JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, RNA-seq S. cerevisiae hücre hipoksik yanıt sırasında zamanla mRNA düzeyleri izlemek için bir iletişim kuralı'nı mevcut. Bu yöntem gen ekspresyonu herhangi bir hücresel yanıt sırasında analiz etmek için adapte edilebilir.

Özet

Karmaşık gen ekspresyonu değişimler genellikle bir hücresel yanıt büyük bir bölümünü aracılık. Gen bir sinyal yolları veya ikincil etkileri birçok uyaranların belirli zamanlaması tarafından düzenlenmiştir her gen ifadesi benzersiz Kinetik ile değişebilir. Tüm gen yakalamak için Maya S. cerevisiae, RNA-seq analiz hipoksi ifade yanıt hipoksi maruz kaldıktan sonra belirli zamanlarda tüm genler mRNA düzeyleri izlemek için kullanılır. Hipoksi ~ %100 N2 gaz hücrelerde büyüyen tarafından kurulmuştur. Bu metabolitler gen ekspresyonu etkilemez çünkü önemlisi, hipoksik diğer çalışmalar ergosterol ve doymamış yağ asitleri medyaya eklenmedi. O dönemde gen ekspresyonu önemli değişimler yakalar çünkü zaman puan 0 - 4 h hipoksi sonra dizi seçilmiştir. Her zaman noktada orta günlük hipoksik hücreleri hızlı bir şekilde edildi filtre ve dondurulmuş, O2 ve verebildiği gen ekspresyonu değişimler maruz sınırlayan. Toplam RNA hücrelerinden çıkarılan ve sonra cDNA için dönüştürülmüş mRNA için zenginleştirmek için kullanılır. Bu cDNA multiplex kitaplıkları oluşturulmuş olan ve sekiz veya daha fazla örnekleri yeni nesil Sekanslama bir şeritte sıralı. Sonrası sıralama boru hattı açıklanan, hangi eşleme ve okuma gen ücret belirleyerek okumak Kalite temel düzeltme içerir. DESeq2 R istatistiksel ortamında önemli ölçüde hipoksik zaman noktaları herhangi birini değiştirmek genlerin tanımlamak için kullanıldı. Üç biyolojik çoğaltır analizini ortaya yüksek tekrarlanabilirlik, farklı Kinetik genler ve çok sayıda beklenen O2-genler düzenlenir. Bu yöntemlerin nasıl çeşitli organizmalar hücrelerinin hipoksi için zaman içinde yanıt çalışırdım ve gen ekspresyonu diğer hücresel yanıt sırasında çalışmaya adapte.

Giriş

Çoğu organizma gen ifade 1,2,3değiştirerek hipoksi veya düşük O2, cevap verin. Bu yanıtı hücreleri bir substrat kritik birkaç biyosentetik reaksiyonlar ve Aerobik solunum için eksikliği ile aynı zamanda değişen bir Redoks devlet 4ile baş yardımcı olur. S. cerevisiae içinde gerçekleştirilen çeşitli Mikroarray çalışmalarda genler yüzlerce mRNA düzeyde hipoksi 5,6,7,8,9 yanıt olarak değiştirmek göstermek , 10 , 11 , 12. son zamanlarda, RNA-seq hipoksi 13sırasında zamanla gen ifade değişiklikleri tanımlamak için kullanıldı. Burada, deneysel detayları sunulmuştur ve tartışılmaktadır.

Hipoksi çeşitli şekillerde, her O2farklı bir düzeyde üreten elde edilebilir. Burada, hipoksi sürekli akan tarafından kurulmuştur [O2] düşüren ultra yüksek saflıkta N2 şişeler, içine çözünmüş hemen tekrarlanabilir Kinetik 10ile. Metabolizma ve gen ifade için katkıda bulunan bazı O2 molekülleri mevcut vardır ama bu ortamda çok yakın anaerobik olarak kabul olabilir. O2yokluğunda, Maya hücreleri biosynthesize heme, ergosterol ve doymamış yağ asitleri 4,12,14olamaz. Böylece, önceki çalışmalarda bu metabolitler Maya oksijen 5,10,15olmadan büyüyen dahil ettik. Ancak, birçok hipoksik yanıtları bu metabolitler tükenmesi tarafından aracılık ve böylece onları Yenileyici hipoksik gen ifade yanıt-e doğru 12,16tersine çevirir. Doğal hipoksi taklit etmek için bu metabolitler medyaya eklenmedi. Hücreler bu temel metabolitler varlığı olmaksızın hipoksi sinin kısa sürede hücre ölümü (veri gösterilmez) ne de uzun süreli stres yanıt 13fark hiçbir artış oldu.

