JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن هنا وصف مقايسة البلعمة باستخدام الخلايا الجنينية فرقت من ذبابة الفاكهة . أنها تمكننا من تحديد بسهولة ودقة في مستويات البلعمة في الجسم الحي ، وتحديد جزيئات جديدة مطلوبة للبلعمة من الخلايا أبوبتوتيك.

Abstract

الآليات الجزيئية الكامنة وراء البلعمة من الخلايا المبرمج تحتاج إلى توضيح أكثر تفصيلا بسبب دورها في الأمراض المستعصية المناعية والالتهابية. نحن هنا وضعت طريقة تجريبية للتحقيق البلعمة كميا باستخدام ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة ، والتي يتم الحفاظ على شبكة الجينات التي تسيطر على تفاعلات إفراز من الناحية الدستورية من الثدييات. من أجل الكشف بدقة والاعتماد ابتلاع و أون-فولشينغ البالعات باستخدام الحيوانات بأكملها، تم تجانس الأجنة ذبابة الفاكهة للحصول على الخلايا المشتتة بما في ذلك البالعات والخلايا الأبوطوزية. استخدام الخلايا الجنينية فرقت تمكننا من قياس في مستويات الكريات البلعمة في الجسم الحي كما لو أجرينا فحص البلعمة في المختبر الذي من الممكن لمراقبة جميع الخلايا البالعات والخلايا المبرمج في الأجنة كاملة وتحديد بدقة مستوى البلعمة. وأكدنا أن هذه الطريقة تستنسخ تلك الدراسات السابقةالتي حددت الجينات المطلوبة لبلعمة الخلايا المبرمج. هذا الأسلوب يسمح إغراق الخلايا الميتة ليتم تحليلها، وعندما جنبا إلى جنب مع علم الوراثة قوية من ذبابة الفاكهة ، وسوف تكشف عن تفاعلات البلعمة المعقدة تتألف من الهجرة، والاعتراف، إنغولفنت، وتدهور الخلايا الأبوطوزية من قبل البالعات.

Introduction

في الحيوانات ميتازوان، على سبيل المثال النيماتودا كينورهابديتيس ايليجانس ، ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر ، والفئران والبشر، وعدد كبير من الخلايا الخضوع لموت الخلايا المبرمج أثناء التنمية لتشكيل أجسامهم وفي مرحلة البلوغ للحفاظ على التوازن 1 ، 2 . الخلايا الأبوطوزية تحتاج إلى إزالتها بسرعة لأنها تحفز الالتهاب في الأنسجة المحيطة بها عن طريق الإفراج عن المواد المناعية داخل الخلايا إذا لم تتم إزالتها تماما 3 . من أجل تسهيل الإزالة السريعة، والخلايا أبوبتوتيك الحاضر ما يسمى أكل لي إشارات التي يتم التعرف عليها من قبل مستقبلات إنغولفنت من البالعات، ويتم القضاء عليها من قبل البلعمة 3 ، 4 ، 5 ، 6 . وهكذا، البلعمة تلعب دورا حاسما في الحفاظ على التوازن المضيف، وبالتالي، توضيح الجزيئية آليات لار الكامنة وراء البلعمة من الخلايا الأبوطوزية أمر ذو أهمية.

ويبدو أن الآليات المسؤولة عن البلعمة من الخلايا أبوبتوتيك محفوظة من الناحية الدستورية بين الأنواع في الديدان الخيطية والذباب والفئران 7 . العديد من المقايسات البلعمة متوفرة حاليا لتقييم تجتاح الخلايا المبرمج في هذه الحيوانات نموذج. في C. ايليجانس ، 131 الخلايا الجسدية الخضوع لعملية موت الخلايا المبرمجة خلال التنمية، وجثث الخلايا هي فاغوسيتوسد الخلايا المجاورة، والتي هي البالعات غير المهنية 8 . وهكذا، عد عدد جثث الخلايا المتبقية في C. ايليجانس يشير إلى مستوى البلعمة في الجسم الحي . من خلال البحث عن المسوخ النيماتودا التي تظهر عددا متزايدا من الخلايا الميتة، تم تحديد العديد من الجينات اللازمة لبلعمة وميز وراثيا 9 ، 10 ،s = "كريف"> 11 ، 12 .

