Подложке хряща и аналогов ткани кожи, используя Роман пассивного смешивания единицы техники для Bioink Precellularization

Резюме

Хрящей и кожи аналоги были bioprinted с помощью Наноцеллюлоза альгинат на основе bioink. Bioinks были cellularized до печати через один шаг пассивной смесительного узла. Конструкции были продемонстрированы равномерно cellularized, иметь высокую жизнеспособность и проявляют благоприятное маркеры дифференциации.

Аннотация

Подложке является мощным средством для быстрого и воспроизводимые изготовления конструкций для ткани, инженерных приложений. В этом исследовании были сфабрикованы аналогов хрящей и кожи после bioink pre-cellularization, используя Роман пассивного смешивания единицы техники. Этот метод был разработан с целью упростить этапы перемешивания суспензии клеток в вязких bioink. Разрешение на хранение через подложке нитей требует обеспечения единства в распределении ячейки до печати, чтобы избежать осаждения регионов без клетки или удержания крупноклеточный сгустки, которые могут засорить иглы. Мы демонстрируем способность быстро смесь суспензии клеток с bioink до подложке хрящей и кожи аналогов. Обе ткани аналоги могли культивированный на срок до 4 недель. Гистологический анализ продемонстрировал жизнеспособность клеток и осаждения маркеров конкретных внеклеточной матрицы (ECM) ткани как гликозаминогликанов (GAGs) и коллаген я соответственно.

Введение

В последние годы трехмерные (3D) подложке технологии становятся более доступными для исследователей, позволяя способ стать более широко используются для изготовления ткани аналоги. Подложке обещает революционизировать биомедицинских исследований, облегчая быстрое и повторяемые изготовление конструкций многогранной ткани. Суть технологии подложке лежит способность точно контролировать осаждения биоматериалов (известный как bioinks) в трех измерениях. Это позволяет поколение сложных строительных лесов с различных регионов матрица композиций, биологически активные факторы и клетки, которые могут более точно охарактеризовать родной ткани структуры.

Подложке была использована для изготовления конструкций для многих приложений ткани, включая хрящ¹, кожи², мышцы³и кость⁴. Эти ткани являются привлекательными для подложке из-за их внутренние полосатый микро архитектуры, которые подходят для резюме через слой за слоем осаждений. В частности кожа обладает четко многослойная структура⁵, который подходит для изготовления через слой за слоем осаждения таких методов, как подложке. Кроме того подложке может использоваться для создания конструкции, которые обладают необходимой анатомической размеры и формы для ремонта ткани дефекта. Способность генерировать биоматериалов с конкретного пациента размер и форма⁶ может приступить к решению спрос на частичный ремонт многих тканей, в том числе, но не ограничиваясь костных дефектов, повреждение хряща и поражения кожи, которого варьируется от пациента к пациенту.

В этом исследовании были изготовлены два ткани аналоги (суставных хрящей и кожи) через подложке pre-cellularized bioinks. Обеспечение надлежащего смешивания bioink с суспензии клеток, которые могут обеспечить распределение форма клеток при сохранении жизнеспособности клеток может быть сложной задачей. Bioinks подходит для подложке через экструзии часто высоковязких и поэтому требуют обширной смешивания для обеспечения однородной смеси. Механические повреждения клеток может произойти в суровых условиях, смешивания и отрицательно сказаться на жизнеспособности. Исследования показали, что большинство смерти клетки во время процесса струйной печати происходит во время подготовки как смешивания^7,8. Хотя традиционные смешивания с агитации⁹ может быть достаточно для низкой вязкости bioinks подходит для струйной печати¹⁰, смешивая клеток в bioink высокой вязкостью более подходящим для экструзии подложке является более сложным. Удовлетворения этой потребности, использование смешивания сопла становится более популярным для смешивания bioinks во время печати процесс¹¹. Эти смесители также широко используются в научных исследованиях микрофлюидика, где Смешивание жидкостей с низкой число Рейнольдса является важным¹². Утилизация непрерывным процессом перемешивания смесь суспензии клеток в bioink позволит единообразия во время процесса печатания. Однако поскольку суспензий клеток обладают низкой вязкости, по сравнению с bioink, будут возникают трудности в деле предотвращения оседания клеток во время печати процесс^9,,1314. Кроме того смешивая клеток в bioink до печати может решить эту проблему.