Yanıt zorlanma ve tamamına onun genotipi bağlıdır. Hipoksik yanıt 2bilinen düzenleyiciler allelleri özellikle önemlidir. Böylece sonuçları bu gerilme ile gerçekleştirilen diğer genomik çalışmalar için karşılaştırılabilir S288C zorlanma arka plan son derece arzu edilir. Ancak, S288C HAP1 gen 17, hipoksik yanıt için kritik bir transkripsiyon regülatör kısmi bir işlev kaybı alleli içerir. Bu gen S288C içinde onarıldı bir wildtype kullanarak Σ1278b kopyadan zorlanma arka plan 11.

Gen ekspresyonu hücresel ortamı son derece bağlıdır. Böylece, genom çapında mRNA analiz yapılırken, zaman, uyarıcı veya genotip gibi başka bir parametre değişen süre sabit bir ortam sağlamak önemlidir. Son derece tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için çalışma için üç Bu yöntemler ve tüm onun biyolojik veya teknik çoğaltır göz önünde bulundurun. İlk olarak, teknik uygulamaları Denemecileri arasında farklılık bu yana aynı experimenter(s) çalışma taşımalıdır. İkinci olarak, her toplu iş iş gen ekspresyonu etkileyebilir biraz farklı bir kompozisyon olduğu gibi maddeler aynı toplu iş büyüme medyada kullanılmalıdır. Üçüncü olarak, hücre döngüsü etkileri en aza indirmek için her zaman noktası zaman uyumsuz hücrelerinin büyüme (1-2 x 107 hücre/mL) orta günlük aşamasında oluşmalıdır.

Hipoksi gen ifade yanıt gibi karmaşık bir yanıt karakterize, bir zaman ders çeşitli etkinlikler Kinetik belirlemek için avantajlıdır. Belirli zaman puan bu yanıtın önemli değişiklikler yakalayacaktır seçilmelidir. Son deneyler sırasında bu dönem 13gen ekspresyonu yaygın değişimler ortaya çünkü bu çalışmada, zaman puan 0 ve 4 h arasında gözlendi.

Küresel gen ekspresyonu ölçmek için kullanılan 18,19RNA-seq yapıldı. Bu yöntem yeni nesil sıralama her genin transkript göreli bolluk belirlemek için kullanır. DNA Mikroarray analizi için karşılaştırıldığında, RNA-seq (daha az bol Tutanaklar bulmak için) daha yüksek hassasiyet, büyük dinamik alan (daha fazla kat değişiklikleri ölçmek için) ve (gen ekspresyonu zaman içinde doğru bir şekilde takip etmek) üstün tekrarlanabilirlik sergiler. Genellikle, en hücresel RNA ribozomal RNA çok yöntemleri için belirli RNA türler 20zenginleştirmek için geliştirilmiştir olur. Burada, Poli-T boncuk mRNA Tutanaklar, Poli A içeren rağmen çeşitli ticari arındırmak için kullanılmıştır - kullanılabilir rRNA tükenmesi kitleri de mRNA zenginleştirme etkili olabilir.

Burada, S. cerevisiae gen ifade yanıt hipoksi olarak karakterize edildi. Hücreler için hipoksi maruz ve sekiz saat noktalarda örneklenmiş (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180 ve 240 dk). Tekrarlanabilirlik onaylamak ve istatistiksel olarak değiştirilen kayıtları tanımlamak için üç biyolojik çoğaltır yapıldı. RNA mekanik bozulma ve sütun arıtma tarafından çıkarılan ve RNA-seq analiz için işlenmiş. Sonrası sıralama boru hattı anlatılan ve izin veren tam çoğaltma analizleri gerçekleştirilen programlama komut dosyaları sağlanır. Trimmomatic 21, TopHat2 22, HTseq 23, R istatistiksel çevre 24ve 25 DESeq2 paket RNA-seq verileri işlemek için ve sırasında önemli ölçüde değiştirmek 607 genlerin tanımlamak için kullanılan özel olarak, hipoksi. Asıl bileşen analizi (PCA) ve gen ekspresyonu çoğaltır, teknik tekrarlanabilirlik göstermiştir. Aerobik solunum gibi birçok hücresel süreçler oksijen düzenlenir genler kümesinde zenginleştirilmiş gen Ontoloji (GO) çözümleme göstermek süre kümeleme ve heatmaps geniş çaplı ifade Kinetik, ortaya koydu.