السابقين فيفو مقايسات البلعمة مع البالعات الثقافة الأولية، الضامة عموما، وغالبا ما تستخدم في الفئران. يتم إعداد الخلايا الأبوطوزية باستخدام خطوط الخلايا مثل خلايا جوركات، ويتم خلطها مع البالعات الأولية. بعد حضانة لعدة ساعات، يتم حساب العدد الإجمالي للبالعات والبكم البالعات من أجل تقييم مستوى البلعمة. كتعديل متطور لهذه الطريقة، وضعت مجموعة ناغاتا مقايسة البلعمة خارج الجسم الحي مع الخلايا معربا عن إيكاد مقاومة كاسباس (المانع من الدناز تفعيلها كاسباس)، التي الخلايا الخمجية لا تخضع لتجزئة الحمض النووي موت المبرمج، ولكن لا يزال المشقوق الحمض النووي عندما الخلايا هي فاغوسيتوسد. عندما يتم استخدام هذه الخلايا كأهداف أبوبتوتيك في فحص البلعمة، فقط الحمض النووي للخلايا أبوبتوتيك اجتاحت هو مجزأة، وملطخة من قبل توسط بوساطة دوتب نيك نهاية وضع العلامات (تونيل). لذلك، ليفلتر من إنبولفنت الخلايا الخلوية يقاس من خلال عد إشارات تونيل في خليط من الخلايا البالعات والخلايا أبوبتوتيك 13 .

في D. ميلانوغاستر ، البالعات المهنية اسمه خلايا الدم، الضامة ذبابة الفاكهة ، هي المسؤولة عن البلعمة من الخلايا المبرمج 14 ، 15 . بالإضافة إلى المقايسات في البلعمة في المختبر مع خطوط الخلايا الثقافة، في المقايسات في البلعمة الجسم الحي مع الأجنة ذبابة الفاكهة كلها متوفرة. الأجنة ذبابة الفاكهة هي أداة قوية لفحص مستوى انحلال الخلايا المبرمج لأن العديد من الخلايا الخضوع لموت الخلايا المبرمج و فاجوسيتوسد من قبل خلايا الدم خلال التطور الجنيني 14 ، 15 ، 16 . مثال على في الجسم الحي فحص البلعمة هو الأسلوب الذي وضعته مجموعة الفرنك. في طريقتهم، هيموسيتس ديالتي يقودها المناعية من بيروكسيداسين، علامة الخلايا الهضمية، والملطخة الخلايا الأبوطوزية باستخدام الصبغة النووية، 7-أمينو أكتينوميسين D في الأجنة ذبابة الفاكهة كاملة، وعدد من الخلايا الإيجابية مزدوجة تحسب كإشارة من البلعمة 17 . ويستند مثال آخر على فحص البلعمة على الأجنة على مفهوم طريقة ناغاتا المذكورة أعلاه؛ ومع ذلك، يتم تقييمها في الجسم الحي البلعمة باستخدام أجنة dCAD (ذبابة الفاكهة كاسباس تنشيط الدناز) متحولة الذباب 18 و 19. هذه المقايسات في البلعمة الجسم الحي مفيدة لمراقبة مباشرة البلعمة في الموقع . ومع ذلك، ترتبط الصعوبات مع استبعاد أي تحيز ممكن في خطوة عد الخلايا البلعمة لأنه من الصعب أن نلاحظ جميع الخلايا البالعات والخلايا المبرمج في الأجنة كاملة بسبب سمكه.

