بيوبرينتينج الغضاريف والجلد الأنسجة النظير استخدام سلبية رواية خلط وحدة تقنية بريسيلولاريزيشن بيوينك

Summary

وكانت النظير الغضاريف والجلد بيوبرينتيد باستخدام بيوينك نانوسيلولوسي-الجينات على أساس. كانت سيلولاريزيد في بيوينكس قبل الطباعة عن طريق وحدة خلط سلبي لخطوة واحدة. وقد عرضت بنيات سيلولاريزيد أن يكون موحدا وصلاحية عالية، ويحمل علامات إيجابية للتمايز.

Abstract

بيوبرينتينج تقنية قوية للتصنيع السريع واستنساخه من بنيات للأنسجة التطبيقات الهندسية. في هذه الدراسة، كانت ملفقة النظير الغضاريف والجلد بعد بريسيلولاريزيشن بيوينك استخدام سلبية رواية خلط تقنية وحدة. ووضعت هذه التقنية بهدف تبسيط الخطوات التي تنطوي عليها خلط من تعليق خلية في بيوينك عالية لزوجة. حل خيوط المودعة من خلال بيوبرينتينج يستلزم ضمان التوحيد في توزيع الخلايا قبل الطباعة لتجنب ترسب المناطق دون خلايا أو الاحتفاظ بكتل الخلايا الكبيرة التي يمكن أن تسد الإبرة. نحن إثبات القدرة على سرعة مزيج تعليق خلية مع بيوينك قبل بيوبرينتينج النظير الغضاريف والجلد. يمكن استزراع كلا النظير الأنسجة لمدة تصل إلى 4 أسابيع. أثبت التحليل النسيجي بقاء الخلية وترسب من علامات محددة المصفوفة خارج الخلية (ECM) الأنسجة مثل الجليكوزامينوجليكان (الكمامات) والكولاجين وأنا على التوالي.

Introduction

في السنوات الأخيرة، أصبحت التكنولوجيا ثلاثية الأبعاد (3D) بيوبرينتينج متاحة للباحثين، وتسمح هذه التقنية أصبحت تستخدم على نطاق واسع لتصنيع النظير الأنسجة. بيوبرينتينج وعود لإحداث ثورة في البحوث الطبية الحيوية بتسهيل تصنيع الأنسجة المتعددة الأوجه بنيات سريع وقابل للتكرار. يضع جوهر التكنولوجيا بيوبرينتينج في القدرة على التحكم بدقة في ترسب المواد الحيوية (المعروفة باسم بيوينكس) في ثلاثة أبعاد. يسمح هذا جيل السقالات المعقدة مع مناطق متميزة من التراكيب مصفوفة والعوامل النشطة بيولوجيا، والخلايا التي يمكن إيجاز أدق بنية الأنسجة الأصلية.

وقد استخدمت بيوبرينتينج لتلفيق ثوابت للعديد من التطبيقات الأنسجة بما في ذلك الغضروف¹والجلد²، العضلات³، وعظم⁴. هذه الأنسجة جذابة بيوبرينتينج بسبب بهم الجوهرية striated الصغرى-أبنية مناسبة للتذكير عن طريق ترسيب طبقة بطبقة. على وجه الخصوص، تمتلك الجلد⁵هيكل متعدد الطبقات محددة جيدا، ومناسبة للتصنيع من خلال تقنيات ترسيب طبقة بطبقة مثل بيوبرينتينج. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام بيوبرينتينج لإنشاء بنيات التي تملك أبعاد التشريحية اللازمة وعيب الأشكال لإصلاح الأنسجة. القدرة على توليد الحيوية مع المريض محددة الحجم والشكل⁶ يمكن البدء بمعالجة الطلب على إصلاحات جزئية للعديد من الأنسجة بما في ذلك سبيل المثال لا الحصر تشوهات العظام وتلف الغضروف، والآفات الجلدية القدر الذي يختلف من المريض للمريض.

في هذه الدراسة، كانت ملفقة اثنين النظير الأنسجة (الجلد والغضروف المفصلي) من خلال بيوبرينتينج بيوينكس بريسيلولاريزيد. ضمان كاف في مزج بيوينك مع تعليق خلية يمكن أن تكفل توزيع خلية موحدة مع المحافظة على بقاء الخلية يمكن أن يشكل تحديا. غالباً ما تكون عالية اللزوجة بيوينكس مناسبة بيوبرينتينج عن طريق البثق وتتطلب لذلك خلط واسعة النطاق لضمان مزيج متجانس. يمكن أن تحدث تحت ظروف قاسية خلط الضرر الميكانيكي للخلايا وتؤثر سلبا على استمرارية. وقد أظهرت الدراسات أن معظم موت الخلايا أثناء عملية الطباعة النافثة للحبر يحدث أثناء إعداد مثل خلط^7،8. بينما خلط التقليدية مع الانفعالات⁹ قد تكون كافية للزوجة منخفضة بيوينكس مناسبة ل الطباعة النافثة للحبر¹⁰، خلط للخلايا في بيوينك لزوجة عالية أكثر ملاءمة لقذف بيوبرينتينج أكثر صعوبة. التصدي لهذه الحاجة، أصبح استخدام خلط فوهات أكثر شعبية للمزج بين بيوينكس أثناء عملية الطباعة¹¹. هذه خلاطات أيضا تستخدم على نطاق واسع في البحوث ميكروفلويديكس حيث خلط السوائل مع انخفاض عدد رينولدز هو المهم¹². تتيح الاستفادة من عملية خلط مستمرة مزيج تعليق خلية في بيوينك للتوحيد أثناء عملية الطباعة. ومع ذلك، منذ تعليق خلية تمتلك اللزوجة منخفضة مقارنة بيوينك، سوف تنشأ صعوبات في منع ترسب الخلايا أثناء الطباعة عملية^9،،من¹³¹⁴. بدلاً من ذلك، قد خلط من الخلايا في بيوينك قبل الطباعة إلى معالجة هذه المسألة.