Protokol

1. inducing hipoksi

  1. Bir gün veya daha önce hipoksi zamanlı Kurs: kuluçka makinesi hazırlamak, hücre filtreleme sistemi, vakum, gaz tankı, şişeler, stoper, cam boru ve kablo kanalları, Malzemeler tabloolduğu gibi.
  2. N2 tank, İnkübatör, vakum ve filtreleme sistemi hücreleri hızlı işlenmesini etkinleştirmek için birbirine yakın yerleştirin.
  3. Steril sıvı YPD medya (%1 Maya ekstresi, % 2 pepton, % 2 glikoz) bir cam şişe ve ısıyla bileşenlerinde karıştırarak hazırlayın.
  4. Şişeler kuluçka düzeni planı.
    Not: N2 tank ilk şişeye su tuzak olacak, ikinci şişeye son zaman noktası olacak, üçüncü şişeye ikinci son zaman noktası ve benzeri bir son su tuzağı son şişeye kadar olacak. Şekil 1 sipariş ve bağlantılar arasında şişeler gösterir.
  5. Zaman ders, önceki gün 5 mL sıvı YPD steril bir test tüpü içinde kültürünün içine maya kolonisi aşılamak. Özellikle, tam bir koloni steril aplikatör stick kullanarak bir plaka almak. Sopayı sıvı YPD içine yerleştirin ve hücrelerin çoğu süspansiyon kadar sopa sallamak.
  6. 30 ° c gece (~ 16 h) tüpler döndürün.
    Not: 16 h sonra çok bulutlu etik, kültürler tarafından belirtilen doygunluk (~ 2 x 108 hücre/mL), wildtype hücreleri elde edecek. Diğer suşları doygunluk ulaşmak için daha uzun sürebilir ve bir Spektrofotometre ile hücre konsantrasyonu ölçerek 1.9.4 adımda gösterildiği gibi test edilmelidir.
  7. 16 h, kuluçka, seyreltik sonra doymuş kültür zaman ders gününde 4 mL yerleştirmek için 5 mL damlalıklı kullanarak 1:50 kültür 196 mL steril 500 mL şişe içinde sıvı YPD içine bir gecede. 4 h 30 ° C'de için ~ 200 devirde sallayarak ile büyümek
    Not: 4 h sonra wildtype kültür ~ 1-2 x 107 hücre/mL orta günlük konsantrasyon ulaşacak.
  8. 4 h kuluçka sırasında etiket (için hipoksi ve su tuzakları) şişeler ve 50 mL koleksiyonu tüpler. Kuluçka makinesi 1.7 yukarıdaki hipoksi zamanlı Kurs için kullanılırsa, diğer kuluçka açın ve 30 ° C'ye ayarlayın
  9. Hipoksi için hücreleri tabi önce:
    1. ~ 50 mL su iki su tuzakları hizmet edecek steril 250 mL şişe ekleyin.
    2. Doldurmak 1/3 bir buz kovası ile sıvı azot ve 50 mL santrifüj tüpleri tutmak için polistren köpük raf daldırın.
    3. Hücreleri toplamak için filtre sistemi ayarlayın. Steril cımbız kullanarak filtrasyon sistemi alt birimi yalnızca filtre disk kenarlarının dokunmak dikkatli steril filtresi diske ekleyin. Filtre üst birimi filtresi alt birim üzerine yerleştirin ve sistemi ile sağlanan kelepçeler ile güvenli. Böylece sıkı bir mühür ve hiçbir sızıntı alt ve üst birimleri hizalandığından emin olun.
    4. Hücre konsantrasyonu ile Spektrofotometre ölçmek. Böylece Spektrofotometre-OD600 ~0.2 - 0,6, bağlı olarak Spektrofotometre arasında doğrusal dizi ölçülen hücreleri oranında seyreltin.
      Not: Bir OD600 ~ 3 x 107 hücre/mL, hücre morfolojisi ve Spektrofotometre bağlı birimdir. OD600 ~0.33 - 0.66, karşılık gelen bir konsantrasyon ~ 1-2 x 107 hücre/mL bekleniyor.