من أجل التغلب على هذا القيد، ونحن نطورإد مقايسة البلعمة الجديدة في الأجنة ذبابة الفاكهة . في طريقة لدينا، من أجل الاعتماد بسهولة هيموسيتس البلعمة، يتم تجانس الأجنة كلها لإعداد الخلايا الجنينية فرقت. يتم الكشف عن البالعات بواسطة المناعية من علامة البلعمة، ويتم الكشف عن الخلايا المبرمج بواسطة تونيل مع هذه الخلايا الجنينية المشتتة. استخدام الخلايا الجنينية فرقت تمكننا من قياس في مستويات البلعمة في الجسم الحي كما لو أجرينا فحص البلعمة في المختبر الذي يحدد بدقة مستوى البلعمة. ويمكن استخدام جميع الأنماط الجينية للذباب في هذا الفحص إذا تطورت إلى المرحلة 16 من الأجنة 20 ، والمرحلة التنموية التي إزالة الخلايا المبرمج من البلعمة هو الأكثر وفرة. هذه الطريقة لديها ميزة تقييم مستوى البلعمة كميا، وبالتالي، يمكن أن تسهم في تحديد جزيئات جديدة تشارك في البلعمة من الخلايا الأبوطوزية في الجسم الحي .

Protocol

1. إعداد

  1. إعداد لوحات أجار عصير العنب الطازج
    1. إضافة 100 مل من الماء إلى 4.4 غرام من أجار، وتسخين الخليط في فرن الميكروويف لحل آجار.
    2. إضافة 80 مل من عصير العنب الطازج، 5 مل من حمض الخليك، و 5 مل من الإيثانول إلى محلول أجار.
    3. صب حوالي 1.5 مل من الحل مع ماصة على كل شريحة زجاجية، والسماح لها لتصلب.
  2. إعداد 6 سم أطباق الاغاروز طبق
    1. إضافة 50 مل من الماء إلى 0.5 غرام من الاغاروز، وتسخين الخليط في فرن الميكروويف لذوبان الاغاروز.
    2. صب حوالي 2.5 مل من محلول الاغاروز على طبق 6 سم مع ماصة.

2. المرحلة 16 مجموعة الجنين

  1. جمع الذباب الكبار، وإضافة 200 أنثى و 200 من الذكور في أنبوب مخروطي 50 مل.
  2. وضع لوحة من أجار عصير العنب الطازج على الخميرة في أنبوب 50 مل، وإغلاق مع الإسفنج كاص.
  3. احتضان الذباب في 16 درجة مئوية في ضوء لمدة 2 - 3 أيام. تغيير لوحة مرة واحدة في اليوم.
  4. نقل الذباب إلى الظلام عند 25 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  5. تغيير لوحة القديمة إلى واحدة جديدة دون الخميرة. السماح الذباب لوضع البيض لمدة 2 ساعة.
  6. جمع لوحة واحتضان عند 16 درجة مئوية لمدة 26 ساعة.
  7. جمع الأجنة من لوحة مع فرشاة الطلاء في 1 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.2٪ (ت / ت) تريتون X-100.
  8. غسل الأجنة مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.2٪ (ت / ت) تريتون X-100.
  9. من أجل إزالة المشيماء، إضافة 1.2 مل من محلول هيبوكلوريت الصوديوم (2.2 - 3.4٪ كل) إلى الأجنة لمدة 3 دقائق.
  10. غسل الأجنة 4 مرات مع 1 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.2٪ (ت / ت) تريتون X-100.
  11. وضع الأجنة على طبق الاغاروز 6 سم طبق. التقاط المرحلة 16 الأجنة تحت المجهر كما هو موضح من قبل روبرتس 20 . جمع ما يقرب من 50 الأجنة في 1.5 مل تريف أنبوب الاختبار الجزئي مع ميكروبيبيت.