Чтобы свести к минимуму гибель клеток во время смешивания в bioink, мы разработали метод, основанный на пассивной блок смешивания смесь клеток в bioink в минимальное количество шагов. Хаотическое смешивания, порожденных через поток материалов через блок смешивания достаточно по герметизации смесь двух компонентов вместе^15,16. Этот метод главным образом был разработан для упрощения наложения любой суспензию клеток с любой bioink, который подходит для экструзии подложке. Количество шагов в процессе перемешивания был свернут для устранения пользователей вариации в смешивание. Чрезмерного смешивания шагов может быть трудоемким и не применимы для всех bioinks, особенно когда клетки участвуют. Вторичные, мы стремились разработать смешивая процесса, который является автономным, как сохранение стерильности и свести к минимуму потери образца.

В этой рукописи мы демонстрируем, смешивание суспензию клеток с bioink с помощью пассивного смешивания единицы техники, что сводит к минимуму обработку и приводит к высоким клетки жизнеспособность и равномерного распределения. Эти pre-cellularized bioinks, затем используются для bioprint хряща или кожи построить с одной или двух типов клеток, соответственно, которые выращиваются на срок до 6 недель. Bioink использовали это альгината Наноцеллюлоза смесь, которая ранее показал на подложке¹пригодность.

протокол

Этот протокол соответствует руководящим принципам Комитета по этике исследований человеческого Чалмерского университета.

Примечание: Все шаги должны выполняться в стерильных биобезопасности кабинета.

1. подготовка расходных материалов, Bioink, и клетки

1. Получить две шприцы, один шприц(рис. 1) для суспензии клеток, в то время как другой шприц предназначен для bioink (рис. 1б).
2. Получения стерильной пассивной смесительного узла (рис. 1c), который может использоваться в сочетании с двойной шприцев через соединение Luer lock.
3. Получите дозирующее устройство (рис. 1d), который можно выдавливать тома из двух стерильных шприцев одновременно с контролируемой скоростью.
   Примечание: Смешивая коэффициент, используемые в данном исследовании составляет 10:1. Таким образом используйте 12 мл шприц и 1 мл шприц как предусмотрено блок смешивания 10:1.
4. Стерильные картриджа (рис. 1e) и стерильные девушки-Luer блокировки разъем непосредственно смешанной bioink и клеток подвеска в получите.
5. Получить или подготовить bioink для смешивания с суспензию клеток.
   Примечание: В настоящем Протоколе, использовался Наноцеллюлоза/альгината на основе bioink. Этот bioink сшитого путем добавления раствора стерильную 100 мм CaCl₂ после печати.
6. Отсоединить клетки, 0,5% раствором трипсина/ЭДТА и подсчитать общее количество клеток с использованием Трипановый синий исключения метод¹⁷.
   Примечание: В настоящем Протоколе, были использованы фибробластов.
7. Определите, какие плотность клеток желательно в окончательной печатной конструкции. Вычислите с помощью следующих уравнений концентрация заготовленных клеток, которые должны быть ослаблены достичь этой цели окончательный клеток плотности.
   Примечание: В настоящем Протоколе, был использован плотность окончательный клеток 5 х 10⁶ клеток/мл.
   1. Выберите нужную ячейку концентрации для экспериментов: C_клетки (клеток/мл).
   2. Рассчитайте количество bioink необходимости, V_bioink, основанный на общее количество требуемой конструкции:
      V_bioink = V,_{построить} × N_Contructs
      Примечание: К примеру, объем bioink в конструкции — 100 мкл. Если 30 конструкции печатаются, bioink объем необходимых-3 мл.
   3. Подсчитать количество ячеек необходимо:
      _Клетки N = C_клеток (1.1 × V_biolink)
   4. Ресуспензируйте клетки (_клеткиN) в 1/10^й объем bioink:
      V_{суспензию клеток} = 0.1 × V_{БиоЛинк}
      Примечание: К примеру если V_bioink = 3 мл, а затем V_{суспензию клеток} = 0.1 × 3 = 0,3 мл

2. перемешивание суспензии клеток и Bioink

1. Передача суспензию клеток в клетки подвеска шприц.
2. Передавать bioink другой шприц или получить шприц с bioink.
3. Потяните поршень шприца bioink и вставьте шприц в дозатор. Расположите устройство вертикально с Luer блокировки разъем вверх (рис. 1f1).
4. Потяните поршень шприца клетки к же длины, как bioink шприц и вставьте дозатор (f2рис. 1).
5. Придаем блок смешивания обоих шприцы путем скручивания Luer lock разъемы (Рисунок 1f3).
6. Премьер система смешивания, нажав на дозатор для выдавливания воздух в шприц. Остановите грунтовки до решения, достигнув люэровского (g4рис. 1).
7. После грунтования, прикрепите картридж наполнения до конца смесительного узла через разъем замком Luer (Рисунок 1g5). Убедитесь, что поршень в заполнение картриджа в нижней части до вложения.
8. Медленно сжимайте (Рисунок 1h6) дозирующее устройство для микширования подвеска bioink и клеток в патрон (i7рис. 1).
9. Вставьте поршень наполнения картриджа вниз с наконечником стерильные пипетки связаться смеси bioink клеток после смешивания. Держите дозирования до тех пор, пока сжаты, чтобы убедиться, что клетки/bioink смесь выдавливается не обратно в блок смешивания.
10. Крышка картриджа и осторожно нажмите на рабочей поверхности для перемещения воздушные пузыри, в верхней части картриджа (поршневые конце).
    Примечание: В этой точке, клетки/bioink смесь готова к печати. В следующих разделах будут рассматриваются конкретные приложения и печати процедуры.

3. определение жизнеспособности клеток с помощью блок смешивания, по сравнению с ручной шпатель смешивания

1. Отсоединить фибробластов (проход 7) с 0,5% раствором трипсина/ЭДТА при впадении в 80%, подсчет и Ресуспензируйте в питательной среды на достаточную плотность клеток для достижения конечной концентрации после смешивания с bioink (1:10 соотношение клеток: bioink) 5 x 10 ⁶ клеток/мл.
2. Смесь клеток в bioink, с помощью пассивного, смешивания единицы техники (шаг 2) или с помощью шпателя для оценки влияния обоих методов на жизнеспособность клеток.
3. Смесь клетки в bioink, с помощью пассивного смешивания единицы техники 1, 2, или 3 раза до розлива в форму для сшивки с помощью 100 мм₂CaCl.
   Примечание: Для выполнения дополнительные смесей, смешайте клеток/bioink непосредственно в шприц, вместо того, чтобы картриджа. Затем ремикс смесь через блок смешивания после предыдущий протокол, но без компонента шприц клеток.
4. Смесь клетки в отдельный bioink, с помощью ручной механический, смешивания через лопаточкой для длительности передачи 30, 60 или 90 s. смеси (для каждого времени перемешивания) в форму для сшивки с помощью CaCl 100 мм₂.
5. Передача образцов хорошо пластины после завершения cross-linking и культуры при стандартных условиях.
6. После 1 дня культуры, мыть конструкции (n = 3-4 в группе) в среде культуры клеток сыворотки бесплатно 30 мин запятнать клетки в конструкции с окрашивание раствора (4 мкм Флуорексон AM, 1 мкм Ethidium Антуану-1) за 30 мин.
   1. Вымойте еще два раза и Проинкубируйте образцы в сыворотки свободных клеток питательной среды для в общей сложности 1 ч при 37 ° C.

Передача образцов изображений решение живой клетки.

Получение изображений через цифровой цветной камеры при 10-кратном с помощью инвертированного микроскопа с FITC и Техас красный фильтры и анализировать с помощью программного обеспечения для анализа изображений.

Случайным образом выберите три изображения из каждой конструкции для количественной оценки жизнеспособности клеток.

Вычислите жизнеспособности, основанные на соотношении живых клеток на общее количество клеток. Анализ данных через односторонний дисперсионный анализ, следуют Тьюки множественные сравнения теста.

4. подложке хряща аналогов с типом одну ячейку

1. Нарисуйте 3D модель желаемого ткани Аналоговый. Преобразовать в файл Gcode для подложке и загрузить файл Gcode на bioprinter¹.
   Примечание: В настоящем Протоколе, квадратный структуры с размеры 4,8 х 4,8 х 0,9 мм³ было экспортировано как файл STL. Gcode файл был создан решетки структуры, используя следующие параметры: толщина слоя, 0,3 мм; шаблон заполнения, прямолинейные; плотность заполнения, 25%; скорость, 10 мм/сек.
2. Изолировать и криоконсервировать первичного человеческого носа хондроцитов (hNC) от пациентов после указанный протокол¹.
3. Размораживание и расширять криоконсервированных hNCs и расширять один раз в монослойном культивировании с использованием стандартных питательной среды на 37 ° C. Отсоединить клетки при впадении в 80-90% с 0,5% раствором трипсина/ЭДТА и рассчитывать, с помощью протокола Трипановый синий исключения. Все эксперименты проводились с использованием hNCs Пассаж 2.
4. Ресуспензируйте hNCs на 100 х 10⁶ клеток/мл в течение 300 мкл питательной среды, дополненная плода бычьим сывороточным 10%, 1% пенициллин стрептомицином и аскорбиновой кислоты 50 мкг/мл, в рамках подготовки к смешиванию с bioink.
5. Смесь hNC суспензию клеток в Наноцеллюлоза/альгината на основе bioink следующие пассивного смешивания протокол блока в соотношении 10:1 bioink:cell подвеска для получения окончательного клетки концентрация 9 х 10⁶ клеток/мл.
6. Убедитесь, что bioprinter обеззараживается через воздействие УФ лучей и уничтожить вниз с 70% этиловом спирте. Поддерживайте стерильность, поместив в поток Ламинарный шкаф.
7. Придаем стерильные сопла печати картриджи, содержащие смеси подвеска bioink/клеток и вставьте в bioprinter.
8. Калибровка bioprinter вручную или протоколы, относящиеся к принтеру.
9. Bioprint решетка структурированные, клетки Ладена конструкций, с использованием следующих параметров печати: 25G Конусный наконечник при давлении 25 кПа. Bioprint клетки свободной конструкции (смешивается с ячейки носитель, содержащий ячейки не) как элемент управления.
10. Перекрестные ссылки конструкции, добавляя ионных решения 100 мм CaCl₂ для 5 минут промыть конструкции и инкубировать в среде культуры в условиях стандартной культуры (5% CO₂, 37 ° C и относительной влажности 95%). Измените СМИ каждый второй или третий день.
11. Сбор проб для гистологического анализа на недели 2 и 4. Пятно образцы для кляп производства с использованием Альциановый синий краситель¹⁸.

5. подложке кожи аналогов с двумя типами клеток

1. Рисовать 3D-модель желаемого ткань аналоговые и конвертировать в файл Gcode на подложке. Загрузите файл Gcode на bioprinter.
   Примечание: В настоящем Протоколе, квадратный структуры с размеры 4,8 х 4,8 х 0,9 мм³ было экспортировано как файл STL. Затем Gcode файл был создан решетки структуры, используя следующие параметры: толщина слоя, 0,3 мм; шаблон заполнения, прямолинейные; плотность заполнения, 25%; скорость, 10 мм/сек.
2. Подготовка клетки для смешивания в bioink на подложке. Для изготовления кожи аналогов были использованы два типа клеток. Типы клеток два были интегрированы в bioink и подложке.
   1. Получение первичной HDF. Сохранить эти клетки в среде DMEM роста СМИ дополнена плода бычьим сывороточным 10%, 1% пенициллин стрептомицином и аскорбиновой кислоты 50 мкг/мл. Отсоедините клетки при впадении в 80-90% с 0,5% раствором трипсина/ЭДТА и счетчика.
   2. Изолировать и криоконсервировать первичной hNC от пациентов после ссылки протокола¹. Размораживание и расширять криоконсервированных hNCs в монослойном культивировании. Отсоедините клетки при впадении в 80-90% с 0,5% раствором трипсина/ЭДТА и счетчика.
3. Ресуспензируйте обоих типов клеток на 100 х 10⁶ клеток/мл в течение роста средств массовой информации. Смешайте клеточных суспензий вместе в соотношении 1:1 для достижения окончательного общая концентрация 100 х 10⁶ клеток/мл в 300 мкл средств массовой информации.
4. Смесь суспензии клеток 50: 50 HDF и hNC в Наноцеллюлоза/альгината на основе bioink следующие пассивного смешивания протокол блока в соотношении 10:1 bioink:cell подвеска для получения окончательного клетки концентрация 9 х 10⁶ клеток/мл.
5. Убедитесь, что bioprinter обеззараживается или помещается в поток ламинарный кабинет для поддержания стерильности.
6. Придаем стерильные сопла печати картриджи, содержащие смеси подвеска bioink/клеток и вставьте в bioprinter.
7. Калибровки bioprinter либо вручную или протоколы, относящиеся к принтеру.
8. Bioprint решетка структурированные, клетки Ладена конструкций, с использованием следующих параметров печати: 25G Конусный наконечник при давлении 25 кПа. Bioprint клетки свободной конструкции (смешивается с ячейки носитель, содержащий ячейки не) как элемент управления.
9. Перекрестные ссылки конструкции, добавляя ионных решения 100 мм CaCl₂ для 5 минут промыть конструкции и инкубировать в среде культуры в условиях стандартной культуры (5% CO₂, 37 ° C и относительной влажности 95%). Измените СМИ каждый второй или третий день.
10. Сбор проб для гистологического анализа на недели 2 и 4. Пятно образцы для коллагена я производства с использованием Masson trichrome пятно¹⁹.

Результаты

Результаты в этой рукописи разделены на две секции. Во-первых жизнеспособность клеток был проанализирован после смешивания с механическим способом или пассивной смесительного узла. Далее хрящей и кожи конструкции были культивировали и проанализированы соответствующие гистологические маркеров.

Распределения клеток появился однородных в обоих случаях. Однако действия смешивания вручную, с помощью шпателя (рис. 2b) имеет больше дисперсию, чем смешивания с пассивным смесительного узла(рисунок 2). Степень, скорость и смешивания технику с помощью шпателя сильно зависит от пользователя. Однако смешивая клетки в bioink с пассивным блок смешивания стандартизирует смешивания и сводит к минимуму различия между партиями. Кроме того, 30, 60 и 90 s смешивания время мая не будет достаточно для смешивания большое количество клеток в большое количество bioink. Может потребоваться более тщательного смешивания путем смешивания с помощью шпателя. В сравнении лучше используя пассивная смесительного узла поддерживает смешивание соотношение клеток к bioink во время смешивания и обеспечивает выполнение равномерного смешивания. Кроме того образец потеря является проблемой с традиционными методами смешивая где bioink можно оставить в Петри, трубы и смешивания средства из-за их высокой вязкости. Жизнеспособность клеток был высоким для смешивания с блоком смешивания (> 90%) 1, 2 или 3 раза. Когда пассивная смесительного узла использовался, смешивания занимает около 1 мин медленными темпами устойчивый смешивания. В то время как смешивания с помощью шпателя выставлены высокой жизнеспособности после перемешивания в течение 30-60 сек, больше чем 90 s смешивания привело к значительному уменьшению жизнеспособности, по сравнению с другими группами (77,9 ± 14%, p < 0,05) (рис. 2c). Это может быть из-за чрезмерного смешивания, что приводит к повреждению клеток. Долгосрочный жить/мертвые пятная после 14 дней и 28 дней культуры показан дополнительный рисунок1. Клетки начинают распространять день 14 и весьма распространенном день 28, указывают хорошая жизнеспособность.

После культуры хрящей и кожи ткани аналоги были проанализированы через гистологии. Анализ конструкций хряща на 0, 14 и 28 дней показывает увеличение количества и сферы охвата приколов как показано через Альциановый синий краситель (рис. 3a-3_c). Отсутствие пятно заметили в день 0, в то время как в день 14 пятнать ограничивается местах проксимальнее клетки. Однако в день 28 культуры, Альциановый синий встречается по всей конструкции, демонстрируя формирования chondrocytic ECM. Bioprinted кожи конструкции были проанализированы через гистологические пятнать коллагена я используя Masson Trichrome пятно (Рисунок 3d-3f). Подобно конструкции хряща, день 0 образцы выставлены не коллаген осаждения. На 14 день культуры были отмечены значительные запасы коллагена вокруг ячеек и вдоль поверхности конструкции. Это было еще более усиливается день 28, как плотные коллаген слои были обнаружены на поверхности конструкции и в основную.

Рисунок 1 : Пассивное устройство система смешивания. () 1 мл шприц для суспензии клеток, (b) 12 мл шприц с bioink, (c) дозирующее устройство, пассивный смесительного узла (d), (e) заполнение картриджей, (f) Ассамблея bioink шприц (1) и клеток подвеска шприца (2) в дозатор, вложение пассивной смесительного блока в конец шприцы (3), (g) привязанности самки-Luer блокировки разъем (4) и вложение заправки картриджа (5) завершает Ассамблеи, (h ) сжимать дозатор премьер смесительного устройства (6), (я) продолжать толкать вниз на дозатор перемешать суспензию клеток с bioink и обойтись в заправки картриджа (7). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 : Сотовый жизнеспособности изображений и анализ. Представитель изображения показаны живые (зеленый) и мертвых (красный) фибробластов после смешивания с пассивной, смешивая блок 1, 2 или 3 раза () или шпателем на 30, 60 или 90 секунд (b) и 3D культуры за 1 день. Показываются изображения при 4-кратном. Масштаб полоски указывают 200 µm. (c) процент средняя жизнеспособности человека фибробластов после смешивания с пассивной, смешивая блок или шпателем и 3D культуры за 1 день. Планки погрешностей показывают стандартное отклонение от среднего, * 0,005. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: ткани конкретных внеклеточной матрицы осаждения. Bioprinted хряща конструкции витражи для гликозаминогликанов, используя Альциановый синий в () день 0, (b) 14 и (c) 28. Изображения, снятые на 5 X увеличение. Bioprinted кожи конструкции витражи для коллагена я использую день 0, (e) 14, Массон в Trichrome (d) и (f) 28. Изображения, снятые на 5 X увеличение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительные рисунок 1: жизнеспособность клеток в день 14 () и день 28 (b). Линейки шкалы составляет 200 мкм, зеленый относится к живой клетки, красный относится к мертвых клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Как показано в этой рукописи, pre-cellularized bioinks были bioprinted для изготовления либо хряща или кожи аналогов, которые были культивированный на срок до 4 недель. Жизнеспособность клеток после смешивания с помощью пассивного смешивания единицы техники был выше, чем традиционные методы, смешивая. Кроме того упрощение процесса наложения с использованием блок смешивания минимизирует количество обработки шагов и позволяет лучше последовательности в степень смешивания. В конечном итоге это приводит к лучшей воспроизводимости в обеих клеток распределения в рамках bioink и по всей конструкции и экспериментальных групп. Осаждения ткани отдельных компонентов ECM как приколами и коллаген я наблюдалась для хрящей и кожи аналогов, соответственно после 4 недель культуры. Это показывает гибкость смешивания техники и выбранной конструкции геометрии для изготовления различных тканей цели. Изготовление хрящей и кожи аналогов выставлены гибкость использования bioink Наноцеллюлоза альгинат и подложке технику для целей различных инженерных ткани. Мы будем обсуждать два компонента исследования ниже: (1 пассивный смешивания единицы техники и (2) поведение клеток в пределах хрящей и кожи аналогов.

Разработка и оптимизация техники для смешивания суспензию клеток в bioink имеет первостепенное значение для изготовления этих конструкций. В отличие от традиционных низкой вязкости гидрогелевых материалов высокая вязкость bioinks привели к трудности в pre-cellularization bioink до печати. Как альтернатива традиционным методом включения клеток в bioink протокол для смешивания одношаговый суспензию клеток в вязких bioink разработан и обсужден. Кроме того была проведена оценка практического применения этой техники смешивания в изготовление ткани конструкций. Это Одношаговая смешивания подход имеет несколько преимуществ перед традиционными смешивая методы включали контролируемых смешивая коэффициент, минимизация высокого и нерегулярных касательные напряжения, и закрытой системы для устранения образца закрыть в сосуды смешения. Однако есть несколько важных шагов в этой технике для обеспечения его преимущества перед традиционными методами для смешивания клеток/bioink. Крайне важно обеспечить что ячейки в ячейку шприц приостановлено и хорошо перемешивается до смешивания. Слишком большой разрыв во времени между подъема и переноса клеток в шприц и начала процесса перемешивания может вызвать клетки осадок, который приведет к неравномерным смешивания и распределение в печатной накаливания. Если седиментации наблюдаемых, простой инверсии (2 - 3 раза) пассивной смешивая блок Ассамблея немедленно до смешивания достаточно Ресуспензируйте клетки и обеспечить равномерное распределение до смешивания. Важно также, что воздушные пузыри в шприцы устраняются или свернут ранее для обеспечения что смешивания соотношение остается неизменным. Если в bioink картридж до смешивания остались большие воздушные пузыри, рекомендуется, что решение будет выполняться через блок смешивания дополнительное время для обеспечения тщательного перемешивания. Если остаться пузырьки воздуха, нежный стук печати картридж/шприц может вытеснять остаточного воздушных пузырьков. Кроме того если несколько материала смешивания (несколько смешивания единиц или материалы) необходим для более сложных конструкций, концентрации bioinks/клеточных суспензий смешивать должна быть скорректирована с обеспечить после разбавления путем смешивания, соответствующие конечная концентрация по-прежнему достигается.

По сравнению с другими смешивания техники пассивный смешивания единицей является новый подход к cellularize bioinks. В отличие от других смешивая методы, такие как двойной шприц смешивания или перемешивания с помощью шпателя или другой инструмент пассивный блок смешивания позволяет большую последовательность в смешивании различных серий и пользователей. Характер ручного смешивания методов, таких как смешивание шпатель, приводит к большей пользователей вариации на масштабы и темпы перемешивания. Кроме того закрытых систем, таких как пассивный, смешивая блок и двойного шприца смешивания имеют мало не образец потери, по сравнению с ручной перемешивания в чашке Петри или трубки.

Обе ткани аналоги, изготовленный в этой рукописи состоял из одного типа bioink и одной или двух типов клеток. Однако подложке ткани аналоги, которые состоят из архитектур, которые содержат регионы отдельных bioinks с типы отдельных клеток могут быть необходимы для изготовления более физиологических ткани конструкций^{20,21, 22}. Более специализированных bioinks с уникальной композиции или функции могут быть созданы путем смешивания нескольких типов существующих bioinks вместе, чтобы создать multimaterial bioinks, которые имеют различные композиции или функций в^{23, 24}. Это может быть особенно важным в ткани перехода регионов такие, как кожи подкожный слой или хряща костей региона ткани где градиент bioink состав^25,26 могут быть необходимыми для обеспечения развития Эти критические регионы в родной тканях²⁷. Кроме того блок смешивания может использоваться сочетание факторов роста и morphogens в bioinks до подложке. Ликвидация образца потеря с закрытой системой смешивания является привлекательным для использования дорогих и низкой концентрации биоактивных факторов, где образца потеря может привести к изменению их конечная концентрация в bioprinted конструкции, особенно когда градиенты участвуют.

Ограничение с любого смешивания техники, в том числе пассивного смешивания единицы, используемые в этом исследовании, является риск повреждения механически чувствительных клеток. Например, изолированные стволовые клетки таких те из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток костного мозга или эмбриона более подвержены механическим повреждениям^28,29. Закон смешения придает аномальные механических напряжений на клетки из-за сдвига сил, участвующих в процессе перемешивания, и они должны быть сбалансированы для сохранения жизнеспособности³⁰. В то время как использование первичных фибробластов и хрящевые клетки в этом исследовании привело к хорошо жизнеспособности (рис. 2), больше исследования необходимы для определения безопасной смешивания ставки и коэффициенты для более чувствительных типов клеток. До тех пор то рекомендуется, что смешивание выполняются устойчивый медленный темп увеличить жизнеспособности. Кроме того плотность ячеек, выбранных в этом исследовании был определен на основе предыдущих исследований¹. Эта плотность ячеек не могут быть идеально подходит для всех типов клеток.В частности наложение ячеек в более высокой концентрации может привести к увеличению ячеек контактов, которые могут улучшить жизнеспособность клеток и тканей формирования^31,32. В том же ключе пассивный смесительного узла могут быть применимы к смешивания сфероидов клетки или другие агрегаты клеток³³ bioinks.

Как предложил и продемонстрировал в этом исследовании, пассивным блок система смешивания можно быстро смесь суспензии клеток в вязких bioink. Хотя по-прежнему остается риск для механического повреждения клеток, такой подход позволяет большей последовательности в смешивание в одном исследовании и пользователей. Pre-cellularized bioinks, использование этого подхода были использованы для изготовить оба хрящей и кожи аналогов, которые культивировали на срок до 4 недель и продемонстрировал осаждения ткани конкретных ECM маркеров. Будущие исследования будут сосредоточены на использовании пассивной смешивания Сплит системы в смеси специализированные bioinks от стандартизированных bioinks для изготовления более сложные ткани аналоги.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
STARTINK Kit	CELLINK	SK0001	Kit that contained all the elements for the CELLMIXER procedure
Live/Dead Kit	Life Technologies	L3224	Kit for the analysis of cell viability after mixing
Masson's Trichrome	Sigma Aldrich	HT15-1KT	Kit for the analysis of collagen I deposition in the skin constructs
Alcian Blue	Sigma Aldrich	B8438-250ML	Kit for the analysis of glycosaminoglycan deposition in the skin constructs
INKREDIBLE+ bioprinter	CELLINK	Gen1+	Printer utilized in the study
DMEM with Glutamax	Thermofisher	10566016	Media for culture of the cells
10% fetal bovine serum	Thermofisher	A3160402	Media supplement
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15070063	Media supplement
live cell imaging solution	thermofisher	A14291DJ	component utilized using live/dead imaging
inverted microscope	Olympus	IX73	microscope utilized
a digital color camera	Olympus	XC10	microscope camera utilized
cellSens imaging software	Olympus	n/a	stock software with the microscope
ImageJ	NIH	n/a	open source image analysis software
GraphPad Prism 7	GraphPad	n/a	software for statistical analysis
Slic3r software (v1.2.9)	Slic3r	n/a	open-source software to convert .stl file to gcode
primary adult human dermal fibroblasts	ATCC	PCS-201-012	cell source for fibroblasts