    5. Hızlı bir şekilde zaman 0 örneğinin elde edilir.
      1. Filtre sistemi güçlü (~ 10 mbar) elektrikli vakum tüp ve 1000 mL şişe tuzak üzerinden bağlayın. Vakum üzerine açın. Kültür (genellikle ~ 20 mL) üst birim içine dökün ve sıvı filtreden çekilecek bekleyin (~ 10 s, vakum gücüne bağlı olarak).
      2. Dikkatle temiz cımbız ile filtre diski çıkarın ve bir 50 mL santrifüj tüpüne yerleştirin. Hemen sıvı azot batık raf santrifüj tüpü yerleştirin. Önemlisi, tüpler tüpler patlayacak gibi filtre eklemeden önce önceden soğuk değil.
      3. Sonra > 30 s, yer-80 ° C dondurucu daha sonra RNA çıkarılması için tüpe. Her filtrasyon sonra temiz ve filtre sistemi yenilemek. Sistem, su için 10 çekerek durulama s filtre disk olmadan. Son olarak, sistem bir kağıt havlu ile kuru silin.
    6. Böylece her şişeyi orta günlük konsantrasyon (~ 1-2 x 107 hücre/mL) hipoksi belirtilen süre noktada ulaşır çeşitli zaman noktaları için farklı şişeler içine 4 h kültür sulandırmak.
      Not: Tablo 1 yaban tipi S288C HAP1+ haploit zorlanma için kullanılan dilutions gösterir. Bu her zorlanma bu hipoksik kültür koşullarında test etmek ve dilutions ona göre ayarlamanız önerilir.
    7. Hücreleri ve medya Şişeler için eklenen sonra eklenen iki cam tüp içeren bir tıpa ile açılış şişeye kapsayan alüminyum folyo yerine.
    8. Daha önce belirlenen düzeninde kuluçka şişe yerleştirin.
    9. Güvenli bir şekilde boru şekil 1' de gösterildiği gibi bağlayın.
    10. Tüm stoper sıkıca şişesi açıklıklar itilir kontrol edin.
  10. 0 zamanında regülatör Vanayı aç. Sonra AKIS METRESI 3 L/dak için ayarlayın.
    Not: Bubbling her iki su şişe uygun gaz akışını gösteren gözlenir. Yoksa, Bütün stoper sıkı ve boru düzgün takıldığından emin olun.
  11. Kuluçka makinesi kapatın ve sallama hızını ~ 200 rpm. Bir sayacı başlatmak.
  12. Her zaman noktası önce filtre sistemi yukarıda adım 1.9.3 tanımlamak olarak ayarlayın.
  13. Her zaman noktası (örneğin, 5 dk, 10 min, vb), süreç hızlı hücreleri aşağıdaki gibi iki kişi var:
    1. First person: sahibinden uygun şişeyi kaldır ve tıpa (ile cam tüp bağlı) almak.
      Not: Bu N2 akışının won't break herhangi kalan kültür şişeler ancak geçici olarak akışını son su tuzak için ara veriyoruz.
    2. Şahıs: Kültür 1 mL damlalıklı ve bir küvet dağıtmak. Şimdi satırın sonunda son su (bir tüp ve bu süreç içinde kaldırılması bir tıpa olacak.) tuzağı kültür balonun üzerinden boru yeniden bağlayın. Sonra hücre konsantrasyon küvet yukarıda 1.9.4. adımda açıklandığı gibi ölçmek.
    3. First person: kalan kültür vakum filtrasyon sistemi dökün ve filtreleme ve yukarıda 1.9.5. adımda açıklandığı gibi buz gibi gerçekleştirin.
  14. Zaman zaman puan ile bitmiş, N2 gaz kapalı dön. Regülatör kapatın ve basınç serbest bırakmak bekleyin ve ardından akış metre açın. Son olarak, sistem sökmeye ve su ve % 70 etanol ile tüm malzemeleri temiz.

