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  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

En el presente documento se describe un ensayo de fagocitosis utilizando las células embrionarias dispersas de Drosophila . Nos permite cuantificar con facilidad y precisión los niveles de fagocitosis in vivo , e identificar nuevas moléculas necesarias para la fagocitosis de las células apoptóticas.

Resumen

Los mecanismos moleculares subyacentes a la fagocitosis de las células apoptóticas necesitan ser aclarados con más detalle debido a su papel en las enfermedades inmunes e inflamables intratables. En este documento se desarrolló un método experimental para investigar la fagocitosis cuantitativamente utilizando la mosca de la fruta Drosophila , en el que la red de genes que controla las reacciones de engulfment se conserva evolutivamente de los mamíferos. Con el fin de detectar con precisión y contando engullir y no engolfar los fagocitos con animales enteros, embriones de Drosophila se homogeneizaron para obtener células dispersadas incluyendo fagocitos y células apoptóticas. El uso de células embrionarias dispersas nos permite medir los niveles de fagocitosis in vivo como si se realizara un ensayo de fagocitosis in vitro en el que es posible observar todos los fagocitos y células apoptóticas en embriones enteros y cuantificar con precisión el nivel de fagocitosis. Se confirmó que este método reproduce los de estudios previosQue identificó los genes necesarios para la fagocitosis de las células apoptóticas. Este método permite analizar la absorción de células muertas y, cuando se combina con la poderosa genética de Drosophila , revelará las complejas reacciones fagocíticas que comprenden la migración, el reconocimiento, el engolfamiento y la degradación de las células apoptóticas por los fagocitos.

Introducción

En animales metazoarios, por ejemplo el nematodo Caenorhabditis elegans , la mosca de la fruta Drosophila melanogaster , y ratones y humanos, un gran número de células sufren apoptosis durante el desarrollo para modelar sus cuerpos y en la edad adulta para mantener la homeostasis 1 , 2 . Las células apoptóticas necesitan ser eliminadas rápidamente porque inducen inflamación en los tejidos circundantes liberando materiales intracelulares inmunogénicos si no se eliminan por completo 3 . Para facilitar la remoción rápida, las células apoptóticas presentan las denominadas señales de comer-me que son reconocidas por los receptores de engulfment de los fagocitos, y son eliminadas por fagocitosis 3 , 4 , 5 , 6 . Así, la fagocitosis desempeña un papel crucial en el mantenimiento de la homeostasis del huésped, y por lo tanto, elucidar la molécula Los mecanismos subyacentes a la fagocitosis de las células apoptóticas son importantes.

Los mecanismos responsables de la fagocitosis de las células apoptóticas parecen ser evolutivamente conservadas entre las especies en los nematodos, moscas y ratones [ 7] . Actualmente se dispone de varios ensayos de fagocitosis para evaluar la absorción de células apoptóticas en estos animales modelo. En C. elegans , 131 células somáticas sufren muerte celular programada durante el desarrollo, y los cadáveres de células son phagocytosed por las células vecinas, que son no fagocitos profesionales [ 8] . Por lo tanto, contar el número de cadáveres de células restantes en C. elegans indica el nivel de fagocitosis in vivo . En la búsqueda de mutantes de nematodos que muestran un mayor número de células muertas, varios genes necesarios para la fagocitosis han sido identificados y caracterizados genéticamente 9 , 10 ,S = "xref"> 11 , 12 .

Los ensayos de fagocitosis ex vivo con fagocitos de cultivo primario, generalmente macrófagos, se usan a menudo en ratones. Las células apoptóticas se preparan usando líneas celulares tales como células Jurkat, y se mezclan con fagocitos primarios. Después de una incubación durante varias horas, se cuenta el número total de fagocitos y de fagocitos engullantes para evaluar el nivel de fagocitosis. Como una modificación sofisticada de este método, el grupo de Nagata desarrolló un ensayo de fagocitosis ex vivo con células que expresan un ICAD resistente a caspasa (inhibidor de la DNasa activada por caspasa), en el que las células apoptóticas no sufren fragmentación apoptótica del ADN, Las células son fagocitadas. Cuando estas células se usan como dianas apoptóticas en un ensayo de fagocitosis, sólo el ADN de las células apoptóticas engullidas está fragmentado y teñido por marcado de extremos dUTP mediados por TdT (TUNEL). Por lo tanto, el leveL de la absorción de células apoptóticas se mide por el recuento de señales TUNEL en una mezcla de fagocitos y células apoptóticas [ 13] .

En D. melanogaster , los fagocitos profesionales denominados hemocitos, los macrófagos de Drosophila , son responsables de la fagocitosis de las células apoptóticas 14 , 15 . Además de los ensayos de fagocitosis in vitro con líneas celulares de cultivo, se dispone de ensayos de fagocitosis in vivo con embriones enteros de Drosophila . Los embriones de Drosophila son una poderosa herramienta para examinar el nivel de engrosamiento de células apoptóticas debido a que muchas células sufren apoptosis y son fagocitadas por hemocitos durante el desarrollo embrionario 14 , 15 , 16 . Un ejemplo de un ensayo de fagocitosis in vivo es el método desarrollado por el grupo de Franc. En su método, los hemocitos sonProtegido por la inmunotinción de peroxidasina, un marcador de hemocito, las células apoptóticas se tiñen utilizando el tinte nuclear, 7-amino actinomicina D en embriones enteros de Drosophila , y el número de células positivas dobles se cuenta como una señal de fagocitosis 17 . Otro ejemplo de un ensayo de fagocitosis en embriones se basa en el concepto de método de Nagata descrito anteriormente; Sin embargo, la fagocitosis in vivo se evalúa utilizando los embriones de dCAD ( Drosophila caspasa-DNasa activada) moscas mutantes [ 18 , 19] . Estos ensayos de fagocitosis in vivo son útiles para observar directamente la fagocitosis in situ . Sin embargo, las dificultades están asociadas con la exclusión de cualquier sesgo posible en el paso de contar células fagocitosas porque es difícil observar todos los fagocitos y células apoptóticas en embriones enteros debido a su grosor.

Para superar esta limitación, desarrollamosUn nuevo ensayo de fagocitosis en embriones de Drosophila . En nuestro método, para poder contar fácilmente los hemocitos fagocitados, se homogeneizan embriones enteros para preparar células embrionarias dispersas. Los fagocitos son detectados por la inmunotinción de un marcador de fagocitos, y las células apoptóticas son detectadas por TUNEL con estas células embrionarias dispersas. El uso de células embrionarias dispersas nos permite medir los niveles de fagocitosis in vivo como si se realizara un ensayo de fagocitosis in vitro que cuantificara con precisión el nivel de fagocitosis. Todos los genotipos de moscas pueden emplearse en este ensayo si se desarrollan hasta la etapa 16 de los embriones 20 , la etapa de desarrollo en la que la depuración de las células apoptóticas por fagocitosis es la más abundante. Este método tiene la ventaja de evaluar cuantitativamente el nivel de fagocitosis y, por tanto, puede contribuir a la identificación de nuevas moléculas implicadas en la fagocitosis de células apoptóticas in vivo .

Protocolo

1. Preparación

  1. Preparación de placas de agar de jugo de uva fresca
    1. Añadir 100 ml de agua a 4,4 g de agar y calentar la mezcla en un horno de microondas para disolver el agar.
    2. Añadir 80 ml de jugo de uva fresca, 5 ml de ácido acético y 5 ml de etanol en solución de agar.
    3. Verter aproximadamente 1,5 ml de la solución con una pipeta en cada portaobjetos de vidrio y dejar que se solidifique.
  2. Preparación de placas de 6 cm de placa de agarosa
    1. Añadir 50 ml de agua a 0,5 g de agarosa y calentar la mezcla en un horno de microondas para disolver la agarosa.
    2. Verter aproximadamente 2,5 ml de solución de agarosa en un plato de 6 cm con una pipeta.

2. Etapa 16 Colección de embriones

  1. Recoger las moscas adultas, y agregar 200 hembras y 200 machos en un tubo cónico de 50 ml.
  2. Ponga un plato de agar de jugo de uva fresco en la levadura en el tubo de 50 ml y cierre con una esponja capag.
  3. Incubar las moscas a 16 ° C en la luz durante 2 - 3 días. Cambiar la placa una vez al día.
  4. Mover las moscas a la oscuridad a 25 ° C durante 1 h.
  5. Cambiar el plato viejo a uno nuevo sin levadura. Permitir que las moscas pongan huevos durante 2 h.
  6. Recoger la placa e incubar a 16 ° C durante 26 h.
  7. Recoger los embriones de la placa con un pincel en 1 mL de PBS que contiene 0,2% (v / v) de Triton X-100.
  8. Lavar los embriones dos veces con 1 mL de PBS que contiene 0,2% (v / v) de Triton X-100.
  9. Con el fin de eliminar el corion, agregar 1,2 ml de solución de hipoclorito de sodio (2,2 - 3,4% Cl) a los embriones durante 3 min.
  10. Lavar los embriones 4 veces con 1 mL de PBS que contiene 0,2% (v / v) de Triton X-100.
  11. Colocar los embriones en placas de 6 cm de placa de agarosa. Recoge los embriones de la etapa 16 bajo un microscopio como describe Roberts 20 . Recoja aproximadamente 50 embriones en un tubo de prueba micro de Treff de 1,5 ml con una micropipeta.

3. PrepaRación de células embrionarias

  1. Lavar los embriones dos veces con 150 μL de PBS.
  2. Homogeneizar los embriones 30 veces en un tubo de micro test de 1,5 ml y mezclador de pellets en presencia de 200 μl de colagenasa (0,25% (p / v)) en PBS.
  3. Disperse las células embrionarias pipeteando 10 veces, y mover la suspensión celular a un tubo de 1,5 ml. Incubar las células a 37 ° C durante 1 min en un baño de agua. Repita este paso dos veces.
  4. Añadir 800 μl de PBS a la suspensión celular y centrifugar a 1400 x g a 4 ° C durante 5 min.
  5. Eliminar el sobrenadante y añadir 200 μ l de tripsina (0,25% (p / v)) en PBS a las células. Disperse las células embrionarias pipeteando 50 veces.
  6. Filtrar la suspensión celular con un filtro de células de 70 μm.
  7. Con el fin de detener la actividad tripsina, añadir 40 μ l de suero fetal bovino inactivado por calor a la suspensión de células filtradas. Añadir 800 μl de PBS y centrifugar a 1.400 x g a 4 ° C durante 5 min.
  8. Eliminar los supernatosNt, suspender las células precipitadas en 200 μl de PBS y centrifugar a 1400 x g a 4 ° C durante 5 min.
  9. Se retira el sobrenadante y se suspenden las células precipitadas en 30 μl de PBS.
  10. Montar la suspensión de células preparada en diapositivas de cristal revestidas con aminopropil trietoxisilano, y esperar 10-15 minutos hasta que las células se adhieran a las diapositivas de vidrio.
  11. Retire la solución restante en los portaobjetos de vidrio con una pipeta. Montar 60 - 70 μL de PBS que contenga PFA al 4% (p / v) (paraformaldehído) sobre las células durante 10 - 15 min para la fijación.
  12. Retire la solución de fijación y coloque los portaobjetos de vidrio en PBS durante más de 1 min.

4. Tinción de los hemocitos

  1. La inmunotinción con un anticuerpo anti-Croquemort
    1. Se empapan en serie los portaobjetos de vidrio en metanol durante 10 min, en PBS que contiene 0,2% (v / v) de Triton X-100 durante 10 min y luego en PBS durante 10 min.
    2. Montar 20 μl de suero de cerdo entero al 5% (v / v) en PBSNg 0,2% (v / v) de Triton X-100 en las células para el bloqueo. Incubar los portaobjetos a temperatura ambiente durante 20 min.
    3. Eliminar la solución de las diapositivas de vidrio y montar 20 μl de antisuero anti-Croquemort 19 , 21 (0,1% (v / v)) en PBS que contiene 0,2% (v / v) de Triton X-100 en las células. Incubar los portaobjetos a 4 ° C durante la noche.
    4. Se empapan los portaobjetos de vidrio en PBS que contiene 0,2% (v / v) de Triton X-100 durante 10 min 5 veces.
    5. Remoje los portaobjetos de vidrio en PBS durante 10 min.
    6. Colocar 20 μl de IgG anti-rata marcada con fosfatasa alcalina (0,5% (v / v)) en PBS que contiene 0,3% (v / v) de suero de cerdo entero Triton X-100 y 5% (v / v) Temperatura durante 1 h.
    7. Se empapan los portaobjetos de vidrio en PBS que contiene 0,2% (v / v) de Triton X-100 durante 10 min 5 veces.
    8. Remojar portaobjetos de vidrio en tampón que contenía 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, NaCl 100 mM, y MgCl 50 mM 2 durante 10 min.
    9. La solución de sustrato de fosfatasa de montaje que contiene 0,23 mg / ml de 5-bromo-4cloro-3-indolil-fosfato (BCIP), 0,35 mg / ml nitro azul tetrazolio (NBT), 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, NaCl 100 mM, y MgCl 50 mM 2 en las células.
    10. Observar las células bajo un microscopio para una tinción adecuada. Cuando aparecen fuertes señales púrpuras en los gránulos de los hemocitos, se retira la solución del sustrato y se empapa las diapositivas de vidrio en un tampón que consiste en Tris-HCl 10 mM, pH 8,5 y EDTA 1 mM. Se recomienda una tinción de aproximadamente 5 a 10 minutos.
  2. La inmunotinción con un anticuerpo anti-GFP (otra opción para la tinción de hemocitos)
    1. Se empapan en serie las láminas de vidrio en metanol durante 10 min, PBS que contiene 0,2% (v / v) de Triton X-100 durante 10 min y PBS durante 10 min.
    2. Monte 20 μl de suero entero de cerdo al 5% (v / v) en PBS que contenga Triton X-100 al 0,2% (v / v) en las células para bloqueo. Incubar los portaobjetos a temperatura ambiente durante 20 min.
    3. Eliminar la solución en portaobjetos de vidrio y montar 20 μl del anticuerpo anti-GFP de ratón (1% (v / v)) / PBS cObteniendo 0,2% (v / v) de Triton X-100 en las células. Incubar los portaobjetos a temperatura ambiente durante la noche.
    4. Se empapan los portaobjetos de vidrio en PBS que contiene 0,2% (v / v) de Triton X-100 durante 10 min 5 veces.
    5. Remoje los portaobjetos de vidrio en PBS durante 10 min.
    6. Colocar 20 μl de IgG anti-ratón marcado con fosfatasa alcalina (0,5% (v / v)) en PBS que contiene 0,3% (v / v) de suero de cerdo entero de Triton X-100 y 5% (v / v) Temperatura durante 1 h.
    7. Se empapan los portaobjetos de vidrio en PBS que contiene 0,2% (v / v) de Triton X-100 durante 10 min 5 veces.
    8. Remojar portaobjetos de vidrio en tampón constituido por 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, NaCl 100 mM, y MgCl 50 mM 2 durante 10 min.
    9. Montar la solución de sustrato de fosfatasa que contiene 0,23 mg / ml de BCIP, 0,35 mg / ml de NBT, 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, NaCl 100 mM, y MgCl 50 mM 2 en las células.
    10. Observar las células bajo un microscopio para una tinción adecuada. Cuando las señales de color púrpura aparecen en hemocitos enteros, retire la solución de sustrato y pase las diapositivas en un tampón que consiste enDe Tris-HCl 10 mM, pH 8,5 y EDTA 1 mM. Se recomienda una tinción de aproximadamente 10 - 15 min.

5. Stain Apoptotic Cells de TUNEL

  1. Remoje los portaobjetos de vidrio en PBS durante 5 min.
  2. Repita con el nuevo PBS.
  3. Monte el tampón de equilibrio (véase la Tabla de Materiales) sobre las células durante 10 min.
  4. Retire la solución de los portaobjetos de vidrio y monte 20 μL de solución de TdT que contenga 5 μL de desoxinucleotidil transferasa terminal y 15 μL de tampón de reacción en las células a 37 ° C durante 1 h.
  5. Retirar la solución de los portaobjetos de vidrio y empapar las diapositivas en un tampón que consiste en 0,5 mL de STOP / tampón de lavado y 17 mL de agua.
  6. Remoje las diapositivas en PBS durante 5 min 3 veces.
  7. Montar 20 μL de Anti-Digoxigenina-Peroxidasa en las células a temperatura ambiente durante 30 min.
  8. Remoje las diapositivas de vidrio en PBS durante 5 min 4 veces.
  9. Sumerja los portaobjetos de vidrio en solución de sustrato de peroxidasa que consta de 30 ml de Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 conteniendoga completo espátula micro de 3,3'-diaminobencidina tetrahydrichloride (DAB), y 0,002% (v / v) H 2 O 2 durante 30 s.
  10. Repita el paso 5.9 hasta que las células apoptóticas estén manchadas de color marrón. Sumerja los portaobjetos de vidrio en agua para detener la reacción de la peroxidasa.
  11. Encierre las células con agua para la observación.

6. Medir el nivel de fagocitosis de las células apoptóticas

  1. Observe las muestras bajo un microscopio óptico para evaluar el nivel de fagocitosis. Contar células positivas a Croquemort o células GFP positivas como hemocitos, células positivas a TUNEL como células apoptóticas y células positivas dobles como hemocitos fagocitantes.
  2. El índice fagocítico se define como el número de células dobles positivas al número total de células positivas a Croquemort o células positivas para GFP. Se recomienda observar más de 300 hemocitos.

Resultados

Con el fin de examinar la fagocitosis de las células apoptóticas, Drosophila embriones de desarrollo etapa 16 fueron recogidos y preparados como células dispersas. Los hemocitos, macrófagos de Drosophila , se tiñeron por inmunocitoquímica para el marcador de hemocito "Croquemort" 17 , 22 usando un anticuerpo específico 19 , 21 , y las c?...

Discusión

En este documento se describió un ensayo de fagocitosis utilizando embriones de Drosophila . Mediante el uso de células embrionarias dispersas para medir la fagocitosis cuantitativamente, los hemocitos, los fagocitos profesionales de Drosophila , son inmunocorados para el marcador de hemocitos Croquemort o srpHemo- dirigido GFP, y las células apoptóticas son detectadas por TUNEL en este protocolo. El nivel de fagocitosis se expresa como un índice fagocítico contando el número tota...

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Estamos agradecidos a Kaz Nagaosa y Akiko Shiratsuchi por su consejo.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
whole swine serumMP Biomedicals55993For bloking
Treff micro test tube(easy fit)  Dnase, Rnase free tube, 1.5 mLTreffLab96. 4625. 9. 01For  homogenization
pellet mixer  1.5 mLTreffLab96. 7339. 9. 03For  homogenization
CollagenaseSigma-AldrichC-0130For preparation of embryonic cells
TrypsinThermo Fisher SCIENTIFIC27250-018For preparation of embryonic cells
Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, APKPL475-1612secondary antibody for
stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-phosphate		Roche11383221001BCIP, For staining of hemocytes
nitro blue tetrazoliumRoche11383213001NBT, For staining of hemocytes
Anti-Croquemort antibodydescribed previously in Manaka et al., J. Biol. Chem., 279, 48466-48476
 Anti-GFP
from mouse IgG1κ (clones 7.1 and 13.1) 		Roche11814460001For staining of hemocytes
Goat Anti-Mouse IgG-AP ConjugateBio-Rad170-6520secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection KitMilliporeS7100For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase.
3,3'-diaminobenzidine
tetrahydrichloride		nacalai tesque11009-41DAB, For staining of apoptoitc cells
Table of Fly Strains
NameStock centerStock IDComments
w1118Control flies, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
drprΔ5drpr mutant, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
Itgbn2Itgbn mutant, described in Devenport et al., Development, 131, 5405-5415
srpHemoGAL4 UAS-EGFPdescribed in Brückner et al., Dev. Cell., 7, 73-84
UAS-drpr-IRVDRC4833-
UAS-Itgbn-IRNIG-fly1762R-1-

Referencias

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