Apoptotik Hücreler İçin Fagositoz Testi<em&gt; Drosophila</emEmbriyolar

Özet

Drosophila'nın dağıtılmış embriyonik hücrelerini kullanarak bir fagositoz tahlili burada tarif edilmektedir. Bu, in vivo fagositoz seviyelerini kolay ve kesin bir şekilde ölçmemize ve apoptotik hücrelerin fagositozu için gerekli olan yeni molekülleri belirlememize olanak tanır.

Özet

Apoptotik hücrelerin fagositozunun altında yatan moleküler mekanizmalar, bağışıklık ve inflamatuar dirençli hastalıklarda rolünden dolayı daha ayrıntılı olarak açıklığa kavuşturulmalıdır. Burada, fide soğurumunu kontrol eden gen şebekesinin memelilerden evrimsel olarak korunduğu Drosophila meyve sineği kullanılarak kantitatif olarak fagositozu araştırmak için deneysel bir yöntem geliştirdik. Tam hayvanlar kullanılarak engulfing ve un-engulfing fagositleri doğru tespit etmek ve saymak için Drosophila embriyoları, fagositler ve apoptotik hücreler de dahil olmak üzere dağılmış hücreler elde etmek üzere homojenize edildi. Dağıtılmış embriyonik hücrelerin kullanımı, in vitro fagositoz düzeylerini, bütün embriyolardaki tüm fagositleri ve apoptotik hücreleri gözlemlemek ve fagositoz düzeyini tam olarak ölçmek mümkün olan bir in vitro fagositoz tahlilini gerçekleştirmiş gibi ölçebilir. Bu yöntemin daha önceki çalışmaların yöntemlerini ürettiğini doğruladıkBu, apoptotik hücrelerin fagositozu için gerekli genleri belirledi. Bu yöntem, ölü hücrelerin parçalanmasını sağlar ve Drosophila'nın güçlü genetiği ile birleştirildiğinde, fagositler tarafından apoptotik hücrelerin migrasyonu, tanınması, yutulması ve parçalanması ile oluşan karmaşık fagositik reaksiyonları ortaya çıkaracaktır.

Giriş

Metazoan hayvanlarda, örneğin nematod Caenorhabditis elegans , meyve sinek Drosophila melanogaster ve fare ve insanlar, çok sayıda hücre vücutlarını şekillendirmek için gelişme döneminde ve erişkinlikte homeostazı ^{1 , 2} korumak için apoptoz geçirir. Apoptotik hücrelerin hızla çıkartılması gerekir çünkü bunlar, tamamen çıkarılmasa bile, immünojenik hücre içi materyalleri serbest bırakarak çevreleyen dokularda iltihap oluştururlar ³ . Hızlı kaldırmayı kolaylaştırmak için, apoptotik hücreler, fagositlerin yutulma reseptörleri tarafından tanınan ve yememe sinyalleri olarak adlandırılırlar ve fagositoz ^{3 , 4 , 5 , 6} ile ortadan kaldırılırlar. Böylece, fagositoz ana homeostazın korunmasında hayati bir rol oynar ve bu nedenle molekülün aydınlatılması Apoptotik hücrelerin fagositozunun altında yatan mekanizmalar önemlidir.

Apoptotik hücrelerin fagositozundan sorumlu mekanizmalar, nematodlar, sinekler ve farelerdeki türler arasında evrimsel olarak korunmuş gibi gözükmektedir ⁷ . Bu model hayvanların apoptotik hücrelerin soğumasını değerlendirmek için çeşitli fagositoz testleri mevcuttur. C. elegans içinde, 131 somatik hücre gelişimi sırasında programlanmış hücre ölümü ve hücre cesetleri profesyonel olmayan fagositler ⁸ olan komşu hücreler tarafından fagosite edilen. Böylece, C. elegans'taki kalan hücre cesetlerinin sayısının sayılması, in vivo fagositoz seviyesini gösterir. Ölü hücrelerin artan sayısını gösteren nematod mutantlarını araştırarak, fagositoz için gereken birkaç gen tespit edildi ve genetik olarak ^{9 , 10 ,}S = "xref"> 11 ^{, 12} .

Birincil kültür fagositleri (genellikle makrofajlar) ile ex vivo fagositoz testleri, farelerde sıklıkla kullanılır. Apoptotik hücreler, Jurkat hücreleri gibi hücre hatları kullanılarak hazırlanır ve primer fagositlerle karıştırılır. Birkaç saat inkübasyondan sonra fagositoz seviyesini değerlendirmek için toplam fagosit sayısı ve sindirim fagosit sayısı hesaplanır. Bu yöntemin sofistike bir modifikasyonu olan Nagata'nın grubu, apoptotik hücrelerin apoptotik DNA fragmantasyonuna maruz kalmadığı, ancak kaspaza dirençli bir ICAD (kaspazla aktive DNaz inhibitörü) eksprese eden hücrelerle ex vivo fagositoz testi geliştirdi; ancak DNA hala kesildiğinde Hücreler fagositozlanır. Bu hücreler, bir fagositoz tahlilinde apoptotik hedefler olarak kullanıldığında, sadece sarmalanmış apoptotik hücrelerin DNA'sı parçalanır ve TdT aracılı dUTP nick uç etiketlemesi (TUNEL) ile boyanır. Bu nedenle, leveL apoptotik hücre yutulması, bir fagosit ve apoptotik hücre karışımı ¹³ içinde TUNEL sinyallerinin sayılmasıyla ölçülür.

D. melanogaster'da , hemocytes adında profesyonel fagositler, Drosophila makrofajları, ^{14 , 15} apoptotik hücrelerin fagositozundan sorumludur. Kültür hücresi soyları ile yapılan in vitro fagositoz analizlerine ek olarak , bütün Drosophila embriyolarıyla in vivo fagositoz analizleri mevcuttur. Drosophila embriyolar birçok hücreleri apoptozise uğrar ve embriyonik gelişim ^{14, 15, 16} boyunca hemocytes tarafından fagosite edilir çünkü apoptotik hücre yutulma seviyesinin incelenmesine yönelik güçlü bir araçtır. Bir in vivo fagositoz tahliline bir örnek, Franc'in grubu tarafından geliştirilen yöntemdir. Yöntemlerinde hemositler deBir hemosit işareti olan peroksidazenin immüno-lekelemesi ile tespit edilen apoptotik hücreler, bütün Drosophila embriyolarında 7-amino aktinomisin D nükleer boya kullanılarak lekelenmiş ve çift pozitif hücrelerin sayısı, fagositoz ¹⁷ sinyali olarak sayılmıştır. Embriyolarda bir fagositoz tahlili için bir başka örnek, yukarıda tarif edilen Nagata metodu kavramına dayanır; Bununla birlikte, in vivo fagositoz, dCAD ( Drosophila caspase-activated DNase) mutant sinekler ^{18 , 19'un} embriyoları kullanılarak değerlendirilir. Bu in vivo fagositoz testleri doğrudan in situ fagositoz gözlemlemek için yararlıdır. Bununla birlikte, zorluklar, fagosit hücrelerini sayma aşamasındaki muhtemel yanlılıkların hariç tutulması ile ilişkilidir; çünkü kalınlığından ötürü bütün embriyoların tüm fagositlerini ve apoptotik hücrelerini gözlemlemek zordur.

Bu kısıtlamanın üstesinden gelmek için,Drosophila embriyolarında yeni bir fagositoz testi yaptı. Yöntemimizde, fagositozan hemositleri kolayca sayabilmek için, bütün embriyolar dağınık embriyonik hücreleri hazırlamak için homojenize edilir. Fagositler, bir fagosit markörünün immün boyaması ile tespit edilir ve apoptotik hücreler, bu dağınık embriyonik hücreler ile TUNEL tarafından saptanır. Dağıtılan embriyonik hücrelerin kullanılması, in vivo fagositoz düzeylerini, fagositoz düzeyini tam olarak ölçen bir in vitro fagositoz tahlilini gerçekleştirmiş gibi ölçmenizi sağlar. Bunlar embriyo ²⁰ 16 fagositozla olan apoptotik hücre mesafesi en bol gelişimsel aşama aşama için gelişirse sinekler tüm genotipler Bu deneyde kullanılabilir. Bu yöntem, fagositoz seviyesini kantitatif olarak değerlendirmenin avantajına sahiptir ve bu nedenle apoptotik hücrelerin in vivo fagositozunda yer alan yeni moleküllerin tanımlanmasına katkıda bulunabilir.

Protokol

1. Hazırlık

1. Taze üzüm suyu agar plakalarının hazırlanması
   1. 4.4 g agarda 100 mL su ilave edin ve karışımı mikrodalga fırında ısıtarak agarı çözün.
   2. 80 mL taze üzüm suyu, 5 mL asetik asit ve 5 mL etanol, agar solüsyonuna ilave edin.
   3. Her cam slayt üzerine bir pipet ile yaklaşık 1.5 mL çözelti dökün ve katılaşmasına izin verin.
2. 6 cm çanak agaroz plakalarının hazırlanması
   1. 0.5 g agaroza 50 mL su ilave edin ve agarozu çözmek için mikrodalga fırında ısıtın.
   2. Bir pipet ile 6 cm'lik bir tabağa yaklaşık 2.5 mL agaroz çözeltisi dökün.

2. Evre 16 Embriyo Koleksiyonu

1. Yetişkin sinekler toplayın ve 200 mL dişiler ve 200 erkek bir 50 mL konik tüp ekleyin.
2. Maya üzerine taze üzüm suyu agarı bir tabak 50 mL tüp içine koyun ve bir sünger cas.
3. Sinekleri ışık altında 16 ° C'de 2 - 3 gün inkübe edin. Plakayı günde bir kez değiştirin.
4. Sinekleri karanlıkta 25 ° C'de 1 saat hareket ettirin.
5. Eski tabağı mayasız yeni bir tabakaya değiştirin. Uçaklara 2 saat yumurta bırakmasına izin ver.
6. Plakayı toplayın ve 16 saat boyunca inkübe edin. 26 saat süreyle inkübe edin.
7. % 0.2 (v / v) Triton X-100 içeren 1 mL PBS içine bir boya fırçası ile plakadan embriyolar toplayın.
8. Embriyoları,% 0.2 (v / v) Triton X-100 içeren 1 mL PBS ile iki kez yıkayın.
9. Porsiyonu çıkartmak için, 3 dakika embriyoya 1.2 mL sodyum hipoklorit çözeltisi (% 2.2 - 3.4 Cl) ekleyin.
10. Embriyoları,% 0.2 (v / v) Triton X-100 içeren 1 mL PBS ile 4 kez yıkayın.
11. 6 cm çanak agaroz plakaları embriyolar yerleştirin. Evre 16 embriyoları, Roberts ²⁰ tarafından tarif edildiği gibi mikroskop altında alın. Bir mikropipet ile 1.5 mL'lik bir Treff mikro test tüpünde yaklaşık 50 embriyo toplayın.

3. PrepaEmbriyonik Hücrelerin Rasyonları

1. Embriyoları iki kez 150 μL PBS ile yıkayın.
2. PBS içinde kollajenaz 200 uL (% 0.25 (w / v)) varlığında embriyoları 1.5 mL mikro test tüpü ve pelet mikserinde 30 kez homojenize edin.
3. Embriyonik hücreleri 10 kez pipetle dağıtın ve hücre süspansiyonunu 1.5 mL tüp içine alın. Hücreleri 37 ° C'de 1 dakika su banyosunda inkübe edin. Bu adımı iki kez tekrarlayın.
4. Hücre süspansiyonuna 800 μL PBS ekleyin ve 4 ° C'de 1400 x g'de 5 dakika santrifüjleyin.
5. Süpernatantı çıkarın ve hücrelere PBS içinde 200 μL tripsin (% 0.25 (w / v)) ekleyin. Embriyonik hücreleri 50 kez pipetle dağıtın.
6. Hücre süspansiyonunu 70 um'lik bir Hücre Süzücü ile süzün.
7. Tripsin aktivitesini durdurmak için filtrelenmiş hücre süspansiyonuna 40 μL ısı ile inaktive fetal sığır serumu ekleyin. 800 μL PBS ekleyin ve 4 ° C'de 1,400 x g'de 5 dakika süreyle santrifüjleyin.
8. Supernata'yı kaldırNt, 200 ul PBS içinde çökelen hücreleri askıya alın ve 1400 x g'de 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin.
9. Süpernatantı çıkarın ve 30 uL PBS içinde çökelen hücreleri bekletin.
10. Hazırlanan hücre süspansiyonunu aminopropil trietoksisilan kaplı cam slaytlara monte edin ve hücreler cam slaytlara tutturuncaya kadar 10-15 dakika bekleyin.
11. Cam slaytlardaki kalan çözeltiyi bir pipetle çıkarın. Tespit için 10-15 dakika boyunca hücrelere% 4 (w / v) PFA (paraformaldehid) içeren PBS'nin 60 - 70 μL'sini monte edin.
12. Sabitleme çözeltisini çıkarın ve 1 dakikadan fazla cam kaydırıcıları PBS'ye yerleştirin.

4. Hemocytes Boyama

1. Bir anti-Croquemort antikoru ile immün boyama
   1. 10 dakika boyunca% 0,2 (v / v) Triton X-100 içeren PBS içinde ve sonra 10 dakika boyunca PBS'de, 10 dakika boyunca metanol içinde cam kaydırıcıları ıslatınız.
   2. PBS içerisinde 20 μL% 5 (v / v) tam domuz serumuEngelleme hücreleri üzerinde% 0.2 (v / v) Triton X-100. Slaytları 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
   3. Çözeltiyi cam kaydıraklardan çıkarın ve hücrelere% 0.2 (v / v) Triton X-100 içeren PBS içinde 20 μL anti-Croquemort antiserumu ^{19 , 21} (% 0.1 (v / v)) yerleştirin. Slaytları gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
   4. 10 dakika boyunca 5 kez% 0.2 (v / v) Triton X-100 içeren PBS içinde cam sürgüleri bekletin.
   5. Cam kaydırakları 10 dakika PBS'de bekletin.
   6. Odalarda hücrelere% 0.2 (v / v) Triton X-100 ve% 5 (v / v) bütün domuz serumunu içeren PBS içinde 20 uL alkalin fosfataz etiketli anti-sıçan IgG'si (% 0.5 v / v) Sıcaklık 1 saat.
   7. 10 dakika boyunca 5 kez% 0.2 (v / v) Triton X-100 içeren PBS içinde cam sürgüleri bekletin.
   8. 100 mM Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl ihtiva eden tampon içinde cam slaytlar ıslatın ve 10 dakika için 50 mM _MgCl2.
   9. 0.23 mg / mL 5-bromo-4 içeren dağ fosfataz substrat çözeltisi-kloro-3-indolil-fosfat (BCIP), 0.35 mg / mL nitrotetrazolivm (NBT), 100 mM Tris-HCI, pH 9.5, 100 mM NaCI, ve hücreler 50 mM _MgCl2.
   10. Düzgün boyanması için hücreleri mikroskop altında izleyin. Hemocytes granüllerinde güçlü mor sinyalleri göründüğünde, substrat solüsyonu çıkarın ve 10 mM Tris-HC1, pH 8.5 ve 1 mM EDTA içeren tampon cam slaytlar batırın. Yaklaşık 5 - 10 dakika boyanması önerilir.
2. Bir anti-GFP antikoru ile immün boyama (hemositlerin boyanması için başka bir seçenek)
   1. Cam kaydırakları 10 dakika süreyle metanol içinde, 10 dakika için% 0.2 (v / v) Triton X-100 ve 10 dakika PBS içeren PBS'yi ıslatınız.
   2. Blokaj için hücrelere% 0.2 (v / v) Triton X-100 içeren PBS içinde% 5 (v / v) tam domuz serumu 20 uL'lik bir miktarı monte edin. Slaytları 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
   3. Cam slaytlardaki çözeltiyi çıkarın ve 20 μL fare anti-GFP antikoru (% 1 (v / v)) / PBS cHücrelere% 0.2 (v / v) Triton X-100 ile ulaşılmaktadır. Slaytları gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
   4. 10 dakika boyunca 5 kez% 0.2 (v / v) Triton X-100 içeren PBS içinde cam sürgüleri bekletin.
   5. Cam kaydırakları 10 dakika PBS'de bekletin.
   6. Odalarda hücrelere% 0.2 (v / v) Triton X-100 ve% 5 (v / v) tüm domuz serumu içeren PBS'de 20 uL alkalin fosfataz etiketli anti-fare IgG'si (% 0.5 v / v) Sıcaklık 1 saat.
   7. 10 dakika boyunca 5 kez% 0.2 (v / v) Triton X-100 içeren PBS içinde cam sürgüleri bekletin.
   8. 100 mM Tris-HCI, pH 9.5, 100 mM NaCl'den oluşan tampon içinde cam slaytlar ıslatın ve 10 dakika için 50 mM _MgCl2.
   9. 0.23 mg / ml BCIP, 0.35 mg / ml NBT, 100 mM Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCI, ve hücreler 50 mM _MgCl2 ihtiva eden fosfataz alt-tabaka çözeltisi monte edin.
   10. Düzgün boyanması için hücreleri mikroskop altında izleyin. Tam hemositlerde mor sinyaller göründüğünde, substrat solüsyonunu çıkarın ve içindeki slaytları,10 mM Tris-HC1, pH 8.5 ve 1 mM EDTA. Yaklaşık 10-15 dakika boyanması önerilir.

5. TUNEL tarafından Apoptotik Hücrelerin Boyanması

1. Cam kaydırakları 5 dakika PBS'de bekletin.
2. Yeni PBS ile tekrarlayın.
3. Dengeleyici dengeleyici tamponu (Malzeme Tablosuna bakınız) 10 dakika boyunca hücrelerde.
4. Cam slaytlar solüsyonu kaldırın ve 1 saat 37 ° C'de hücrelere 15 uL Reaksiyon Tamponu ve terminal deoksinükleotidil transferaz 5 mcL içeren TdT çözeltisi 20 mcL monte edin.
5. Çözeltiyi cam kaydıraklardan çıkarın ve slaytları 0.5 mL STOP / Yıkama tamponu ve 17 mL sudan oluşan tampona batırın.
6. Slaytları PBS içinde 5 dakika 3 kez bekletin.
7. 30 dk boyunca oda sıcaklığında hücrelere 20 μL Anti-Digoxigenin-Peroksidaz ekleyin.
8. Cam kaydırakları 5 dakika 4 kez PBS'de bekletin.
9. Cam slaytları 30 mL 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 suşu içeren peroksidaz substrat çözeltisine batırın30 sn için 3,3'-diaminobenzidin tetrahydrichloride (DAB) ve% 0.002 (h / h) _H2 O ₂ ga tam mikro spatula.
10. Apoptotik hücreler kahverengi oluncaya dek adım 5.9'u tekrarlayın. Peroksidaz reaksiyonunu durdurmak için cam kaydırıcıları suya batırın.
11. Gözlem için hücreleri su ile kapatın.

6. Apoptotik Hücrelerin Fagositoz Düzeyini ölçün

1. Fagositoz düzeyini değerlendirmek için örnekleri hafif bir mikroskopta izleyin. Hemocytes olarak Croquemort pozitif hücreleri veya GFP pozitif hücreleri, Apoptotik hücreler olarak TUNEL pozitif hücreleri ve hemositleri fagositize eden çift pozitif hücreleri sayın.
2. Fagositik indeks, Croquemort pozitif hücrelerin veya GFP pozitif hücrelerin toplam sayısına karşı çift pozitif hücre sayısı olarak tanımlanır. 300'den fazla hemosit izlenmesi önerilir.

Sonuçlar

Apoptotik hücrelerin fagositozunu incelemek amacıyla gelişim aşaması 16'nın Drosophila embriyoları toplandı ve dağılmış hücreler olarak hazırlandı. Hemocytes, Drosophila makrofajları, hemocyte marker "Croquemort" ^{17 , 22} için immünositokimya ile spesifik bir antikor ^{19 , 21} kullanarak lekelenmiş ve apoptotik hücreler da?...

Tartışmalar

Burada, Drosophila embriyolarını kullanan bir fagositoz tahlili tarif ettik. Fagositozu niceliksel olarak ölçmek için dağınık embriyonik hücreler kullanarak Hemocytes, Drosophila professional phagocytes, Hemocyte marker Croquemort veya srpHemo- kaynaklı GFP için immünostained ve apoptotik hücreler bu protokolde TUNEL tarafından tespit edilir. Fagositoz seviyesi, hemositlerin ve fagosit oksitleyici hemositlerin toplam sayısını sayarak bir fagositik indeks olarak ifade edi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
whole swine serum	MP Biomedicals	55993	For bloking
Treff micro test tube(easy fit)  Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL	TreffLab	96. 4625. 9. 01	For  homogenization
pellet mixer  1.5 mL	TreffLab	96. 7339. 9. 03	For  homogenization
Collagenase	Sigma-Aldrich	C-0130	For preparation of embryonic cells
Trypsin	Thermo Fisher SCIENTIFIC	27250-018	For preparation of embryonic cells
Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP	KPL	475-1612	secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
5-bromo-4-chloro- 3-indolyl-phosphate	Roche	11383221001	BCIP, For staining of hemocytes
nitro blue tetrazolium	Roche	11383213001	NBT, For staining of hemocytes
Anti-Croquemort antibody			described previously in Manaka et al., J. Biol. Chem., 279, 48466-48476
Anti-GFP from mouse IgG1κ (clones 7.1 and 13.1)	Roche	11814460001	For staining of hemocytes
Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate	Bio-Rad	170-6520	secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit	Millipore	S7100	For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase.
3,3'-diaminobenzidine tetrahydrichloride	nacalai tesque	11009-41	DAB, For staining of apoptoitc cells
Table of Fly Strains
Name	Stock center	Stock ID	Comments
w1118			Control flies, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
drprΔ5			drpr mutant, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
Itgbn2			Itgbn mutant, described in Devenport et al., Development, 131, 5405-5415
srpHemoGAL4 UAS-EGFP			described in Brückner et al., Dev. Cell., 7, 73-84
UAS-drpr-IR	VDRC	4833	-
UAS-Itgbn-IR	NIG-fly	1762R-1	-