2. RNA çıkarma

  1. RLT arabellek RNA sütun arıtma için Malzemeler tabloaçıklandığı şekilde hazırlayın.
  2. Dnaz hisse senedi çözüm 10 µL arabelleği RDD örnek başına 70 µL ekleyerek Dnaz çalışma çözeltisi hazırlamak ( Malzeme tabloyabakın).
  3. Filtreler ve-80 ° C dondurucu hücreleri içeren 50 mL tüpler kaldırın ve (~ 15 tezcan) Buza koyun. Buz üzerinde tüp ile aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
  4. 2 mL vidalı kapak tüpler etiket ve buz, her örnek için bir tüp üzerinde koyun. Asit yıkanmış boncuk ~0.6 mL kepçe ve boncuk ölçmek için 1.5 mL microcentrifuge tüp kullanarak her tüp için ekleyin.
  5. Soğuk RLT arabellek 0.6 mL 50 mL tüpler için ekleyin.
  6. Damlalıklı yukarı ve aşağı hücreleri filtreden kaldırın ve çözümde askıya için. Filtre çözüm kadar emmek şekilde çözümde kalır filtre izin kaçının. Tüm çözüm kaldırma tüp duvara filtre sıkmak için damlalıklı ipucu kullanarak filtre içine emilir.
  7. Tüm sıvı boncuk içeren vidalı kapak tüpler 50 mL tüp sizden aktarın.
  8. Vidalı kapak tüpler bir boncuk değirmen homogenizer yerleştirin ve bir dakika çalıştırın.
    Hemen tüpler buz üç dakika yerleştirin. Yine, tüpler homogenizer yerleştirin ve bir dakika çalıştırın.
  9. Homogenizer ve 5 min için buz üzerinde yer tüpler kaldırın. Boncuk tüplerinin altına razı olacak.
  10. Oda sıcaklığında adımları geri kalanını gerçekleştirmek.
  11. Sadece lysate (~ 350 µL), damlalıklı ile transfer için yeni bir 1.5 mL microcentrifuge tüp boncuk kaçınarak.
  12. Microcentrifuge max hız ve sonra aktarmak süpernatant yeni 1.5 mL microcentrifuge tüp, 2 dk için.
  13. %1 70 etanol (200 kanıt moleküler biyoloji-grade etanol yapılan) hacmi ekleyin. De pipetting tarafından karıştırın.
  14. Nakletmek belgili tanımlık eriyik ve herhangi bir 2 mL toplama tüp yerleştirilmiş bir RNA sütun için acele.
  15. Santrifüj (tüp sıvı) 15 s ≥12, 000 x g ve akışı üzerinden atmak için.
  16. 350 µL arabelleği RW1 sütununu ekleyin. Santrifüj 15 s ≥12, 000 x g ve akışı üzerinden atmak için.
  17. 80 µL eklemek Dnaz ben sütun membran karışıma kuluçka (Tüp iki tarafında alamadım) ve 15dk için oturmak için izin verir.
  18. 350 µL arabelleği RW1 sütununu ekleyin. Microcentrifuge 15 ≥12 s, 000 x g ve akışı üzerinden atmak için.
  19. Arabellek RPE 500 µL sütununu ekleyin. Microcentrifuge 15, ≥12 s, 000 x g ve atma için akış yoluyla.
  20. Arabellek RPE 500 µL sütununu ekleyin. Microcentrifuge ≥12, 000 x g, 2 dk için.
  21. Dikkatle sütun kaldırın ve yeni bir 2 mL toplama tüp içine yerleştirin. (Membran kurumasını için) Microcentrifuge 1 dk için tam hızda.
  22. Toplama tüp atın ve sütun 1.5 mL microcentrifuge tüp içine yerleştirin. Su RNase free 30 µL sütun membran için ekleyin.
  23. Sütundaki RNA microcentrifuging ≥12, 000 x g, 1 dk. için tarafından elute. Sütunları microcentrifuge yüklenirken, koleksiyon tüp kapakları kapakları kopması önlemek için santrifüj döner yönde dönük emin olun.
  24. Başka bir 30 µL RNase free su sütunu aynı microcentrifuge tüpte tutarken sütun membran için ekleyin.
  25. Microcentrifuge, ≥12, 000 x g, 1 dk. için böylece 60 µL son eluate birimdir.
  26. -80 ° C dondurucu RNA'ın 60 µL içeren her 1,5 mL tüp depolamak.

3. belirleyici RNA konsantrasyon ve kalite

  1. RNA ve DNA toplama her RNA örneğinde, (a) bir yer, (b) DNA ve RNA özel floresan boyalar ve (c) tahlil tüpler, Malzemeler tablokullanarak ölçmek. Yer ve boyalar uyunuz.
  2. Alternatif olarak, 260 ayarla bir UV Spektrofotometre ile nükleik asit konsantrasyonu ölçmek nm.
    Not: Bir A260 okuma 1.0 ~ 40 µg/mL tek iplikçikli RNA için eşdeğerdir.
  3. Test RNA kalitesi üzerinde bir ticari nükleik asit analyzer RNA çalıştırarak ( Malzeme tabloyabakın) veya standart bir formaldehit/özel 26jel.

4. RNA-seq analizi

  1. Toplam RNA stoktan 100 ng/µL RNA RNase free suda 21 µL oluşturur. Bu 21 µL 1 µL RNA konsantrasyon yukarıdaki gibi sınamak için kullanın. Kalan 20 µL (2 µg) toplam RNA bir mRNA zenginleştirme için dış sıralama Merkezi, strand özel kütüphane hazırlıkla (çoğullama için sekiz veya daha fazla barkod) göndermek ve sıralamanın ( Malzeme tabloyabakın). Alternatif olarak, yerel olarak mRNA zenginleştirme ve Kütüphane hazırlık gerçekleştirmek ve sonra kitaplık sıralama için gönderin.
  2. Sekiz veya daha fazla çoğaltılmış örnekler ve yeni nesil Sekanslama tek şeritli sırayla Havuzu.
  3. Tüm sıra okuma ve karşılık gelen dizin okuma içeren FASTQ dosyasını indirin. Ayrıca, multiplex barkodları içeren metin dosyasını indirin.
    Not: Dizin okuma ayrı bir FASTQ dosyada mevcut olabilir. Tüm bu dosyaları bir dizine yerleştirin.
  4. Burada, "fastq_pipeline.sh", aynı dizinde sağlanan kabuk komut dosyasını yerleştirin. Bu script deneme ve bilgisayar dizinleri için uygun şekilde düzenleyin.
    Not: Bu komut dosyası adımları açıklayan kapsamlı ek açıklamaları içerir. Kısacası, komut dosyası kalite okuma kırpar, okuma için genom haritaları ve her örnek için gen başına okuma sayısı içeren sekmeyle ayrılmış bir dosya oluşturur.
  5. FASTQ dosya ve ham okuma sayısı verileri NCBI'ın gen ifade Omnibus yayın 27önce Emanet. "GEO için yüksek üretilen iş sırası veri gönderilmesi" yönergelerini izleyin: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/seq.html.
  6. R istatistiksel ortama okuma sayısı verileri alabilir ve istatistiksel analiz, burada, "time_course_script. sağlanan R komut dosyası kullanma "R". Bu script deneme ve bilgisayar dizinleri için uygun şekilde düzenleyin.
    Not: Bu komut dosyası adımları açıklayan kapsamlı ek açıklamaları içerir. Kısacası, bu komut dosyası okuma verileri alır, okuma normalleştirir, önemli ölçüde zaman boyunca değiştirmek, PCA analiz yapan ve seçili genlerin ifade grafikler genler tanımlar.

Sonuçlar

Hipoksi zamanlı Kurs ve RNA-seq analiz bağımsız olarak üç kez yapıldı. Üç çoğaltır tekrarlanabilirlik incelemek için gen ifadesi verileri tüm genler için asıl bileşen analizi (PCA) kullanılarak analiz. Şekil 2 örnekleri birlikte 58.9 oranında değişkenlik gösteren ilk iki asıl bileşenleri üzerinde nasıl değişiklik gösterir. Bu analiz her zaman ders (tarafından her eğrinin şeklini benzer tasvir) benzer değişiklikler sergiley...

Tartışmalar

Bu çalışmada, mRNA düzeyleri tüm genler için sırasında hipoksi S. cerevisiaeMaya olarak ölçüldü. Nasıl küresel gen ifade değişiklikleri anoksik kontrollü bir ortamda büyüme nedeniyle analiz etmek için hedefi oldu. Burada anlatılan yöntem dikkatle kontrollü ve tekrarlanabilir emin olmak için çeşitli adımlar atılmıştır. İlk olarak, hücrelerin tam olarak tanımlanmış bir hipoksik ortamına maruz kaldılar: %99,999 N2 zengin medya (YPD). Hipoksi diğer çalışmaların ?...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Biz Lewis-Sigler Enstitüsü Princeton Üniversitesi'nde bütünleştirici genomik sıralama çekirdek tesisi için teknik danışmanlık ve RNA Kütüphane hazırlık ve sıralama için teşekkür ederim. Bu eser hibe Rowan Üniversitesi ve NIH NIGMS R15GM113187 M.J.H. tarafından desteklenmiştir

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Enclosed dry incubatorThermo ScientificMaxQ 4000Set at 30 °C. Modify the door to allow entry of one Tygon tube. Alternatively, use the New Brunswick G25 incubator, which contains a tube port. Do not use an open-air water shaker, as condensation will collect in the tubes between flasks, possibly cross-contaminating cultures.
Micro-analysis Filter HolderMilliporeXX100253025mm diameter, stainless steel support, no. 5 perforated silicone stopper mounts in standard 125 mL filtering flask
Strong vacuumEdwardsE-LAB 2The “house” vacuum may be too weak. Alternatively, use an electric-power portable vacuum pump like the one listed here.
1,000 mL flaskTo act as vacuum trap.
~2 foot lengths of Heavy Wall Vacuum Tubing, inner diameter 3/8 in, outer diameter 7/8 inTygon38TTTwo pieces: the first connects vacuum to trap, and the second connects trap to filter system.
High-pressure N2 gas tank99.999% purity, >1,000 psi, with a regulator and gas flow controller
Autoclaved 500 mL flaskOpening covered with aluminum foil. One for each yeast strain.
Autoclaved 250 mL flasksOpenings covered with aluminum foil. One for each time point plus two for water traps.
Flask stoppers (size 6, two holes with 5 mm diameter)Sterilized with 70% ethanol. One for each flask.
Glass tubing, length 9 cm or 17 cm, inner diameter 2 mm, outer diameter 5 mmSterilized with 70% ethanol. Two tubes for each flask. Place into the holes of each stopper. See Figure 1 for placement of 9- vs 17- cm tubes.
~25 cm lengths of plastic tubing, inner diameter 5 mmTygonE-3603One piece for each flask. Sterilized with 70% ethanol.
Sterile filter discsMilliporeHAWP0250025 mm diameter, 0.45 µm pore size, one for each time point
Sterile dH2O (~100 mL)
1 mL cuvettesFor measuring OD600 (i.e., cell concentration)
50 mL sterile centrifuge tubesOne for each time point
Clean and sterile tweezers
liquid nitrogenFor freezing cells
acid-washed beadsSigmaG8772Keep at 4 °C for lysing cells
Qiagen RNeasy Mini KitQiagen74104For RNA column purification
Qiagen RLT bufferPrepare by adding 10 µL of β-Mercaptoethanol per 1 mL of RLT buffer, keep at 4 °C.
2 mL collection tubesQiagenincluded in the Qiagen Rneasy Mini Kit
Buffer RPEQiagenincluded in the Qiagen Rneasy Mini Kit
Buffer RW1Qiagenincluded in the Qiagen Rneasy Mini Kit
DNase I stock and working solutionsQiagen79254The DNase I enzyme comes as lyophilized powder in a glass vial. Using a sterile needle and syringe, inject 550 µL of RNase-free water (provided in Qiagen kit) into the vial. Mix by gently inverting the bottle. To avoid denaturing the enzyme, do not vortex. Using a pipet, remove this stock solution from the vial and store in freezer (-20 °C) in single-use aliquots (80 µL each). The stock solution should not be thawed and refrozen.
Buffer RDDQiagenincluded in the Qiagen DNase Kit
Ice cold 2 mL screw-cap tubesFor lysing cells during RNA extraction
bead mill homogenizerBiospec Mini-Beadbeater-24112011Keep in cold room
Bacto PeptoneBDDF0118for liquid YPD media
Bacto Yeast ExtractBDDF0886for liquid YPD media
glucoseFisherD16for liquid YPD media
Qubit assay tubesThermo FisherQ32856for measuring nucleic acid concentration
Quant-iTTM dsDNA BR Assay KitThermo FisherQ32853for measuring nucleic acid concentration
Quant-iTTM RNA Assay KitThermo FisherQ32855for measuring nucleic acid concentration
Qubit FluorometerThermo FisherQ33216for measuring nucleic acid concentration
Commercial electrophoresis systemAgilentBioanalyzer 2100for measuring nucleic acid quality
Next-generation sequencerIlluminaHiSeq 2500for sequencing libraries
automated liquid handling systemWafergenApollo 324for creating sequencing libraries
PrepX PolyA mRNA Isolation KitWafergen400047for isolating mRNA from total RNA
PrepX RNA SEQ for Illumina Library KitWafergen400039for creating strand-specific sequencing libraries from total RNA
Barcode Splitterhttps://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d
Samtools, which includes the gzip commandhttp://www.htslib.org/download/
Trimmomatichttp://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic
Bowtie2 (installed before TopHat)http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml
TopHathttps://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml
HTSeqhttp://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html
R (installed before R Studio)https://cran.rstudio.com
R Studio (free version)https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/

Referanslar

  1. Semenza, G. L. Oxygen sensing, homeostasis, and disease. New Eng. J Med. 365 (6), 537-547 (2011).
  2. Butler, G. Hypoxia and gene expression in eukaryotic microbes. Annu. Rev. Micro. 67, 291-312 (2013).
  3. Ratcliffe, P. J. Oxygen sensing and hypoxia signalling pathways in animals: the implications of physiology for cancer. J. Physiol. 591 (Pt 8), 2027-2042 (2013).
  4. Rosenfeld, E., Beauvoit, B. Role of the non-respiratory pathways in the utilization of molecular oxygen bySaccharomyces cerevisiae. Yeast. 20 (13), 1115-1144 (2003).
  5. Ter Linde, J. J., et al. Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 181 (24), 7409-7413 (1999).
  6. Ter Linde, J. J., Steensma, H. Y. A microarray-assisted screen for potential Hap1 and Rox1 target genes in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 19 (10), 825-840 (2002).
  7. Kwast, K. E., et al. Genomic analyses of anaerobically induced genes in Saccharomyces cerevisiae: functional roles of Rox1 and other factors in mediating the anoxic response. J. Bacteriol. 184 (1), 250-265 (2002).
  8. Becerra, M., et al. The yeast transcriptome in aerobic and hypoxic conditions: effects of hap1, rox1, rox3 and srb10 deletions. Mol. Microbiol. 43 (3), 545-555 (2002).
  9. Lai, L. -. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. Dynamical remodeling of the transcriptome during short-term anaerobiosis in Saccharomyces cerevisiae: differential response and role of Msn2 and/or Msn4 and other factors in galactose and glucose media. Mol. Cell. Biol. 25 (10), 4075-4091 (2005).
  10. Lai, L. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. Metabolic-State-Dependent Remodeling of the Transcriptome in Response to Anoxia and Subsequent Reoxygenation in Saccharomyces cerevisiae. Euk. Cell. 5 (9), 1468-1489 (2006).
  11. Hickman, M. J., Winston, F. Heme levels switch the function of Hap1 of Saccharomyces cerevisiae between transcriptional activator and transcriptional repressor. Mol. Cell. Biol. 27 (21), 7414-7424 (2007).
  12. Hickman, M. J., Spatt, D., Winston, F. The Hog1 mitogen-activated protein kinase mediates a hypoxic response in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 188 (2), 325-338 (2011).
  13. Bendjilali, N., et al. Time-Course Analysis of Gene Expression During the Saccharomyces cerevisiae Hypoxic Response. G3. 7 (1), 221-231 (2017).
  14. Chellappa, R., et al. The membrane proteins, Spt23p and Mga2p, play distinct roles in the activation of Saccharomyces cerevisiae OLE1 gene expression. Fatty acid-mediated regulation of Mga2p activity is independent of its proteolytic processing into a soluble transcription activator. J. Biol. Chem. 276 (47), 43548-43556 (2001).
  15. Abramova, N. E., et al. Regulatory mechanisms controlling expression of the DAN/TIR mannoprotein genes during anaerobic remodeling of the cell wall in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 157 (3), 1169-1177 (2001).
  16. Hughes, A. L., Todd, B. L., Espenshade, P. J. SREBP Pathway Responds to Sterols and Functions as an Oxygen Sensor in Fission Yeast. Cell. 120 (6), 831-842 (2005).
  17. Gaisne, M., Bécam, A. M., Verdière, J., Herbert, C. J. A "natural" mutation in Saccharomyces cerevisiae strains derived from S288c affects the complex regulatory gene HAP1 (CYP1). Curr. Gen. 36 (4), 195-200 (1999).
  18. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Gen. 10 (1), 57-63 (2009).
  19. Anders, S., Huber, W. Differential expression analysis for sequence count data. Genome Biol. 11 (10), R106 (2010).
  20. Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biol. 17 (1), 13 (2016).
  21. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinf. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  22. Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36 (2013).
  23. Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq--A Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinf. 31 (2), 166-169 (2015).
  24. . R: A Language and Environment for Statistical Computing Available from: https://www.R-project.org (2015)
  25. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
  26. Brown, T., Mackey, K., Du, T. Analysis of RNA by Northern and Slot Blot Hybridization. Curr. Prot. Mol. Biol. 74, 4.9.1-4.9.19 (2004).
  27. Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nuc. Acids Res. 30 (1), 207-210 (2002).
  28. Cherry, J. M., et al. Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast. Nuc. Acids Res. 40, D700-D705 (2012).
  29. Hothorn, T., Everitt, B. S. . A Handbook of Statistical Analyses using R. , (2014).
  30. Saldanha, A. J. Java Treeview--extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
  31. Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc. Nat. Acad. Sci. 95 (25), 14863-14868 (1998).
  32. Davies, B. S. J., Rine, J. A Role for Sterol Levels in Oxygen Sensing in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 174 (1), 191-201 (2006).
  33. Meena, R. C., Kumar, N., Nath, S., Chakrabarti, A. Homologous Recombination is Activated at Early Time Points Following Exposure to Cobalt Chloride Induced Hypoxic Conditions in Saccharomyces cerevisiae. Ind. J. Microb. 52 (2), 209-214 (2012).
  34. Snoek, I. S. I., Tai, S. L., Pronk, J. T., Yde Steensma, H., Daran, J. -. M. Involvement of Snf7p and Rim101p in the transcriptional regulation of TIR1 and other anaerobically upregulated genes in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 10 (4), 367-384 (2010).
  35. Ellahi, A., Thurtle, D. M., Rine, J. The Chromatin and Transcriptional Landscape of Native Saccharomyces cerevisiae Telomeres and Subtelomeric Domains. Genetics. 200 (2), 505-521 (2015).
  36. Collart, M. A., Oliviero, S., et al. Preparation of yeast RNA. Curr. Prot. Mol. Biol. , (2001).
  37. Blankenberg, D., et al. Manipulation of FASTQ data with Galaxy. Bioinf. 24 (14), 1783-1785 (2010).
  38. Martini, P., et al. timeClip: pathway analysis for time course data without replicates. BMC Bioinf. 15, (2014).
  39. Oh, S., Song, S., Grabowski, G., Zhao, H., Noonan, J. P. Time series expression analyses using RNA-seq: a statistical approach. BioMed Res. Int. 2013, 1-16 (2013).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Genetiksay 126anaerobikaerobiktranscriptomeyeni nesilzaman dersMaya

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır