

Discussion

במחקר זה, רמות ה-mRNA של כל הגנים נמדדה במהלך היפוקסיה ב ס cerevisiaeהשמרים. המטרה הייתה לבחון שינויים בביטוי גנים איך כלליים עקב גדילה בסביבה מבוקרת ליד-אנאוקסיים. מספר פעולות נעשו כדי להבטיח כי השיטה המתוארת כאן היה מבוקר ובזהירות לשחזור. ראשית, תאים נחשפו לסביבה ובשפתיים מוגדרים במדויק: 99....

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Enclosed dry incubator	Thermo Scientific	MaxQ 4000	Set at 30 °C. Modify the door to allow entry of one Tygon tube. Alternatively, use the New Brunswick G25 incubator, which contains a tube port. Do not use an open-air water shaker, as condensation will collect in the tubes between flasks, possibly cross-contaminating cultures.
Micro-analysis Filter Holder	Millipore	XX1002530	25mm diameter, stainless steel support, no. 5 perforated silicone stopper mounts in standard 125 mL filtering flask
Strong vacuum	Edwards	E-LAB 2	The “house” vacuum may be too weak. Alternatively, use an electric-power portable vacuum pump like the one listed here.
1,000 mL flask			To act as vacuum trap.
~2 foot lengths of Heavy Wall Vacuum Tubing, inner diameter 3/8 in, outer diameter 7/8 in	Tygon	38TT	Two pieces: the first connects vacuum to trap, and the second connects trap to filter system.
High-pressure N2 gas tank			99.999% purity, >1,000 psi, with a regulator and gas flow controller
Autoclaved 500 mL flask			Opening covered with aluminum foil. One for each yeast strain.
Autoclaved 250 mL flasks			Openings covered with aluminum foil. One for each time point plus two for water traps.
Flask stoppers (size 6, two holes with 5 mm diameter)			Sterilized with 70% ethanol. One for each flask.
Glass tubing, length 9 cm or 17 cm, inner diameter 2 mm, outer diameter 5 mm			Sterilized with 70% ethanol. Two tubes for each flask. Place into the holes of each stopper. See Figure 1 for placement of 9- vs 17- cm tubes.
~25 cm lengths of plastic tubing, inner diameter 5 mm	Tygon	E-3603	One piece for each flask. Sterilized with 70% ethanol.
Sterile filter discs	Millipore	HAWP02500	25 mm diameter, 0.45 µm pore size, one for each time point
Sterile dH2O (~100 mL)
1 mL cuvettes			For measuring OD600 (i.e., cell concentration)
50 mL sterile centrifuge tubes			One for each time point
Clean and sterile tweezers
liquid nitrogen			For freezing cells
acid-washed beads	Sigma	G8772	Keep at 4 °C for lysing cells
Qiagen RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	For RNA column purification
Qiagen RLT buffer			Prepare by adding 10 µL of β-Mercaptoethanol per 1 mL of RLT buffer, keep at 4 °C.
2 mL collection tubes	Qiagen		included in the Qiagen Rneasy Mini Kit
Buffer RPE	Qiagen		included in the Qiagen Rneasy Mini Kit
Buffer RW1	Qiagen		included in the Qiagen Rneasy Mini Kit
DNase I stock and working solutions	Qiagen	79254	The DNase I enzyme comes as lyophilized powder in a glass vial. Using a sterile needle and syringe, inject 550 µL of RNase-free water (provided in Qiagen kit) into the vial. Mix by gently inverting the bottle. To avoid denaturing the enzyme, do not vortex. Using a pipet, remove this stock solution from the vial and store in freezer (-20 °C) in single-use aliquots (80 µL each). The stock solution should not be thawed and refrozen.
Buffer RDD	Qiagen		included in the Qiagen DNase Kit
Ice cold 2 mL screw-cap tubes			For lysing cells during RNA extraction
bead mill homogenizer	Biospec Mini-Beadbeater-24	112011	Keep in cold room
Bacto Peptone	BD	DF0118	for liquid YPD media
Bacto Yeast Extract	BD	DF0886	for liquid YPD media
glucose	Fisher	D16	for liquid YPD media
Qubit assay tubes	Thermo Fisher	Q32856	for measuring nucleic acid concentration
Quant-iTTM dsDNA BR Assay Kit	Thermo Fisher	Q32853	for measuring nucleic acid concentration
Quant-iTTM RNA Assay Kit	Thermo Fisher	Q32855	for measuring nucleic acid concentration
Qubit Fluorometer	Thermo Fisher	Q33216	for measuring nucleic acid concentration
Commercial electrophoresis system	Agilent	Bioanalyzer 2100	for measuring nucleic acid quality
Next-generation sequencer	Illumina	HiSeq 2500	for sequencing libraries
automated liquid handling system	Wafergen	Apollo 324	for creating sequencing libraries
PrepX PolyA mRNA Isolation Kit	Wafergen	400047	for isolating mRNA from total RNA
PrepX RNA SEQ for Illumina Library Kit	Wafergen	400039	for creating strand-specific sequencing libraries from total RNA
Barcode Splitter			https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d
Samtools, which includes the gzip command			http://www.htslib.org/download/
Trimmomatic			http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic
Bowtie2 (installed before TopHat)			http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml
TopHat			https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml
HTSeq			http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html
R (installed before R Studio)			https://cran.rstudio.com
R Studio (free version)			https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/