Анализ фагоцитоза для апоптозных клеток в<em&gt; Drosophila</em&gt; Эмбрионы

Резюме

Мы здесь описываем анализ фагоцитоза с использованием дисперсных эмбриональных клеток Drosophila . Это позволяет нам легко и точно определять уровни фагоцитоза in vivo и идентифицировать новые молекулы, необходимые для фагоцитоза апоптозных клеток.

Аннотация

Молекулярные механизмы, лежащие в основе фагоцитоза апоптозных клеток, должны быть выяснены более подробно из-за его роли в иммунных и воспалительных трудноизлечимых заболеваниях. Мы разработали экспериментальный метод количественного исследования фагоцитоза с использованием фруктовой мухи Drosophila , в которой генная сеть, контролирующая реакции поглощения, эволюционно сохраняется у млекопитающих. Для точного обнаружения и подсчета поглощающих и не поглощающих фагоцитов с использованием целых животных эмбрионы дрозофилы гомогенизировали для получения диспергированных клеток, включая фагоциты и апоптотические клетки. Использование дисперсных эмбриональных клеток позволяет измерять уровни фагоцитоза in vivo, как если бы мы проводили анализ фагоцитоза in vitro, в котором можно наблюдать все фагоциты и апоптотические клетки целых эмбрионов и точно определять уровень фагоцитоза. Мы подтвердили, что этот метод воспроизводит результаты предыдущих исследованийКоторые идентифицировали гены, необходимые для фагоцитоза апоптозных клеток. Этот метод позволяет анализировать поглощение мертвых клеток и в сочетании с мощной генетикой дрозофилы выявит сложные фагоцитарные реакции, связанные с миграцией, распознаванием, поглощением и деградацией апоптотических клеток фагоцитами.

Введение

В метазоановых животных, например, нематод Caenorhabditis elegans , фруктовая муха Drosophila melanogaster и мыши и люди, большое количество клеток подвергается апоптозу во время развития, чтобы сформировать свои тела и в зрелом возрасте поддерживать гомеостаз ^{1 , 2} . Апоптотические клетки необходимо быстро удалить, потому что они индуцируют воспаление в окружающих тканях путем высвобождения иммуногенных внутриклеточных материалов, если они не полностью удалены ³ . Чтобы облегчить быстрое удаление, апоптотические клетки представляют собой так называемые сигналы питания, которые распознаются поглощающими рецепторами фагоцитов и устраняются фагоцитозом ^{3 , 4 , 5 , 6} . Таким образом, фагоцитоз играет решающую роль в поддержании гомеостаза хозяина и, следовательно, выясняет молекулу Важные механизмы, лежащие в основе фагоцитоза апоптозных клеток, имеют важное значение.

Механизмы, ответственные за фагоцитоз апоптотических клеток, по-видимому, эволюционно сохраняются среди видов у нематод, мух и мышей ⁷ . В настоящее время доступно несколько анализов фагоцитоза для оценки охвата апоптотических клеток у этих модельных животных. У C. elegans 131 соматические клетки подвергаются запрограммированной гибели клеток во время развития, а трупы клеток фагоцитируются соседними клетками, которые являются непрофессиональными фагоцитами ⁸ . Таким образом, подсчет количества оставшихся трупы клеток у C. elegans указывает на уровень фагоцитоза in vivo . Путем поиска мутантов нематод, которые показывают увеличенное количество мертвых клеток, было идентифицировано несколько генов, необходимых для фагоцитоза, и генетически характеризуются ^{9 , 10 ,}S = "xref"> 11 ^{, 12} .

Экс- фагоцитоз ex vivo с фагоцитами первичной культуры, обычно макрофагами, часто используют у мышей. Апоптотические клетки получают с использованием клеточных линий, таких как клетки Jurkat, и смешивают с первичными фагоцитами. После инкубации в течение нескольких часов подсчитывают общее количество фагоцитов и поглощающих фагоцитов для оценки уровня фагоцитоза. В качестве сложной модификации этого метода группа Nagata разработала анализ фагоцитоза ex vivo с клетками, экспрессирующими резистентный к каспазе ICAD (ингибитор активированной каспазой ДНКазы), в которой апоптотические клетки не подвергаются апоптотической фрагментации ДНК, но ДНК все еще расщепляется, когда Клетки фагоцитированы. Когда эти клетки используются в качестве апоптотических мишеней в анализе фагоцитоза, только ДНК поглощенных апоптотических клеток фрагментируется и окрашивается опосредованной TdT опорой концевого звена dUTP (TUNEL). Следовательно,L популяции апоптотических клеток измеряется путем подсчета сигналов TUNEL в смеси фагоцитов и апоптотических клеток ¹³ .

В D. melanogaster профессиональные фагоциты, названные гемоцитами, макрофагами Drosophila , ответственны за фагоцитоз апоптотических клеток ^{14 , 15} . В дополнение к анализу фагоцитоза in vitro с клеточными линиями клеток доступны анализы фагоцитоза in vivo с целыми эмбрионами дрозофилы . Зародыши дрозофилы являются мощным инструментом для изучения уровня апоптотического захвата клеток, поскольку многие клетки подвергаются апоптозу и фагоцитируются гемоцитами во время эмбрионального развития ^{14 , 15 , 16} . Примером анализа фагоцитоза in vivo является метод, разработанный группой Франка. В их методе гемоциты являютсяПри помощи иммуноокрашивания пероксидазина маркер гемоцитов апоптотические клетки окрашиваются с использованием ядерного красителя, 7-амино актиномицина D у всех эмбрионов дрозофилы , а число двойных положительных клеток считается сигналом фагоцитоза ¹⁷ . Другой пример анализа фагоцитоза на эмбрионах основан на концепции описанного выше метода Нагаты; Однако фагоцитоз in vivo оценивается с использованием эмбрионов мутантов dCAD ( дрозофила каспазы-активированной ДНКазы) ^{18 , 19} . Эти анализы фагоцитоза in vivo полезны для непосредственного наблюдения фагоцитоза in situ . Однако трудности связаны с исключением любого возможного смещения на этапе подсчета фагоцитозирующих клеток, потому что из-за его толщины трудно наблюдать все фагоциты и апоптотические клетки у всех эмбрионов.

Чтобы преодолеть это ограничение, мы развиваемсяОпубликовал новый анализ фагоцитоза у эмбрионов дрозофилы . В нашем методе, чтобы легко подсчитать фагоцитозирующие гемоциты, целые эмбрионы гомогенизируют для получения дисперсных эмбриональных клеток. Фагоциты обнаруживают путем иммуноокрашивания маркера фагоцитов, а апоптотические клетки обнаруживают TUNEL с этими диспергированными эмбриональными клетками. Использование дисперсных эмбриональных клеток позволяет измерять уровни фагоцитоза in vivo, как если бы мы провели анализ фагоцитоза in vitro, который точно определяет уровень фагоцитоза. Все генотипы мух могут быть использованы в этом анализе, если они развиваются до стадии 16 эмбрионов ²⁰ , стадии развития, при которой апоптотический клиренс клеток фагоцитозом является наиболее распространенным. Этот метод имеет то преимущество, что количественно оценивает уровень фагоцитоза и, таким образом, может способствовать идентификации новых молекул, участвующих в фагоцитозе апоптотических клеток in vivo .

протокол

1. Подготовка

1. Приготовление агара из свежих виноградных соков
   1. Добавьте 100 мл воды к 4,4 г агара и нагрейте смесь в микроволновой печи для растворения агара.
   2. Добавьте 80 мл свежего виноградного сока, 5 мл уксусной кислоты и 5 мл этанола в раствор агара.
   3. Налейте примерно 1,5 мл раствора пипеткой на каждый стеклянный предмет и дайте ему затвердеть.
2. Приготовление 6 см чашечных агарозных пластин
   1. Добавить 50 мл воды до 0,5 г агарозы и нагреть смесь в микроволновой печи для растворения агарозы.
   2. Налейте приблизительно 2,5 мл раствора агарозы на блюдо 6 см с пипеткой.

2. Этап 16 Коллекция эмбрионов

1. Соберите взрослых мух и добавьте 200 женщин и 200 мужчин в коническую трубку объемом 50 мл.
2. Поместите тарелку свежего агара из виноградного сока на дрожжи в трубку объемом 50 мл и закройте губкой caп.
3. Инкубируйте мух при 16 ° C на свет в течение 2 - 3 дней. Изменяйте тарелку один раз в день.
4. Переместите мухи в темноту при 25 ° C в течение 1 часа.
5. Измените старую пластину на новую без дрожжей. Позвольте мухам откладывать яйца на 2 часа.
6. Соберите планшет и инкубируйте при 16 ° C в течение 26 часов.
7. Собирайте эмбрионы с пластины кистью в 1 мл PBS, содержащей 0,2% (об. / Об.) Triton X-100.
8. Промывают эмбрионы дважды с помощью 1 мл PBS, содержащего 0,2% (об. / Об.) Triton X-100.
9. Чтобы удалить хорион, добавьте 1,2 мл раствора гипохлорита натрия (2,2-3,4% Cl) к эмбрионам в течение 3 мин.
10. Промывают эмбрионы 4 раза 1 мл PBS, содержащего 0,2% (об. / Об.) Triton X-100.
11. Поместите эмбрионы на 6-сантиметровые агарозные пластины. Возьмите за основу эмбрионы стадии 16 под микроскопом, как описано Roberts ²⁰ . Соберите приблизительно 50 эмбрионов в 1,5-миллилитровой микропробирке Treff с микропипеткой.

3. ПрепаРацион эмбриональных клеток

1. Промывайте эмбрионы дважды 150 мкл PBS.
2. Гомогенизировать эмбрионы 30 раз в 1,5 мл микропробирке и таблетировочном смесителе в присутствии 200 мкл коллагеназы (0,25% (мас. / Об.)) В PBS.
3. Диспергируют эмбриональные клетки путем пипетирования 10 раз и перемещают суспензию клеток в 1,5 мл пробирку. Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение 1 мин на водяной бане. Повторите этот шаг дважды.
4. Добавить 800 мкл PBS к суспензии клеток и центрифугировать при 1400 x g при 4 ° C в течение 5 мин.
5. Удалите супернатант и добавьте 200 мкл трипсина (0,25% (мас. / Об.)) В PBS к клеткам. Диспергировать эмбриональные клетки путем пипетирования 50 раз.
6. Фильтрат клеточной суспензии с помощью клеточного фильтра 70 мкм.
7. Чтобы остановить активность трипсина, добавьте 40 мкл термонактивированной фетальной бычьей сыворотки в фильтрационную клеточную суспензию. Добавить 800 мкл PBS и центрифугировать при 1400 x g при 4 ° C в течение 5 мин.
8. Удалить супернатыNt, суспендировать осажденные клетки в 200 мкл PBS и центрифугировать при 1400 x g при 4 ° C в течение 5 мин.
9. Удалите супернатант и суспендируйте осажденные клетки в 30 мкл PBS.
10. Нанесите подготовленную клеточную суспензию на стеклянные слайды с покрытием из аминопропилтриэтоксисилана и подождите 10-15 минут, пока клетки не присоединятся к стеклянным слайдам.
11. Удалите оставшееся решение на стеклянных горках с помощью пипетки. Установите 60 - 70 мкл PBS, содержащего 4% (мас. / Об.) PFA (параформальдегид) на клетки в течение 10 - 15 минут для фиксации.
12. Удалите раствор фиксации и поместите стеклянные слайды в PBS более 1 минуты.

4. Окрашивание гемоцитов

1. Иммуноокрашивание антителом против Croquemort
   1. Серийно выдерживают стеклянные слайды в метаноле в течение 10 мин, в PBS, содержащем 0,2% (об. / Об.) Triton X-100 в течение 10 мин, а затем в PBS в течение 10 мин.
   2. Установите 20 мкл 5% (об. / Об.) Всей свиной сыворотки в PBS.0,2% (об. / Об.) Triton X-100 на клетках для блокировки. Инкубируйте слайды при комнатной температуре в течение 20 мин.
   3. Удалите раствор из стеклянных слайдов и установите 20 мкл антисыворотки Ant-Croquemort ^{19 , 21} (0,1% (об. / Об.)) В PBS, содержащем 0,2% (об. / Об.) Triton X-100 на клетках. Инкубируйте слайды при 4 ° C в течение ночи.
   4. Смочите стеклянные слайды в PBS, содержащие 0,2% (об. / Об.) Triton X-100 в течение 10 мин 5 раз.
   5. Замачивайте стеклянные слайды в PBS в течение 10 мин.
   6. На 20 мкл меченого щелочным фосфатазой антикрыла IgG (0,5% (об. / Об.)) В PBS, содержащем 0,2% (об. / Об.) Triton X-100 и 5% (об. / Об.) Всей сыпи в свиней на клетках в комнате Температура в течение 1 часа.
   7. Смочите стеклянные слайды в PBS, содержащие 0,2% (об. / Об.) Triton X-100 в течение 10 мин 5 раз.
   8. Смочите стеклянные слайды в буфере, содержащем 100 мМ Трис-HCl, pH 9,5, 100 мМ NaCl и 50 мМ MgCl _{2 в} течение 10 мин.
   9. Раствор основания фосфатазы, содержащий 0,23 мг / мл 5-бром-4Хлор-3-индолилфосфат (BCIP), 0,35 мг / мл нитро-синего тетразолия (NBT), 100 мМ Трис-HCl, рН 9,5, 100 мМ NaCl и 50 мМ MgCl ₂ на клетках.
   10. Соблюдайте клетки под микроскопом для правильного окрашивания. Когда в гранулах гемоцитов появляются сильные фиолетовые сигналы, удалите раствор субстрата и промойте стеклянное стекло в буфере, состоящем из 10 мМ Трис-HCl, pH 8,5 и 1 мМ ЭДТА. Рекомендуется окрашивание в течение приблизительно 5 - 10 минут.
2. Иммуноокрашивание антителом против GFP (другой вариант для окрашивания гемоцитов)
   1. Последовательно выдерживают стеклянные слайды в метаноле в течение 10 мин, PBS, содержащие 0,2% (об. / Об.) Triton X-100 в течение 10 мин и PBS в течение 10 мин.
   2. Установите 20 мкл 5% (об. / Об.) Всей свиной сыворотки в PBS, содержащей 0,2% (об. / Об.) Triton X-100 на клетках для блокировки. Инкубируйте слайды при комнатной температуре в течение 20 мин.
   3. Удалите раствор на стеклянных слайдах и установите 20 мкл мышиного анти-GFP-антитела (1% (об. / Об.)) / PBS cПолучая 0,2% (об. / Об.) Triton X-100 на клетках. Инкубируйте слайды при комнатной температуре в течение ночи.
   4. Смочите стеклянные слайды в PBS, содержащие 0,2% (об. / Об.) Triton X-100 в течение 10 мин 5 раз.
   5. Замачивайте стеклянные слайды в PBS в течение 10 мин.
   6. На 20 мкл меченого щелочным фосфатазой антимышиного IgG (0,5% (об. / Об.)) В PBS, содержащем 0,2% (об. / Об.) Triton X-100 и 5% (об. / Об.) Всей сыворотки свиней на клетках в комнате Температура в течение 1 часа.
   7. Смочите стеклянные слайды в PBS, содержащие 0,2% (об. / Об.) Triton X-100 в течение 10 мин 5 раз.
   8. Замачивайте стеклянные слайды в буфере, состоящем из 100 мМ Трис-HCl, pH 9,5, 100 мМ NaCl и 50 мМ MgCl _{2 в} течение 10 мин.
   9. Подсоедините раствор фосфатазы, содержащий 0,23 мг / мл BCIP, 0,35 мг / мл NBT, 100 мМ Трис-HCl, pH 9,5, 100 мМ NaCl и 50 мМ MgCl ₂ на клетках.
   10. Соблюдайте клетки под микроскопом для правильного окрашивания. Когда фиолетовые сигналы появляются в целых гемоцитах, удалите раствор субстрата и промойте слайды в буфере, состоящем из10 мМ Трис-HCl, pH 8,5 и 1 мМ ЭДТА. Рекомендуется окрашивание в течение приблизительно 10 - 15 минут.

5. Пятнооптические клетки TUNEL

1. Замочите стеклянные слайды в PBS в течение 5 мин.
2. Повторите с новым PBS.
3. Буфер для выравнивания буфера (см. Таблицу материалов) на ячейках в течение 10 мин.
4. Удалите раствор из стеклянных слайдов и установите 20 мкл раствора TdT, содержащего 5 мкл концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы и 15 мкл реакционного буфера на клетках при 37 ° С в течение 1 часа.
5. Удалите раствор из стеклянных слайдов и промойте слайды в буфере, состоящем из 0,5 мл буфера STOP / Wash и 17 мл воды.
6. Замачивайте слайды в PBS в течение 5 мин 3 раза.
7. Установите 20 мкл анти-дигоксигенин-пероксидазы на клетки при комнатной температуре в течение 30 мин.
8. Замочите стеклянные слайды в PBS в течение 5 минут 4 раза.
9. Замачивать стеклянные слайды в растворе субстрата пероксидазы, состоящем из 30 мл 50 мМ Трис-HCl, pH 7,5, содержится вGa полный микро шпатель 3,3'-диаминобензидинового тетрагидрохлорида (DAB) и 0,002% (об. / Об.) H ₂ O _{2 в} течение 30 с.
10. Повторите шаг 5.9 до тех пор, пока апоптотические клетки не окрасятся в коричневый цвет. Смочите стекло скольжения в воде, чтобы остановить реакцию пероксидазы.
11. Закрепите клетки водой для наблюдения.

6. Измерьте уровень фагоцитоза апоптозных клеток

1. Наблюдайте образцы под легким микроскопом, чтобы оценить уровень фагоцитоза. Грамотрицательные клетки или GFP-позитивные клетки в качестве гемоцитов, TUNEL-позитивные клетки в качестве апоптотических клеток и двойные положительные клетки в качестве фагоцитозирующих гемоцитов.
2. Фагоцитарный индекс определяется как количество двойных положительных клеток на общее число положительных клеток в Крукморт или GFP-положительных клетках. Рекомендуется, чтобы наблюдалось более 300 гемоцитов.

Результаты

Чтобы исследовать фагоцитоз апоптотических клеток, эмбрионы дрозофилы стадии развития 16 собирали и получали в виде дисперсных клеток. Гемоциты, макрофаги дрозофилы , окрашивали иммуноцитохимией для маркера гемоцитов «Croquemort» ^{17 ,}

Обсуждение

Здесь мы описали анализ фагоцитоза с использованием эмбрионов дрозофилы . Используя диспергированные эмбриональные клетки для количественного измерения фагоцитоза, гемоциты, профессиональные фагоциты Drosophila , иммуноокрашены для маркера гемоцитов Croquemort или srpHemo- driven...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
whole swine serum	MP Biomedicals	55993	For bloking
Treff micro test tube(easy fit)  Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL	TreffLab	96. 4625. 9. 01	For  homogenization
pellet mixer  1.5 mL	TreffLab	96. 7339. 9. 03	For  homogenization
Collagenase	Sigma-Aldrich	C-0130	For preparation of embryonic cells
Trypsin	Thermo Fisher SCIENTIFIC	27250-018	For preparation of embryonic cells
Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP	KPL	475-1612	secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
5-bromo-4-chloro- 3-indolyl-phosphate	Roche	11383221001	BCIP, For staining of hemocytes
nitro blue tetrazolium	Roche	11383213001	NBT, For staining of hemocytes
Anti-Croquemort antibody			described previously in Manaka et al., J. Biol. Chem., 279, 48466-48476
Anti-GFP from mouse IgG1κ (clones 7.1 and 13.1)	Roche	11814460001	For staining of hemocytes
Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate	Bio-Rad	170-6520	secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit	Millipore	S7100	For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase.
3,3'-diaminobenzidine tetrahydrichloride	nacalai tesque	11009-41	DAB, For staining of apoptoitc cells
Table of Fly Strains
Name	Stock center	Stock ID	Comments
w1118			Control flies, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
drprΔ5			drpr mutant, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
Itgbn2			Itgbn mutant, described in Devenport et al., Development, 131, 5405-5415
srpHemoGAL4 UAS-EGFP			described in Brückner et al., Dev. Cell., 7, 73-84
UAS-drpr-IR	VDRC	4833	-
UAS-Itgbn-IR	NIG-fly	1762R-1	-