وللحد من موت الخلايا أثناء مزج في بيوينك، قمنا بتطوير تقنية تستند إلى وحدة خلط سلبي لمزج الخلايا في بيوينك في أقل عدد ممكن من الخطوات. خلط الفوضى التي تم إنشاؤها من خلال تدفق المواد عن طريق وحدة خلط غير كافية لتكاثر مزيج هذين العنصرين معا^15،16. ووضع هذا الأسلوب أساسا لتبسيط المزج بين أي تعليق خلية مع أي بيوينك أي مناسبة لقذف بيوبرينتينج. تم تصغير عدد الخطوات في عملية خلط للقضاء على التباين المستخدم للمستخدم في الخلط. خطوات خلط المفرطة يمكن أن تكون مضيعة للوقت وغير قابل للتطبيق على جميع بيوينكس، لا سيما عندما يتعلق الأمر بالخلايا. الثانوية، ونحن تهدف إلى تطوير عملية خلط مكتفية ذاتيا الحفاظ على العقم وتقليل الخسائر في عينة.

في هذه المخطوطة، ندلل على المزج بين تعليق خلية مع بيوينك استخدام سلبية خلط تقنية وحدة يقلل من مناولة وينتج عنه توزيع خلية عالية الجدوى وموحدة. وتستخدم هذه بيوينكس بريسيلولاريزيد ثم إلى بيوبرينت بناء الغضروف أو الجلد مع واحد أو اثنين من أنواع الخلايا على التوالي التي تستزرع لمدة تصل إلى 6 أسابيع. بيوينك تستخدم هو مزيج من الجينات-نانوسيلولوسي، الذي سبق قد أظهرت مدى ملاءمتهم بيوبرينتينج¹.

Protocol

هذا البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية التي وضعتها لجنة أخلاقيات البحوث البشرية في جامعة تشالمرز.

ملاحظة: جميع الخطوات التي يتعين القيام بها داخل مجلس الوزراء السلامة الأحيائية عقيمة.

1-إعداد المواد الاستهلاكية، وبيوينك، والخلايا

1. الحصول على اثنين من المحاقن، وحقنه واحدة (الشكل 1) لتعليق خلية، بينما المحاقن الأخرى بيوينك (الشكل 1ب).
2. الحصول على عقيمة سلبي خلط وحدة (الشكل 1ج) التي يمكن أن تقترن بالحقن المزدوج عبر اتصال قفل اللوير.
3. الحصول على وحدة الاستغناء عن (الشكل 1د) التي يمكن قذف كمية من المحاقن المعقمة اثنين في أن واحد بمعدل الخاضعة للرقابة.
   ملاحظة: نسبة خلط المستخدمة في هذه الدراسة هو 10:1. ولذلك، استخدام المحاقن 12 مل وحقنه 1 مل حسبما تقتضيه وحدة خلط 10:1.
4. الحصول على خرطوشة عقيمة (الشكل 1ﻫ) وموصل قفل اللوير أنثى والإناث عقيمة إلى مختلطة مباشرة تعليق بيوينك وخلية في.
5. الحصول على أو إعداد في بيوينك لمزج مع تعليق خلية.
   ملاحظة: استخدمت في هذا البروتوكول، بيوينك نانوسيلولوسي/الجينات على أساس. هذا بيوينك cross-linked عن طريق إضافة حل عقيم 100 مم كاكل₂ وظيفة الطباعة.
6. فصل الخلايا باستخدام حل التربسين/يدتا 0.5% وحساب إجمالي عدد الخلايا باستخدام أسلوب الاستبعاد الأزرق تريبان¹⁷.
   ملاحظة: في هذا البروتوكول، وقد استخدمت الليفية البشرية.
7. تحديد كثافة الخلية ما هو المطلوب في بناء المطبوعة النهائية. حساب المعادلات التالية باستخدام تركيز الخلايا المقطوعة التي يجب أن تضعف لتحقيق هذا الهدف الخلية الأخيرة الكثافة.
   ملاحظة: في هذا البروتوكول، استخدمت بكثافة خلية الأخيرة من 5 × 10⁶ خلايا/مل.
   1. حدد تركيز خلايا المطلوب للتجارب: ج_خلية (خلايا/مل).
   2. حساب كمية اللازمة، بيوينك V_بيوينك، استناداً إلى العدد الإجمالي لثوابت المطلوب:
      V_بيوينك = V_بناء × ن_{كونتروكتس}
      ملاحظة: على سبيل المثال، هو حجم بيوينك لبناء 100 ميليلتر. إذا كان يتم طباعة 30 بنيات، ثم وحدة التخزين بيوينك حاجة 3 مل.
   3. حساب عدد الخلايا المطلوبة:
      _خلايا من N = C_خلية (× 1.1 V_{بيولينك})
   4. ريسوسبيند الخلايا (_خلايامن N) في 1/10^th حجم بيوينك:
      V_{تعليق خلية} = 0.1 × V_{بيولينك}
      ملاحظة: على سبيل المثال، إذا كان ت_بيوينك = 3 مل، ثم الخامس_{تعليق خلية} = 0.1 × 3 مل = 0.3 مل

2-خلط تعليق خلية وبيوينك

1. نقل تعليق خلية في محقن تعليق خلية.
2. نقل بيوينك لحقنه أخرى أو الحصول على حقنه تحتوي على بيوينك.
3. سحب المكبس حقنه بيوينك وإدراج المحاقن في الاستغناء عن وحدة. ضع وحدة رأسياً مع نظام قفل الموصل صعودا (الشكل 1f1).
4. سحب المكبس المحاقن الخلية مرة أخرى لمدة مماثلة كحقنة بيوينك وإدراج في الاستغناء عن وحدة (f2منالشكل 1).
5. إرفاق كل المحاقن وحدة خلط بالتواء الموصلات قفل اللوير (الشكل 1f3).
6. رئيس الوزراء نظام الاختلاط عن طريق دفع على الاستغناء عن وحدة لقذف الهواء في المحاقن. وقف فتيلة قبل الحل التوصل إلى قفل اللوير (g4منالشكل 1).
7. بعد فتيلة، إرفاق ملء خرطوشة إلى نهاية وحدة خلط عبر موصل قفل اللوير (الشكل 1g5). تأكد من أن المكبس في ملء خرطوشة أسفل قبل الإلحاق.
8. ضغط ببطء (الشكل 1h6) الاستغناء عن الوحدة من مزيج تعليق خلية وبيوينك معا في الخرطوشة (الشكل 1i7).
9. دفع المكبس في خرطوشة تعبئة إلى الأسفل مع تلميح بيبيت عقيمة الاتصال الخليط خلية بيوينك بعد خلط. الاحتفاظ بصرفها حتى ضغط لضمان ليس هو مقذوف الخليط خلية/بيوينك مرة أخرى إلى وحدة خلط.
10. كاب الخرطوشة، واضغط برفق على سطح العمل لنقل أي فقاعات الهواء إلى الجزء العلوي من الخرطوشة (نهاية المكبس).
    ملاحظة: عند هذه النقطة، هذا الخليط خلية/بيوينك جاهزة للطباعة. سيتم تخطيط المقاطع التالية تطبيقات محددة وإجراءات الطباعة.

3-تحديد صلاحية الخلية باستخدام وحدة خلط خلط ملعقة اليدوي بالمقارنة

1. فصل الليفية البشرية (مرور 7) مع حل التربسين/يدتا 0.5% في التقاء 80% وعدد ريسوسبيند في الثقافة المتوسطة في كثافة الخلية كافية لتحقيق تركيز نهائي بعد المزج مع بيوينك (01:10 نسبة الخلية: بيوينك) من 5 × 10 ⁶ خلايا/مل.
2. دمج الخلايا إلى بيوينك استخدام أما السلبي خلط وحدة تقنية (الخطوة 2) أو عن طريق ملعقة لتقييم أثر كل التقنيات على بقاء الخلية.
3. تندمج الخلايا في بيوينك استخدام السلبي خلط وحدة تقنية 1، 2، أو 3 مرات قبل صرفها في قالب العابرة للربط باستخدام 100 مم كاكل₂.
   ملاحظة: لإجراء يمزج إضافية، مزيج الخلية/بيوينك مباشرة في حقنه بدلاً من خرطوشة. ثم ريمكس المزيج من خلال وحدة خلط يتبع البروتوكول السابق لكن بدون عنصر حقنه في الخلية.
4. تندمج الخلايا في بيوينك منفصلة استخدام دليل الميكانيكية الاختلاط عن طريق ملعقة للمدد الزمنية لنقل س. 30 أو 60 أو 90 الخلائط (لكل وقت خلط) في قالب العابرة للربط باستخدام كاكل 100 مم₂.
5. نقل العينات إلى لوحة جيدا بعد الانتهاء من العابرة للربط والثقافة تحت الظروف القياسية.
6. بعد يوم واحد من الثقافة، يغسل بنيات (n = 3-4 كل مجموعة) في الخلية خالية من المصل الثقافة المتوسطة للحد الأدنى 30 وصمة عار الخلايا في بنيات مع حل المصبوغة (4 ميكرومتر كالسين صباحا، 1 ميكرومتر اثيديوم هوموديمير-1) لمدة 30 دقيقة.
   1. تغسل مرتين إضافية، واحتضان هذه العينات في مستنبت الخلية خالية من المصل لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.

نقل العينات إلى حل تصوير خلية حية.

الحصول على الصور عن طريق كاميرا رقمية ملونة في 10 X التكبير باستخدام مجهر مقلوب مع مرشحات فيتك وتكساس الأحمر، وتحليل استخدام برمجيات تحليل الصورة.

شكل عشوائي حدد ثلاث صور من كل بناء للتحديد الكمي لبقاء الخلية.

حساب الجدوى استناداً إلى نسبة الخلايا الحية إلى العدد الإجمالي للخلايا. تحليل البيانات عن طريق ANOVA اتجاه واحد متبوعاً باختبار مقارنات متعددة في توكي.

4-بيوبرينتينج النظير الغضروف مع نوع خلية مفردة

1. رسم نموذج ثلاثي الأبعاد من الأنسجة المرجوة التناظرية. تحويل إلى ملف جكودي من أجل بيوبرينتينج وتحميل الملف جكودي على بيوبرينتير¹.
   ملاحظة: في هذا البروتوكول، بنية مربعة بإبعاد 4.8 × 4.8 × 0.9 مم³ تم تصديره كملف STL. تم إنشاء ملف Gcode بنية شعرية باستخدام الإعدادات التالية: سمك طبقة، 0.3 مم؛ بدأت أعمال الحفر نمط، مستقيمة؛ بدأت أعمال الحفر الكثافة، 25 في المائة؛ السرعة، 10 مم/s.
2. عزل وكريوبريسيرفي الابتدائي الآنف البشرية chondrocytes (hNC) من المرضى بعد البروتوكول المشار إليه¹.
3. ذوبان الجليد وتوسيع هنكس cryopreserved وتوسيع مرة في ثقافة أحادي الطبقة باستخدام معيار الثقافة المتوسطة عند 37 درجة مئوية. فصل الخلايا عند التقاء 80-90% مع حل التربسين/يدتا 0.5% والاعتماد على استخدام بروتوكول تريبان أزرق استبعاد. جميع التجارب التي أجريت باستخدام هنكس في المقطع 2.
4. ريسوسبيند هنكس في 100 × 10⁶ خلايا/مل ضمن 300 ميليلتر متوسطة الثقافة تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين، 1% البنسلين-ستربتوميسين، وحمض الأسكوربيك 50 ميكروغرام/ملليلتر، تحضيرا للمزج مع بيوينك.
5. مزيج hNC تعليق خلية في نانوسيلولوسي/الجينات على أساس يلي بيوينك السلبي خلط البروتوكول وحدة بنسبة تعليق bioink:cell 10:1 للحصول على تركيز خلية الأخيرة من 9 × 10⁶ خلايا/مل.
6. ضمان هو تعقيم في بيوبرينتير عن طريق التعرض للأشعة فوق البنفسجية ومسح أسفل مع الإيثانول 70%. الحفاظ على العقم عن طريق وضع في تدفق الصفحي مجلس الوزراء.
7. إرفاق فوهات الطباعة العقيمة الخراطيش التي تحتوي على مزيج تعليق بيوينك/خلية وإدراج بيوبرينتير.
8. معايرة بيوبرينتير أما يدوياً أو بواسطة البروتوكولات الخاصة بالطابعة.
9. بيوبرينت شعرية-منظم، محملة بالخلية بنيات استخدام معلمات الطباعة التالية: ز 25 فوهة مخروطية عند ضغط 25 كيلو باسكال. بيوبرينت الخلية خالية من بنيات (مخلوطة مع المتوسطة الخلية التي تحتوي على أي من الخلايا) كعنصر تحكم.
10. تشابك بنيات بإضافة حلاً الأيونية من 100 مم كاكل₂ لأدنى 5 شطف بنيات واحتضان في المتوسط الثقافة تحت ظروف الثقافة القياسية (37 درجة مئوية و 5% CO₂و 95% رطوبة نسبية). تغيير وسائل الإعلام كل يوم الثاني أو الثالث.
11. جمع عينات للتحليل النسيجي في أسابيع 2 و 4. وصمة عار العينات لإنتاج هفوة استخدام وصمة عار أزرق السيان¹⁸.

5-بيوبرينتينج النظير الجلد مع نوعين من الخلايا

1. رسم نموذج ثلاثي الأبعاد من الأنسجة المرجوة التناظرية وتحويلها إلى ملف جكودي بيوبرينتينج. تحميل الملف جكودي على بيوبرينتير.
   ملاحظة: في هذا البروتوكول، بنية مربعة بإبعاد 4.8 × 4.8 × 0.9 مم³ تم تصديره كملف STL. ثم تم إنشاء ملف Gcode بنية شعرية باستخدام الإعدادات التالية: سمك طبقة، 0.3 مم؛ بدأت أعمال الحفر نمط، مستقيمة؛ بدأت أعمال الحفر الكثافة، 25 في المائة؛ السرعة، 10 مم/s.
2. إعداد الخلايا لمزج في بيوينك بيوبرينتينج. واستخدمت لتصنيع النظير الجلد، نوعين من الخلايا. تم مزج أنواع الخلايا اثنين في بيوينك وبيوبرينتينج.
   1. الحصول على المركز الثقافي الفرنسي الرئيسي. الحفاظ على هذه الخلايا في وسائط النمو دميم وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين، 1% البنسلين-ستربتوميسين، وحمض الأسكوربيك ميكروغرام/مل 50. فصل الخلايا عند التقاء 80-90% مع الحل التربسين/يدتا 0.5% والعد.
   2. عزل وكريوبريسيرفي hNC الأولية من المرضى بعد البروتوكول المشار إليه¹. ذوبان الجليد وتوسيع cryopreserved هنكس في ثقافة أحادي الطبقة. فصل الخلايا عند التقاء 80-90% مع الحل التربسين/يدتا 0.5% والعد.
3. ريسوسبيند كل أنواع الخلايا في 100 × 10⁶ خلايا/مل داخل وسائط النمو. مزيج من تعليق خلية معا بنسبة 1:1 لتحقيق تركيز مجموع نهائي من 100 × 10⁶ خلايا/مل في 300 ميليلتر لوسائل الإعلام.
4. يقوم مزيج 50: 50 تعليق خلية HDF و hNC في نانوسيلولوسي/الجينات التالية بيوينك السلبي خلط البروتوكول وحدة بنسبة تعليق bioink:cell 10:1 للحصول على تركيز خلية الأخيرة من 9 × 10⁶ خلايا/مل.
5. التأكد من أن بيوبرينتير يتم تعقيمها أو يوضع في تدفق الصفحي مجلس الوزراء للحفاظ على العقم.
6. إرفاق فوهات الطباعة العقيمة الخراطيش التي تحتوي على مزيج تعليق بيوينك/خلية وإدراج بيوبرينتير.
7. معايرة بيوبرينتير أما يدوياً أو البروتوكولات الخاصة بالطابعة.
8. بيوبرينت شعرية-منظم، محملة بالخلية بنيات استخدام معلمات الطباعة التالية: ز 25 فوهة مخروطية عند ضغط 25 كيلو باسكال. بيوبرينت الخلية خالية من بنيات (مخلوطة مع المتوسطة الخلية التي تحتوي على أي من الخلايا) كعنصر تحكم.
9. تشابك بنيات بإضافة حلاً الأيونية من 100 مم كاكل₂ لأدنى 5 شطف بنيات واحتضان في المتوسط الثقافة تحت ظروف الثقافة القياسية (37 درجة مئوية و 5% CO₂و 95% رطوبة نسبية). تغيير وسائل الإعلام كل يوم الثاني أو الثالث.
10. جمع عينات للتحليل النسيجي في أسابيع 2 و 4. وصمة عار العينات للكولاجين أنا الإنتاج باستخدام ماسون وصمة عار تريتشرومي¹⁹.

النتائج

النتائج في هذه المخطوطة تنقسم إلى قسمين. أولاً، وقد تم تحليل جدوى الخلية بعد خلط مع أسلوب الميكانيكية أو وحدة خلط السلبي. بعد ذلك، بنيات الغضاريف والجلد مثقف وتحليلها لعلامات نسيجية ذات الصلة.

وبدأ توزيع الخلايا متجانسة في كلتا الحالتين. ومع ذلك، قد عمل خلط باليد باستخدام ملعقة (الشكل 2ب) الفرق أكثر من الاختلاط مع وحدة خلط سلبي (الشكل 2). مدى وسرعة وتقنية خلط مع ملعقة يعتمد اعتماداً كبيرا على المستخدم. ومع ذلك، مزج الخلايا في بيوينك مع وحدة خلط سلبي توحد الاختلاط ويقلل التباين عبر دفعات. وعلاوة على ذلك، 30 و 60 و 90 s خلط الوقت مايو لن تكون كافية لخلط كمية كبيرة من الخلايا إلى كمية كبيرة من بيوينك. قد يكون من الضروري مزج أكثر صرامة من خلال خلط مع ملعقة. وبالمقارنة، الاستعانة بوحدة خلط سلبي أفضل يحافظ على نسبة خلط خلايا إلى بيوينك من خلال مزج ويضمن أن تتم خلط متجانسة. بالإضافة إلى ذلك، فقدان عينة مصدر قلق مع التقنيات التقليدية لخلط حيث يمكن تركها بيوينك في أطباق بتري، أنابيب، وأدوات خلط بسبب تلك اللزوجة العالية. بقاء الخلية كانت عالية بالنسبة لخلط مع وحدة خلط (> 90%) 1 أو 2 أو 3 مرات. عندما استخدمت وحدة خلط السلبي، مزج استغرق حوالي 1 دقيقة بمعدل بطيء ثابت مزج. بينما خلط مع ملعقة أظهرت جدوى عالية بعد الاختلاط ل 30 و 60 ثانية، أكبر من 90 s من خلط أدت إلى انخفاض كبير في جدوى مقارنة بالمجموعات الأخرى (77.9 ± 14 ٪، ف < 0.05) (الشكل 2ج). قد يكون هذا بسبب الاختلاط المفرط الذي يسبب الضرر للخلايا. الطويلة الأجل تلطيخ يعيش الميت بعد أيام 14 و 28 يوما من الثقافة يبين التكميلية الرقم 1. الخلايا تبدأ نشر يوم 14، وتنتشر في عالية قبل يوم 28، وتبين جدوى جيدة.

بعد الثقافة، حللت النظير أنسجة الغضاريف والجلد عن طريق الأنسجة. ويبين تحليل نيات غضروف في الأيام 0 و 14 و 28 زيادة في الكمية والتغطية من الكمامات كما يتبين من خلال وصمة الأزرق السيان (الشكل 3a-3_c). لاحظت غياب وصمة عار في اليوم 0، بينما في يوم 14 تلطيخ يقتصر على مواقع الدانية للخلايا. ومع ذلك، قبل يوم 28 من الثقافة، يتم العثور على الأزرق السيان في جميع أنحاء البناء، مما يدل على تشكيل تشوندروسيتيك إدارة المحتوى في المؤسسة. بيوبرينتيد الجلد بنيات حللت عن طريق تلطيخ نسيجية الكولاجين أنا استخدام ماسون وصمة عار تريتشرومي (الشكل 3د-3f). شبيه بنيات الغضاريف، أظهرت عينات اليوم 0 لا ترسيب الكولاجين. قبل 14 يوم من الثقافة، لوحظت رواسب كبيرة من الكولاجين حول الخلايا وعلى طول سطح بناء. هذا تواصل تعزيز يوم 28، حيث تم العثور على طبقات كثيفة من الكولاجين على سطح بناء وداخل الجزء الأكبر.

الشكل 1 : الخامل خلط نظام الوحدة. () حقنه 1 مل لتعليق خلية، (ب) 12 مل المحاقن مع بيوينك، (ج) الاستغناء عن وحدة، وحدة خلط السلبي (د)، (ه) ملء خرطوشة، والجمعية (f) حقنه بيوينك (1) وخلية تعليق المحاقن (2) في وحدة الاستغناء عن مرفق لوحدة خلط السلبي إلى نهاية كل من المحاقن (3)، (ز) المرفق الموصل بقفل اللوير أنثى والإناث (4) ومرفق لملء خرطوشة (5) يكمل في الجمعية، (ح ) ضغط وحدة صرف رئيس الوزراء خلط وحدة (6)، (أنا) الاستمرار في دفع إلى الأسفل في وحدة الاستغناء عن مزيج من تعليق خلية مع بيوينك والاستغناء عن إلى ملء خرطوشة (7). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 2 : الخلية صلاحية الصور والتحليل- صور الممثل تظهر حية (الأخضر) والليفية البشرية الميت (أحمر) بعد خلط مع السلبي خلط وحدة 1 أو 2 أو 3 مرات () أو ملعقة 30 أو 60، 90 ثانية (ب) والثقافة 3D لمدة يوم واحد. تظهر الصور في 4 X التكبير. وتبين أشرطة مقياس 200 ميكرومتر. (ج) بقاء متوسط النسبة المئوية للخلايا الليفية البشرية بعد الاختلاط مع السلبي خلط وحدة أو ملعقة والثقافة 3D لمدة يوم واحد. إظهار أشرطة الخطأ المعياري للوسط، * 0.005. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3: ترسب محددة المصفوفة خارج الخلية الأنسجة. بنيات غضروف بيوبرينتيد الملون الجليكوزامينوجليكان استخدام السيان الأزرق في () اليوم 0، (ب) 14، و (ج) 28. الصور التي تم التقاطها في 5 X التكبير. بيوبرينتيد بنيات الجلد الملون للكولاجين الأول باستخدام تريتشرومي ماسون (د) اليوم 0، (ه) 14، و (و) 28. الصور التي تم التقاطها في 5 X التكبير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

التكميلية رقم 1: "بقاء الخلية" في يوم 14 ()، ويوم 28 (ب). شريط مقياس 200 ميكرومتر، الأخضر يشير إلى العيش الخلايا، الأحمر يشير إلى خلايا ميتة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

كما هو موضح في هذه المخطوطة، بيوينكس بريسيلولاريزيد بيوبرينتيد لاختلاق أما الغضروف أو الجلد النظير التي تم مثقف لمدة تصل إلى 4 أسابيع. بقاء الخلية بعد المزج بين استخدام السلبي خلط تقنية وحدة كان أعلى من خلط الأساليب التقليدية. بالإضافة إلى ذلك، يقلل من العدد من التعامل مع خطوات تبسيط عملية المزج باستخدام وحدة خلط ويسمح بتناسق أفضل في مدى خلط. وفي نهاية المطاف، وهذا يؤدي في إمكانية تكرار نتائج أفضل في كل خلية التوزيع داخل في بيوينك، وعبر بنيات والمجموعات التجريبية. ترسيب مكونات الأنسجة ECM محددة مثل الكمامات والكولاجين أنا لوحظ للنظير كل من الغضروف والجلد، على التوالي بعد 4 أسابيع ثقافة. يشير هذا إلى المرونة في أسلوب خلط وهندسة بناء الذي تم اختياره اختﻻق أهدافا مختلفة من الأنسجة. تصنيع النظير الغضاريف والجلد أظهرت مرونة استخدام كلا بيوينك نانوسيلولوسي-الجينات وتقنية بيوبرينتينج لأهداف الأنسجة المهندسة المتميزة. وسوف نناقش مكونين من الدراسة أدناه: (1) السلبي خلط وحدة تقنية، والسلوك (2) من الخلايا داخل النظير الغضاريف والجلد.

في التنمية والاستفادة المثلى من تقنية للمزج بين تعليق خلية في بيوينك أمر بالغ الأهمية لتلفيق هذه الثوابت. بخلاف المواد المائية التقليدية اللزوجة منخفضة، أسفرت لزوجة عالية بيوينكس صعوبة في بريسيلولاريزيشن بيوينك قبل الطباعة. كبديل للطريقة التقليدية لدمج الخلية في بيوينك، ووضعت بروتوكولا لخلط خطوة واحدة من تعليق خلية في بيوينك لزج وناقش. بالإضافة إلى ذلك، تم تقييم التطبيق العملي لهذا الأسلوب خلط في تصنيع الأنسجة بنيات. هذا النهج خطوة واحدة خلط العديد من المزايا التقليدية خلط التقنيات المدرجة التي تسيطر عليها خلط نسبة، والتقليل إلى أدنى حد تشدد القص عالية وغير النظامية، وإغلاق نظام مغلق للقضاء على عينة في خلط السفن. ومع ذلك، هناك العديد من الخطوات الهامة في هذا الأسلوب التأكد من مزاياها أكثر الأساليب التقليدية لمزج الخلايا/بيوينك. أنها حاسمة لضمان وقف الخلايا في خلية المحاقن وتمتزج جيدا قبل المزج. جداً كبير من فجوة زمنية بين رفع ونقل الخلايا في المحاقن وانطلاق عملية خلط يمكن أن يسبب الخلايا للرواسب، مما سيؤدي إلى خلط متفاوتة والتوزيع إلى خيوط مطبوعة. إذا كان الترسيب انعكاس بسيط، ولوحظ (2-3 مرات) للجمعية وحدة خلط السلبي فورا قبل خلط غير كافية ريسوسبيند الخلايا وضمان توزيع موحدة قبل المزج. من المهم أيضا أن فقاعات الهواء في الحقن يتم القضاء أو التقليل من شأنها مسبقة لضمان بقاء نسبة خلط مستمر. إذا ظلت فقاعات الهواء الكبيرة في الخرطوشة بيوينك قبل المزج، من المستحسن أن تشغيل الحل عن طريق وحدة خلط وقت إضافي لضمان خلط دقيق. إذا ظلت فقاعات الهواء، يمكن أن تحل محل التنصت لطيف للخرطوشة الطباعة/المحاقن فقاعات الهواء المتبقية. بالإضافة إلى ذلك، إذا كانت المواد متعددة مزج (عدة خلط الوحدات أو المواد) اللازمة لثوابت أكثر تعقيداً، يجب تعديل تركيزات معلقات بيوينكس/خلية لتكون مختلطة لضمان أن بعد تخفيفها من خلال المزج السليم ويتحقق ما زال التركيز النهائي.

بالمقارنة مع غيرها من تقنيات المزج، وحدة خلط السلبي نهجاً جديداً سيلولاريزي بيوينكس. خلافا لغيرها من التقنيات خلط مثل المحاقن المزدوج الاختلاط، أو التحريك بملعقة أو أداة أخرى، يسمح وحدة خلط السلبي المزيد من الاتساق في مزج عبر المجموعات والمستخدمين. طبيعة أساليب خلط يدوي، مثل خلط ملعقة، ينتج أكبر مستخدم لتباين في مدى ومعدل خلط. بالإضافة إلى ذلك، قد نظم مغلقة مثل السلبي الخلط بين الوحدة وخلط الحقن المزدوج قليلاً إلى أي خسارة عينة مقارنة بدليل الاختلاط داخل طبق بتري أو أنبوب.

كلا النظير الأنسجة ملفقة في هذه المخطوطة تتألف من نوع واحد من بيوينك وواحد أو اثنين من أنواع الخلايا. ومع ذلك، بيوبرينتينج النظير الأنسجة التي تتكون من أبنية تحتوي على مناطق بيوينكس متميزة مع أنواع الخلايا مميزة قد تكون ضرورية لتصنيع أكثر الأنسجة الفسيولوجية بنيات^{20،21، 22}. أكثر تخصصا بيوينكس مع تركيبة فريدة من نوعها، أو قد يتم إنشاء وظائف من خلال المزج بين عدة أنواع من القائمة بيوينكس معا لإنشاء بيوينكس مولتيماتيريال أن يكون متميزاً التراكيب أو وظائف^{23، 24}. قد يكون هذا أهمية خاصة في مناطق الانتقال الأنسجة مثل الجلد إلى طبقة تحت الجلد أو الغضروف إلى المنطقة للأنسجة حيث تدرج بيوينك تكوين^،من²⁵إلى²⁶ قد تكون ضرورية لضمان التنمية للعظام هذه المناطق الحرجة في الأنسجة الأصلية²⁷. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام وحدة خلط مزيج في عوامل النمو ومورفوجينس إلى بيوينكس قبل بيوبرينتينج. والقضاء على فقدان عينة مع نظام خلط مغلقة جذابة لاستخدام العوامل النشطة بيولوجيا تركيز باهظة التكلفة ومنخفضة، حيث يمكن أن يؤدي فقدان عينة في تغيير إلى تركزها النهائي داخل بنية بيوبرينتيد، لا سيما عندما وتشارك التدرجات.

حد مع أي تقنية خلط، بما في ذلك السلبي خلط الوحدة المستخدمة في هذه الدراسة، هو خطر الإصابة بضرر لأنواع الخلايا الحساسة ميكانيكيا. على سبيل المثال، عزل هذه الخلايا الجذعية من نخاع العظم أو الجنين، أو الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent أكثر عرضه لأضرار ميكانيكية^28،29. قانون الاختلاط يضفي تؤكد الميكانيكية غير طبيعي في الخلايا بسبب القص القوات المشاركة في عملية خلط، وأنها يجب أن تكون متوازنة للحفاظ على بقاء³⁰. بينما أدى استخدام الخلايا الليفية الأولية وتشوندروسيتيس في هذه الدراسة جدوى جيدة (الشكل 2)، يتم إجراء مزيد من الدراسات اللازمة لتحديد معدلات خلط آمنة ونسب لأنواع الخلايا أكثر حساسية. حتى ذلك الحين، من المستحسن أن خلط يجب أداؤها بموجب بمعدل بطيء ثابت تحقيق أقصى قدر من الجدوى. بالإضافة إلى ذلك، كان تحدد كثافة الخلية المختارة في هذه الدراسة استناداً إلى الدراسات السابقة¹. قد لا تكون هذه الخلية كثافة مثالية لجميع أنواع الخلايا.على وجه الخصوص، قد يؤدي مزج الخلايا بتركيز أعلى زيادة خلية-خلية الاتصالات التي يمكن أن يحسن بقاء الخلايا والأنسجة تشكيل^31،32. على نفس المنوال، وحدة خلط سلبية يمكن أن تنطبق على مزج الماغنيسيوم الخلية أو المجاميع خلية أخرى³³ في بيوينكس.

كما اقترحت وأثبت في هذه الدراسة، سلبية خلط نظام وحدة يمكن أن سرعة الذوبان تعليق خلية في بيوينك لزج. في حين لا يزال خطر الضرر الميكانيكي للخلايا، النهج يتيح المزيد من الاتساق في مزج في دراسة واحدة، وعبر المستخدمين. واستخدمت بيوينكس بريسيلولاريزيد استخدام هذا النهج اختﻻق كلا الغضاريف والجلد النظير التي تم مثقف لمدة تصل إلى 4 أسابيع، وأظهرت ترسب الأنسجة محددة ECM علامات. الدراسات المستقبلية ستركز على الاستفادة السلبي خلط نظام الوحدة لمزج بيوينكس المتخصصة من بيوينكس موحدة لتصنيع النظير الأنسجة أكثر تعقيداً.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
STARTINK Kit	CELLINK	SK0001	Kit that contained all the elements for the CELLMIXER procedure
Live/Dead Kit	Life Technologies	L3224	Kit for the analysis of cell viability after mixing
Masson's Trichrome	Sigma Aldrich	HT15-1KT	Kit for the analysis of collagen I deposition in the skin constructs
Alcian Blue	Sigma Aldrich	B8438-250ML	Kit for the analysis of glycosaminoglycan deposition in the skin constructs
INKREDIBLE+ bioprinter	CELLINK	Gen1+	Printer utilized in the study
DMEM with Glutamax	Thermofisher	10566016	Media for culture of the cells
10% fetal bovine serum	Thermofisher	A3160402	Media supplement
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15070063	Media supplement
live cell imaging solution	thermofisher	A14291DJ	component utilized using live/dead imaging
inverted microscope	Olympus	IX73	microscope utilized
a digital color camera	Olympus	XC10	microscope camera utilized
cellSens imaging software	Olympus	n/a	stock software with the microscope
ImageJ	NIH	n/a	open source image analysis software
GraphPad Prism 7	GraphPad	n/a	software for statistical analysis
Slic3r software (v1.2.9)	Slic3r	n/a	open-source software to convert .stl file to gcode
primary adult human dermal fibroblasts	ATCC	PCS-201-012	cell source for fibroblasts