3. بريباحصص الخلايا الجنينية

  1. غسل الأجنة مرتين مع 150 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
  2. التجانس الأجنة 30 مرات في 1.5 مل أنبوب الاختبار الجزئي وخلاط بيليه في وجود 200 ميكرولتر من كولاجيناز (0.25٪ (ث / ت)) في برنامج تلفزيوني.
  3. تفريق الخلايا الجنينية بيبتينغ 10 مرات، ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب 1.5 مل. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة في حمام مائي. كرر هذه الخطوة مرتين.
  4. إضافة 800 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لتعليق الخلية، وأجهزة الطرد المركزي في 1400 × ز في 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
  5. إزالة طاف وإضافة 200 ميكرولتر من التربسين (0.25٪ (ث / ت)) في برنامج تلفزيوني للخلايا. تفريق الخلايا الجنينية بواسطة بيبتينغ 50 مرة.
  6. رشح تعليق الخلية مع 70 ميكرون خلية مصفاة.
  7. من أجل وقف النشاط التربسين، إضافة 40 ميكرولتر الحرارة المعطل مصل البقري الجنين إلى تعليق الخلية المرسلة. إضافة 800 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي في 1400 x ز في 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
  8. قم بإزالة سوبيرناتانت، وتعليق الخلايا عجلت في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، وأجهزة الطرد المركزي في 1400 x ز في 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
  9. إزالة طاف، وتعليق الخلايا عجلت في 30 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
  10. جبل تعليق خلية أعدت على الشرائح الزجاجية المغلفة ثلاثي أكسيدكسيلان أمينوبروبيل، والانتظار لمدة 10-15 دقيقة حتى تعلق الخلايا على الشرائح الزجاجية.
  11. إزالة الحل المتبقي على الشرائح الزجاجية مع ماصة. جبل 60 - 70 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 4٪ (ث / ت) بفا (بارافورمالدهيد) على الخلايا لمدة 10 - 15 دقيقة للتثبيت.
  12. إزالة الحل التثبيت، ووضع الشرائح الزجاجية في برنامج تلفزيوني لأكثر من 1 دقيقة.

4. تلطيخ من خلايا الدم

  1. إمونوستينينغ مع الأجسام المضادة لمكافحة كروكيمورت
    1. متسلسل نقع الشرائح الزجاجية في الميثانول لمدة 10 دقيقة، في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.2٪ (ت / ت) تريتون X-100 لمدة 10 دقيقة، وبعد ذلك في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة.
    2. جبل 20 ميكرولتر من 5٪ (الخامس / الخامس) المصل الخنازير كله في برنامج تلفزيوني احتواءنغ 0.2٪ (v / v) تريتون X-100 على الخلايا لحجب. احتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
    3. إزالة الحل من الشرائح الزجاجية، وجبل 20 ميكرولتر من مصل مضاد للفصيلة كروكيمورت 19 ، 21 (0.1٪ (الخامس / الخامس)) في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.2٪ (ت / ت) تريتون X-100 على الخلايا. احتضان الشرائح في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
    4. نقع الشرائح الزجاجية في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.2٪ (ت / ت) تريتون X-100 لمدة 10 دقيقة 5 مرات.
    5. نقع الشرائح الزجاجية في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة.
    6. جبل 20 ميكرولتر من الفوسفاتيز القلوية المسمى المضادة للفئران مفتش (0.5٪ (الخامس / الخامس)) في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.2٪ (ت / ت) تريتون X-100 و 5٪ (ت / ت) مصل الخنازير كله على الخلايا في الغرفة درجة الحرارة لمدة 1 ساعة.
    7. نقع الشرائح الزجاجية في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.2٪ (ت / ت) تريتون X-100 لمدة 10 دقيقة 5 مرات.
    8. نقع الشرائح الزجاجية في العازلة التي تحتوي على 100 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 9.5، 100 ملي كلوريد الصوديوم، و 50 ملي مغكل 2 لمدة 10 دقيقة.
    9. جبل محلول الركيزة الفوسفاتيز التي تحتوي على 0.23 ملغ / مل 5 برومو -4كلورو-3-إندوليل-فوسفات (بسيب) و 0.35 مغ / مل نيترو الأزرق تيترازوليوم (نبت) و 100 ملي تريس-هكل ودرجة الحموضة 9.5 و 100 ملي كلوريد الصوديوم و 50 ملي مغكل 2 على الخلايا.
    10. مراقبة الخلايا تحت المجهر لالتلطيخ السليم. عندما تظهر إشارات الأرجواني قوية في حبيبات الخلايا الدموية، وإزالة الحل الركيزة، ونقع الشرائح الزجاجية في المخزن المؤقت تتكون من 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.5 و 1 ملي إدتا. تلوين لحوالي 5-10 دقيقة ينصح.
  2. إمونوستينينغ مع الأجسام المضادة لمكافحة غفب (خيار آخر لتلطيخ الخلايا الدموية)
    1. متسلسل نقع الشرائح الزجاجية في الميثانول لمدة 10 دقيقة، برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.2٪ (ت / ت) تريتون X-100 لمدة 10 دقيقة، وبرنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة.
    2. جبل 20 ميكرولتر من 5٪ (الخامس / الخامس) المصل الخنازير كله في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.2٪ (ت / ت) تريتون X-100 على الخلايا لحجب. احتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
    3. إزالة الحل على الشرائح الزجاجية، وجبل 20 ميكرولتر من الأجسام المضادة لمكافحة غفب الماوس (1٪ (الخامس / الخامس)) / برنامج تلفزيوني جالحصول على 0.2٪ (ت / ت) تريتون X-100 على الخلايا. احتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
    4. نقع الشرائح الزجاجية في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.2٪ (ت / ت) تريتون X-100 لمدة 10 دقيقة 5 مرات.
    5. نقع الشرائح الزجاجية في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة.
    6. جبل 20 ميكرولتر من الفوسفاتيز القلوية المسمى المضادة للفأر مفتش (0.5٪ (الخامس / الخامس)) في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.2٪ (ت / ت) تريتون X-100 و 5٪ (ت / ت) مصل الخنازير كله على الخلايا في الغرفة درجة الحرارة لمدة 1 ساعة.
    7. نقع الشرائح الزجاجية في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.2٪ (ت / ت) تريتون X-100 لمدة 10 دقيقة 5 مرات.
    8. نقع الشرائح الزجاجية في العازلة تتكون من 100 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 9.5، 100 ملي كلوريد الصوديوم، و 50 ملي مغكل 2 لمدة 10 دقيقة.
    9. جبل محلول الركيزة الفوسفاتيز تحتوي على 0.23 ملغ / مل بسيب، 0.35 ملغ / مل نبت، 100 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 9.5، 100 ملي كلوريد الصوديوم، و 50 ملي مغكل 2 على الخلايا.
    10. مراقبة الخلايا تحت المجهر لالتلطيخ السليم. عندما تظهر إشارات الأرجواني في هيموسيتس كاملة، وإزالة الحل الركيزة ونقع الشرائح في المخزن المؤقت تتكونمن 10 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك، PH8.5 و 1 ملي إدتا. ويوصى تلطيخ لمدة 10-15 دقيقة تقريبا.

5. الخلايا الأبوطوزية وصمة عار بواسطة تونيل

  1. نقع الشرائح الزجاجية في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
  2. كرر مع برنامج تلفزيوني جديد.
  3. جبل موازنة العازلة (انظر المواد الجدول) على الخلايا لمدة 10 دقيقة.
  4. إزالة الحل من الشرائح الزجاجية، وجبل 20 ميكرولتر من حل تدت تحتوي على 5 ميكرولتر من محطة ديوكسينوكلأوتيديل ترانسفيراز و 15 ميكرولتر من رد فعل العازلة على الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  5. إزالة الحل من الشرائح الزجاجية، ونقع الشرائح في العازلة تتكون من 0.5 مل ستوب / غسل العازلة و 17 مل من الماء.
  6. نقع الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق 3 مرات.
  7. جبل 20 ميكرولتر من مكافحة ديغوكيجينين-بيروكسيداز على الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  8. نقع الشرائح الزجاجية في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق 4 مرات.
  9. نقع الشرائح الزجاجية في محلول الركيزة البيروكسيديز تتكون من 30 مل من 50 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك، pH7.5 كونتينغا كامل ملعقة صغيرة من 3،3'- ديامينوبنزيدين تيترايدريكلوريد (داب)، و 0.002٪ (V / V) H 2 O 2 لمدة 30 ثانية.
  10. كرر الخطوة 5.9 حتى الخلايا الملطخة هي البني الملون. نقع الشرائح الزجاجية في الماء لوقف رد فعل البيروكسيديز.
  11. أرفق الخلايا بالماء للمراقبة.

6. قياس مستوى البلعمة من الخلايا أبوبتوتيك

  1. مراقبة العينات تحت المجهر الضوئي من أجل تقييم مستوى البلعمة. عد الخلايا إيجابية كروكيمورت أو خلايا إيجابية غفب كما خلايا الدم، الخلايا الإيجابية تونيل والخلايا الأبوطوزية، وخلايا إيجابية مزدوجة كما هيموسيتس البلعمة.
  2. ويعرف مؤشر البلعمة على أنه عدد الخلايا الإيجابية المزدوجة إلى العدد الإجمالي للخلايا إيجابية كروكيمورت أو الخلايا إيجابية غفب. فمن المستحسن أن يلاحظ أكثر من 300 هيموسيتس.

النتائج

من أجل دراسة البلعمة من الخلايا المبرمج، تم جمع الأجنة ذبابة الفاكهة من المرحلة التنموية 16 وأعدت الخلايا كما فرقت. كانت ملطخة الضامة، الضامة ذبابة الفاكهة ، من قبل إمونوسيتوشيميستري للعلامة كريات الخلايا "كروكيمورت" 17

Discussion

وصفنا هنا مقايسة البلعمة باستخدام الأجنة ذبابة الفاكهة . باستخدام الخلايا الجنينية المتناثرة لقياس البلعمة كميا، يتم الكشف عن الخلايا الدموية، البالعات المهنية ذبابة الفاكهة ، إمونوستيند ل كروسيمورت علامة الكريات البيض أو غفب srpHemo- مدفوعة، وخلاي?...

Disclosures

ويعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

ونحن ممتنون لكاز ناغوسا وأكيكو شيراتسوتشي على مشورتهم.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
whole swine serumMP Biomedicals55993For bloking
Treff micro test tube(easy fit)  Dnase, Rnase free tube, 1.5 mLTreffLab96. 4625. 9. 01For  homogenization
pellet mixer  1.5 mLTreffLab96. 7339. 9. 03For  homogenization
CollagenaseSigma-AldrichC-0130For preparation of embryonic cells
TrypsinThermo Fisher SCIENTIFIC27250-018For preparation of embryonic cells
Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, APKPL475-1612secondary antibody for
stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-phosphate		Roche11383221001BCIP, For staining of hemocytes
nitro blue tetrazoliumRoche11383213001NBT, For staining of hemocytes
Anti-Croquemort antibodydescribed previously in Manaka et al., J. Biol. Chem., 279, 48466-48476
 Anti-GFP
from mouse IgG1κ (clones 7.1 and 13.1) 		Roche11814460001For staining of hemocytes
Goat Anti-Mouse IgG-AP ConjugateBio-Rad170-6520secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection KitMilliporeS7100For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase.
3,3'-diaminobenzidine
tetrahydrichloride		nacalai tesque11009-41DAB, For staining of apoptoitc cells
Table of Fly Strains
NameStock centerStock IDComments
w1118Control flies, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
drprΔ5drpr mutant, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
Itgbn2Itgbn mutant, described in Devenport et al., Development, 131, 5405-5415
srpHemoGAL4 UAS-EGFPdescribed in Brückner et al., Dev. Cell., 7, 73-84
UAS-drpr-IRVDRC4833-
UAS-Itgbn-IRNIG-fly1762R-1-

References

  1. Danial, N. N., Korsmeyer, S. J. Cell death: critical control points. Cell. 116 (2), 205-219 (2004).
  2. Vaux, D. L., Korsmeyer, S. J. Cell death in development. Cell. 96 (2), 245-254 (1999).
  3. Savill, J., Fadok, V. Corpse clearance defines the meaning of cell death. Nature. 407 (6805), 784-788 (2000).
  4. Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses. Mol Cell. 14 (3), 277-287 (2004).
  5. Ravichandran, K. S., Lorenz, U. Engulfment of apoptotic cells: signals for a good meal. Nat Rev Immunol. 7 (12), 964-974 (2007).
  6. Ravichandran, K. S. Beginnings of a good apoptotic meal: the find-me and eat-me signaling pathways. Immunity. 35 (4), 445-455 (2011).
  7. Nakanishi, Y., Nagaosa, K., Shiratsuchi, A. Phagocytic removal of cells that have become unwanted: implications for animal development and tissue homeostasis. Dev Growth Differ. 53 (2), 149-160 (2011).
  8. Reddien, P. W., Horvitz, H. R. The engulfment process of programmed cell death in caenorhabditis elegans. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 193-221 (2004).
  9. Hedgecock, E. M., Sulston, J. E., Thomson, J. N. Mutations affecting programmed cell deaths in the nematode Caenorhabditis elegans. Science. 220 (4603), 1277-1279 (1983).
  10. Ellis, R. E., Jacobson, D. M., Horvitz, H. R. Genes required for the engulfment of cell corpses during programmed cell death in Caenorhabditis elegans. Genetics. 129 (1), 79-94 (1991).
  11. Gumienny, T. L. CED-12/ELMO, a novel member of the CrkII/Dock180/Rac pathway, is required for phagocytosis and cell migration. Cell. 107 (1), 27-41 (2001).
  12. Hsu, T. Y., Wu, Y. C. Engulfment of apoptotic cells in C. elegans is mediated by integrin alpha/SRC signaling. Curr Biol. 20 (6), 477-486 (2010).
  13. Hanayama, R. Identification of a factor that links apoptotic cells to phagocytes. Nature. 417 (6885), 182-187 (2002).
  14. Tepass, U., Fessler, L. I., Aziz, A., Hartenstein, V. Embryonic origin of hemocytes and their relationship to cell death in Drosophila. Development. 120 (7), 1829-1837 (1994).
  15. Gold, K. S., Bruckner, K. Macrophages and cellular immunity in Drosophila melanogaster. Semin Immunol. 27, 357-368 (2015).
  16. Abrams, J. M., White, K., Fessler, L. I., Steller, H. Programmed cell death during Drosophila embryogenesis. Development. 117 (1), 29-43 (1993).
  17. Franc, N. C., Heitzler, P., Ezekowitz, R. A., White, K. Requirement for croquemort in phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila. Science. 284 (5422), 1991-1994 (1999).
  18. Mukae, N., Yokoyama, H., Yokokura, T., Sakoyama, Y., Nagata, S. Activation of the innate immunity in Drosophila by endogenous chromosomal DNA that escaped apoptotic degradation. Genes Dev. 16 (20), 2662-2671 (2002).
  19. Manaka, J. Draper-mediated and phosphatidylserine-independent phagocytosis of apoptotic cells by Drosophila hemocytes/macrophages. J Biol Chem. 279 (46), 48466-48476 (2004).
  20. Roberts, D. B. . Drosophila: A Practical Approach. , 3868-3878 (1998).
  21. Kuraishi, T., et al. Pretaporter, a Drosophila protein serving as a ligand for Draper in the phagocytosis of apoptotic cells. Embo j. 28 (24), 3868-3878 (2009).
  22. Franc, N. C., Dimarcq, J. L., Lagueux, M., Hoffmann, J., Ezekowitz, R. A. Croquemort, a novel Drosophila hemocyte/macrophage receptor that recognizes apoptotic cells. Immunity. 4 (5), 431-443 (1996).
  23. Kuraishi, T. Identification of calreticulin as a marker for phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila. Exp Cell Res. 313 (3), 500-510 (2007).
  24. Nagaosa, K. Integrin betanu-mediated phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila embryos. J Biol Chem. 286 (29), 25770-25777 (2011).
  25. Nonaka, S., Nagaosa, K., Mori, T., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. Integrin alphaPS3/betanu-mediated phagocytosis of apoptotic cells and bacteria in Drosophila. J Biol Chem. 288 (15), 10374-10380 (2013).
  26. Fujita, Y., Nagaosa, K., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. Role of NPxY motif in Draper-mediated apoptotic cell clearance in Drosophila. Drug Discov Ther. 6 (6), 291-297 (2012).
  27. Bruckner, K., et al. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev Cell. 7 (1), 73-84 (2004).
  28. Nonaka, S., et al. Signaling Pathway for Phagocyte Priming upon Encounter with Apoptotic Cells. J Biol Chem. 292 (19), 8059-8072 (2017).
  29. Hanayama, R. Autoimmune disease and impaired uptake of apoptotic cells in MFG-E8-deficient mice. Science. 304 (5674), 1147-1150 (2004).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

126

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved