أسلوب ثقافة بديلة للحفاظ على هيبوميثيليشن الجينية للخلايا الجذعية الجنينية الماوس باستخدام مجاهدي خلق مثبطات PD0325901 وفيتامين (ج)

Summary

وصفت لنا بالتفصيل البروتوكولين على أساس المادة الكيميائية لاستزراع الخلايا الجذعية الجنينية الماوس. ويستخدم هذا الأسلوب الجديد التآزري آليات تعزيز أكسدة تيت بوساطة (بفيتامين ج) وقمع حيثياته توليف 5-ميثيلسيتوسيني (حسب PD0325901) للحفاظ على الحمض النووي هيبوميثيليشن وبلوريبوتينسي من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس.

Abstract

الخلايا الجذعية الجنينية (ES) لديها القدرة على التفريق بين أي من الطبقات الجرثومية الثلاث (الأنسجة أو ميسوديرم أو الأديم الظاهر)، ويمكن أن تولد الكثير من الأنساب للطب التجديدي. وفاق خلية الثقافة في المختبر منذ أمد بعيد موضوع مخاوف على نطاق واسع. تقليديا، يتم الاحتفاظ بالماوس دإط الخلايا في مصل الدم وسرطان الدم من العوامل المثبطة (LIF)-التي تحتوي على المتوسط. بيد تحت ظروف المصل/ليف، الخلايا إظهار عدم التجانس في التشكل والتشكيل الجانبي لتعبير الجينات المتعلقة بلوريبوتينسي، وهي في معظمها في دولة يتواجد. وعلاوة على ذلك، مثقف دإط الخلايا معرض هايبرميثيليشن العالمي، ولكن السذاجة دإط الخلايا من كتلة الخلايا الداخلية (ICM) والخلايا الجرثومية الأساسية (بجكس) في حالة من هيبوميثيليشن العالمية. الدولة هيبوميثيلاتيد ICM وبجكس يرتبط ارتباطاً وثيقا بما بلوريبوتينسي. لتحسين أساليب الثقافة الخلية الماوس دإط، وضعنا مؤخرا طريقة جديدة على أساس استخدام مجتمعة بشكل انتقائي من المركبين جزيء صغير للحفاظ على الدولة هيبوميثيلاتيد و pluripotent في الحمض النووي. هنا، نقدم هذا العلاج المشارك من فيتامين ج (Vc)، ويمكن محو PD0325901 حوالي 90 في المائة من 5-ميثيلسيتوسيني (5mC) في 5 أيام في الماوس دإط الخلايا. المحتوى الذي تم إنشاؤه 5mC يماثل في بجكس. آليا إلى التحقيق يظهر أن PD0325901 أعلى-وينظم التعبير Prdm14 لقمع Dnmt3b (دي نوفو الحمض النووي ميثيلترانسفيراسي) و Dnmt3l (مساعد Dnmt3b)، بخفض التوليف 5mC دي نوفو . Vc يسهل تحويل 5mC إلى 5-هيدروكسيميثيلسيتوسيني (5hmC) تحفزها أساسا Tet1 و Tet2، التي تشير إلى تورط ديميثيليشنز الحمض النووي السلبي والإيجابي على حد سواء. وعلاوة على ذلك، تظهر الماوس دإط الخلايا تحت ظروف Vc/PD0325901، مورفولوجيا متجانسة والدولة pluripotent. جماعياً، نقترح الرواية والأسلوب الثقافة الكيميائية-التآزر لتحقيق هيبوميثيليشن الحمض النووي والحفاظ على بلوريبوتينسي في خلايا الفأر ES. طريقة كيميائية تعتمد على جزيء صغير ويتغلب على أوجه القصور الرئيسية في الثقافة المصل، ويحمل وعدا بتوليد خلايا ES متجانسة لمزيد من التطبيقات السريرية، والأبحاث.

Introduction

دإط الخلايا نشأت من ICM من الكيسة¹. في حالة بلوريبوتينسي الخلايا ويمكن أن تشكل جميع الأنساب الجسدية و خلايا germline². إنشاء خلايا ES يوفر الفرصة للتحقيق في تطوير العمليات في المختبر ويمكن أن تولد خلايا ذات الأهمية الطبية للطب التجديدي استناداً على بلوريبوتينسي³.

إنشاء فريقين يحملني خطوط الخلايا الماوس وفاق في عام 1981 وعندما كانت استزراع الخلايا المشتقة من الأجنة الماوس المبكر في مصل الدم البقري الجنين (FBS)-تتضمن المتوسطة مع الخلايا الليفية الجنينية الماوس (MEFs) كتغذية طبقة^1،4 . تم إبطال ميتوتيكالي ميفس وكانت تزرع مسبقاً في الأطباق قبل استزراع خلايا ES. تقديم الدعم لمرفق خلية الماوس ES ميفس وإنتاج عوامل النمو لتعزيز نشر وقمع التمايز⁵، بينما يقدم FBS العوامل التغذوية الأساسية والهرمونات لتكاثر الخلايا. بينت الدراسات اللاحقة أن ليف تنتجها الخلايا المغذية سيتوكين رئيسي للذاتي تجديد وصيانة بلوريبوتينسي في الماوس دإط الخلايا، وإضافة ليف في المتوسط يمكن أن تكون بديلاً لتغذية الخلايا⁶. في الوقت الراهن، الاكتفاء الماوس دإط الخلايا في المتوسط FBS/ليف على مغذيات لا يزال الأسلوب القياسي اعتمده العديد من الباحثين. ومع ذلك، تنشأ بعض المشاكل مع هذا النهج الثقافة الكلاسيكية. أولاً، تغذية الخلايا تفرز عوامل الزائدة وغير المنضبط وقد يسبب التلوث المسببة للمرض⁷. لتجنب هذا التدخل، وطلاء سطح الأطباق مع الجيلاتين وإضافة ليف في المحتوية على مصل المتوسطة أساليب بديلة للحفاظ على الماوس دإط الخلايا دون تغذية طبقة الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، يحمل الماوس دإط الخلايا نمت تحت ظروف المصل/ليف المورفولوجية عدم التجانس في السكان خلية وحتى في مستوى التعبير من العوامل المتصلة بلوريبوتينسي⁸. تشير الدراسات الأخيرة إلى أن عوامل النسخ الأساسية المتصلة بلوريبوتينسي (بما في ذلك SOX2 ونانج OCT4) يمكن الحفاظ على ظروف المصل/ليف، بلوريبوتينسي عن طريق الآنف و WNT الإشارات؛ ومع ذلك، خصوصا، أنها أيضا تنشيط إشارة عامل النمو (صندوق الأجيال القادمة) تنتجها الخلايا الليفية لتحريك التمايز⁸. بسبب العمل المزدوج المتناقض لعوامل النسخ الأساسية، تقديم الماوس دإط الخلايا المستزرعة في المصل التغايرية، تتألف من السكان للتبادل اثنين، واحد مماثلة لمؤسسة أي سي أم وأخرى تشبه الدولة epiblast معبي⁸. وعلاوة على ذلك، الماوس دإط الخلايا في مصل الدم يحمل غالباً ما هايبرميثيليشن العالمي⁹، بينما ICM وبجكس في حالة هيبوميثيلاتيد عالمية، التي ترتبط ارتباطاً وثيقا بما^9،بلوريبوتينسي¹⁰.

وهناك طلب كبير لتطوير أساليب جديدة لاستزراع خلايا الفأر ES. وقد أقيمت عدة بروتوكولات تحسن منذ عام 2003¹¹ ولكن لا تزال هناك بعض القيود وأوجه القصور⁷. منذ عام 2008 بالجمع بين استخدام اثنين كيناز جزيء صغير مثبطات، PD0325901 (مثبط للبروتين المنشط mitogen كيناز (MAPK)/ينظم إشارة خارج الخلية كيناز (إيرك) (مجاهدي خلق)) و CHIR99021 (مثبطات سينثاز الجليكوجين كيناز 3 (GSK3))، في ن₂ب₂₇ المتوسطة مع الآنف ودون المصل إلى فتح آفاق جديدة للماوس تثقيف دإط الخلايا¹². هذه الوسيلة المعرفة الجديدة تتميز باستعمال مثبطات اثنين (2i). دإط الماوس الخلايا المستزرعة في المتوسط 2 طاء/ليف أكثر تجانساً في الخلية السكان والتعبير عن العوامل بلوريبوتينسي. وبالإضافة إلى ذلك، أن الماوس 2 طاء/ليف-مثقف دإط الخلايا يحمل هيبوميثيليشن الحمض النووي على الصعيد العالمي، وهو أقرب إلى الخلايا مثل ICM^9،13. ومع ذلك فقد الثقافة 2 طاء عيوبها. PD0325901 CHIR99021 غير قابلة للذوبان في الماء، وعموما يتم حله في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس])-على أساس حل الأسهم لإضافتها في الثقافة المتوسطة. وقد أظهرت الدراسات أن طويل الأجل ويمكن أن يؤدي التعرض لجرعة منخفضة من الخلايا إلى [دمس] إلى سيتوتوكسيسيتي¹⁴.

هنا، يمكننا استخدام المركبين جزيء صغير ووضع أسلوب ثقافة جديدة للماوس دإط الخلايا. الأسلوب الثقافة رواية يجمع بين المانع الرأسمالي ومجاهدي خلق PD0325901 النهوض هيبوميثيليشن الحمض النووي بسرعة وفعالية على مستوى مماثل من PGC، اسمه كبروتوكول تثقيف Vc/PD0325901. معرض التجانس في مورفولوجيا الخلايا ES الماوس في Vc/PD0325901--أضيفت المتوسطة المحتوية على مصل وهي مستمرة في حالة الأرض. بالمقارنة مع الثقافة 2 طاء، الماوس دإط الخلايا المزروعة تحت ظروف Vc/PD0325901 يحمل أسرع حركية demethylation الحمض النووي ويمكن أن تصل إلى مستوى هيبوميثيليشن مماثلة لتلك التي PGC. وبالإضافة إلى ذلك، استخدام مثبط واحد (PD0325901) يقلل كمية المدخلات [دمس] في المتوسط بالمقارنة مع تلك المستخدمة في 2i (PD0325901/CHIR99021)، ويقلل من الضرر للخلايا.

Protocol

1-الأعمال التحضيرية

1. تعد الحل من 1.0 مم PD0325901 (مثبط لمجاهدى خلق) ومم 3.0 CHIR99021 (مثبط GSK3).
   1. تزن 2 مغ PD0325901 وإضافة مل 4.15 من [دمس] في قنينة زجاج العنبر.
   2. تزن 2 مغ CHIR99021 وإضافة مل 1.43 من [دمس] في قنينة زجاج العنبر.
   3. إعادة تشكيل التالية، تخزين مختبرين (50 ميليلتر/أنبوب في أنابيب PCR ميليلتر 200) في-20 درجة مئوية، ومحمية من الضوء. إزالة أنبوب يحتوي على المخزون المجمد من الثلاجة وذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة قبل الاستعمال.
2. وزن ز 0.0176 من الاستثمار الرأسمالي في 1 مل أنبوب الطرد المركزي وإعادة تشكيل ذلك مع 1 مل الماء المعقم لتركيز 100 ملم قبل استخدامها نهائي.
3. إلغاء تنشيط FBS: احتضان 500 مل FBS في حمام مائي في 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
4. إعداد 600 مل الوسيلة الأساسية لاستزراع خلايا الفأر ES.
   1. استخدام زجاجة من دميم/ارتفاع الجلوكوز المتوسطة (500 مل) وإزالة 40 مل.
   2. الملحق 460 مل من دميم/ارتفاع الجلوكوز المتوسطة بنسبة 20% إبطال FBS (120 مل)، 1,000 ليف يو/مليلتر (60 ميليلتر من 10⁷ U/mL حل الأسهم)، 0.1 ملم غير الأحماض الأمينية الأساسية (نيا) (6 مل من محلول الأسهم 10 ملم)، بيروفات صوديوم 1 ملم (6 مل من محلول الأسهم 100 ملم) ، 2 مم L-الجلوتامين (6 مل من محلول الأسهم 200 ملم)، 0.1 مم β-mercaptoethanol (600 ميليلتر من حل الأسهم 100 ملم)، والبنسلين 33 وحدة دولية/مل و 33 ميكروغرام/مل ستربتوميسين (2 مل من البنسلين-ستربتوميسين مختلطة الحل (البنسلين 10000 وحدة دولية/مل و 10,000 ميكروغرام/مل ستربتوميسين)) . تعريف الوسيلة الأساسية كالمتوسطة المصل.
   3. "الماصة؛" 50 ميليلتر من الأسهم حل PD0325901 (1.0 مم) والرأسمالي (100 ملم)، على التوالي، إلى 50 مل الوسط المصل (التركيز النهائي: 1.0 ميكرومتر PD0325901 و 100 ميكرومتر الرأسمالي)، وتعريف المتوسطة كالمتوسطة Vc/PD0325901.
      ملاحظة: إعداد Vc/PD0325901 الطازجة المتوسطة قبل الاستخدام بسبب عدم الاستقرار في الاستثمار الرأسمالي.
   4. استخدام ماصة، نقل 50 ميليلتر من الأسهم حل PD0325901 (1.0 مم) و CHIR99021 (3.0 ملم)، على التوالي، إلى 50 مل الوسط المصل (التركيز النهائي: مكم PD0325901 1.0 و CHIR99021 3.0 ميكرومتر)، وتعريف المتوسطة متوسطة 2 طاء.
5. إعداد أطباق الجيلاتين المغلفة.
   1. إعداد الحل الجيلاتين 0.1%: حل 0.3 غرام جيلاتين إلى 300 مل من الماء عالي النقاوة في زجاجة كاشف زجاج مع غطاء وتعقيمها في اﻷوتوكﻻف في 121 درجة مئوية لتخزين 20 دقيقة الحل العقيمة في درجة حرارة الغرفة.
   2. احتضان الأطباق ثقافة الخلية (قطرها 6 سم) مع 2 مل محلول الجيلاتين 0.1% لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وثم نضح الجيلاتين. الأطباق في الهواء الجاف واستخدامها ضمن ح 12.
6. إعداد 10 مل خلية الماوس ES تجميد المتوسطة في أنبوب الطرد مركزي 15 مل: 90% FBS (9 مل) و [دمس] 10% (1 مل). استخدام المتوسط خلال يوم واحد.
7. إعداد حاوية تجميد: إضافة كحول الأيزوبروبيل 100% لخط تعبئة الحاوية التجميد، وتجاهل كحول الأيزوبروبيل القديمة. إضافة كحول الأيزوبروبيل الجديد مباشرة بعد كل استخدام الخامس.
8. جعل المخزن المؤقت الهضم الأنزيمي: تتركز تزن ز 1.2114 مسحوق تريس في 100 مل الماء عالي النقاوة لإعداد 100 مم حل تريس وإضافة حل HCl (حوالي 12 م) إلى الحل تريس لضبط درجة الحموضة إلى 7.6 (حوالي 0.6 مل من محلول HCl مركزة).
9. إعداد 50 مل من إذاعة إيمونوبريسيبيتيشن الإنزيم المخزن المؤقت (المعهد الملكي العازلة): 20 مم تريس، درجة الحموضة 7.4، 1 مم مجكل₂، 150 مم كلوريد الصوديوم، الجلسرين 20%، 0.5% NP40، يدتا ملم 1، 1 مم عطا. الملحق مع 1 مم DTT، 1 X مثبط البروتياز كوكتيل و 1 مم بمسف قبل الاستخدام. حالما تتم إضافة بمسف، استخدام المخزن المؤقت خلال 30 دقيقة.

2-تنمو خلايا ES الماوس على الأطباق المغلفة بالجيلاتين

1. الماوس قبل الحارة دإط الخلايا (نوع البرية، سفيف 129) الثقافة المتوسطة، التربسين، والحل الفوسفات مخزنة (PBS) في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
2. مرور الخلايا. نضح المتوسطة تماما من صحن وماصة 2 مل من برنامج تلفزيوني للاطباق شطف الخلايا.
   1. إزالة برنامج تلفزيوني مع ماصة وغسل الخلايا مرة أخرى مع 2 مل من برنامج تلفزيوني.
   2. إزالة برنامج تلفزيوني وأضف 0.3 مل التربسين-يدتا (0.25%) لكل طبق.
   3. تغطية الطبق كله مع التربسين سرعة وقم بإزالته فورا.
   4. وضع الطبق في حاضنة في 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة لفصل الخلايا من الطبق. تأخذ بها الأطباق من الحاضنة وإضافة 2 مل من المصل قبل حرارة متوسطة إنهاء عمل التربسين.
   5. ننأى مستعمرات الخلايا في تعليق خلية واحدة من ريسوسبيندينج مع ماصة (نصيحة ماصة 5 مل) 10 مرات.
3. نقل 150 ميليلتر من 2 مل الحل خلية (خلايا حوالي 190,000 عن طريق العد مع هيموسيتوميتير) إلى طبق المغلفة بالجيلاتين جديد، وتكمل مع 3 مل من تقدم طازجة Vc/PD0325901 المتوسطة الواحدة وطبق الثقافة 6 سم. ثقافة الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5% CO₂.
4. كل 24 ساعة في حين تفرخ، إزالة المتوسطة الثقافة القديمة وإضافة 3 مل من الطازجة Vc/PD0325901-متوسطة في الطبق الثقافة بسبب عدم استقرار كونفلوينسي Vc-تتوقع 70-80% بعد 2-3 أيام.
5. بعد أن وصلت إلى كونفلوينسي 70-80%، مرور الخلايا وتواصل الثقافة لهم كما هو موضح في الخطوات 2.2-2.4.

3-تجميد وإذابة خلايا ES الماوس

1. تجميد الماوس دإط الخلايا.
   1. فصل الخلايا من الأطباق مع التربسين خطوة بعد 2.2.
   2. نقل الخلايا إلى أنبوب بلاستيكي 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 800 × ز ودرجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
   3. تفريغ المادة طافية برفق في كوب وريسوسبيند بيليه الخلية مع 1 مل من طازجة متوسطة التجميد. إعداد تجميد متوسطة 30 دقيقة قبل هذه الخطوة للتأكد من درجة حرارة الغرفة قبل الاستعمال.
   4. نقل الخلايا في تجميد المتوسطة إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.8 مل مع ماصة 1 مل ووضع أنبوب ميكروسينتريفوجي في حاوية تجميد. إضافة كحول الأيزوبروبيل إلى خط تعبئة الحاوية التجميد ويبقيه في درجة حرارة الغرفة قبل استخدامها.
   5. ترك في حاويات تجميد بين عشية وضحاها في ثلاجة-80 درجة مئوية.
   6. نقل أنابيب ميكروسينتريفوجي إلى حاوية نيتروجين سائل لمدة تصل إلى 2-3 سنوات.
      ملاحظة: التي عدم إبقاء الخلايا في الأجلين المتوسط والتجميد لفترة طويلة الوقت وسرعة نقل الخلايا إلى ثلاجة-80 درجة مئوية بسبب السمية [دمس].
2. ذوبان الجليد الماوس دإط الخلايا.
   1. قبل دافئ 50 مل من المصل المتوسطة في حمام مائي 37 درجة مئوية.
   2. أخرج قنينة تحتوي على خلية من الحاوية النتروجين السائل وتزج القنينة توج في حمام مائي 37 درجة مئوية. اهتز بسرعة في حمام الماء لإذابة الجليد. نقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل مع ماصة 1 مل. إضافة 2 مل من المصل قبل حرارة الثقافة المتوسطة في الأنبوب تمييع المتوسطة التجميد والطرد المركزي ثم ز 800 x ودرجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
   3. إزالة المادة طافية ولطف ريسوسبيند الكريات الخلية مع 3 مل من الطازجة المتوسطة Vc/PD0325901 استخدام ماصة 5 مل.
   4. نقل الخلايا من أنبوب 15 مل إلى طبق المغلفة بالجيلاتين والثقافة الخلايا الخاصة بحاء 24 ثقافة الخلايا مرة أخرى كما هو موضح في الخطوة 2.

4-استخراج البروتين الكلي من خلايا

1. شطف الخلايا التي تم جمعها مع 1 مل من برنامج تلفزيوني والطرد المركزي ثم ز 800 x ودرجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
2. نضح المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية دقة مع المخزن المؤقت ريبا تكملها مع DTT ومثبط البروتياز كوكتيل بمسف بيبيتينج برفق. حجم المخزن المؤقت للمعهد الملكي هو حوالي 5 س أن الخلية بيليه.
   ملاحظة: القيام باستثارة الخلية على الجليد.
3. إبقاء الخلايا في المخزن المؤقت للمعهد الملكي لمدة 30 دقيقة على الجليد وأجهزة الطرد المركزي في 13,000 س ز و 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
4. نقل المادة طافية إلى أنبوب جديد وتخزين مختبرين في-80 درجة مئوية.
5. تحديد تركيز البروتين مع مجموعة مقايسة بروتين برادفورد.

5-استخراج الحمض النووي من الخلايا وهضم الحمض النووي إلى نوكليوزيد واحد استخدام الإنزيمات

1. جمع الخلايا مع التربسين كما هو موضح في الخطوات 3.1.1 و 3.1.2.
2. القيام باستخراج الحمض النووي مع مجموعة تنقية الحمض النووي جينومي اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
3. تخزين الحمض النووي المستخرج في أنابيب الطرد المركزي 1 مل. إضافة 100 ميليلتر من الماء عالي النقاوة في أنبوب الطرد المركزي، ويحل الحمض النووي من بيبيتينج حوالي 15 مرة. تحديد التركيز وتقييم نوعية الحمض النووي بقياس امتصاص في 260 شمال البحر الأبيض المتوسط، و شمال البحر الأبيض المتوسط 280¹⁵. تركيز الحمض النووي حوالي 500 نانوغرام/ميليلتر.
4. خلاصة 5 ميكروغرام من الحمض النووي في نظام حل 50 ميليلتر: إضافة 5 ميليلتر من 100 مم حل تريس-HCl، ودرجة الحموضة 7.6 (التركيز النهائي: 10 ملم)، 2 يو العجل الفوسفاتيز المعوية، 1 يو الدناز الأول، 0.005 يو ثعبان فوسفوديستريس السم الأول، و 5 ميكروغرام من الحمض النووي (حساب حجم المضافة وفقا قنينة تركيز الحمض النووي أحمر، ~ 10 ميليلتر) إلى أنبوب الطرد المركزي وزيادة حجم الحل إلى 50 ميليلتر ماء عالي النقاوة. احتضان هذا الخليط في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. الطرد المركزي الحل الحمض النووي هضمها 1,000 ز ودرجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة لجمع الحل إلى الجزء السفلي من الأنابيب.
5. نقل الحل الحمض النووي هضمها من أنابيب الطرد المركزي في أنابيب الترشيح الترا (وزن جزيء استقطاع: كاتشين 3) وأجهزة الطرد المركزي في 13,000 g و 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لإزالة الإنزيمات الهضم.
6. إعداد العينات لتحليل 5mC و 5hmC.
   1. لتحليل 5hmC: ميليلتر بيبيت 36 حل تصفية لأجهزة الطرد مركزي جديدة أنبوب (1 مل) وإضافة 4 ميليلتر من 5 '-(hydroxymethyl-d₃)-2-ديوكسيسيتيديني ([د₃]-5hmC) بتركيز نهائي 3 نانومتر.
   2. لتحليل 5mC: إضافة 196 ميليلتر الماء عالي النقاوة في أنبوب الطرد مركزي جديدة وبيبيت 4 ميليلتر لتصفية حل للأنبوبة (تخفيف 50-fold)، بسبب كثافة عالية من 5mC في الحمض النووي. نقل ميليلتر 36 الحل المخفف لأنبوب الطرد مركزي جديدة وإضافة 4 ميليلتر من (5 '-(methyl-d₃)-2-ديوكسيسيتيديني ([د₃]-5mC) مع تركيز النهائي من 50 نانومتر. استخدام [د₃]-5hmC و [د₃]-5mC كمعيار الداخلية لمعايرة 5hmC و 5mC، على التوالي.
7. نقل الحل عينة لأنابيب قياس وتخزينها في 4 درجات مئوية. تحليل 5mC و 5hmC مع الرباعي ثلاثية اللوني السائل فائقة الأداء الكتلي مع رصد رد فعل متعددة (أوهبلك-MS/MS (MRM)) كما هو موضح في تقرير سابق¹⁵.

6-تحليل 5mC و 5hmC باستخدام أوهبلك-MS/MS¹⁵

1. إعداد معلمات مختلفة لتحليل 5mC و 5hmC باستخدام برنامج أوهبلك--مرض التصلب العصبي المتعدد.
   1. إنشاء أسلوب جديد. افتح البرنامج وانقر فوق "ملف | جديد | أسلوب ". معرض مربع الرسالة من "محرر أسلوب" محتوى "هل تريد حفظ التغييرات للأسلوب الحالي"، وانقر فوق "لا".
   2. بناء المعلمات لأخذ العينات. انقر فوق "العينات | الإعداد | حقن ". حدد "حقن القياسية" وإدخال "5 ميليلتر في حقن وحدة التخزين".
   3. بناء بارامترات المضخة في أوهبلك.
      1. انقر فوق "BinPump2 | الإعداد "لبناء معالم المضخة. إعداد "تدفق" في "0.25 مل/دقيقة" و "وقف الوقت" في "15 دقيقة".
      2. قم بإعداد "المذيب ب 5%" و "حدود الضغط" في "ماكس 600 بار".
      3. انقر فوق "BinPump2 | الجدول الزمني "لبناء إيسوكراتيك معلمات شطف لتحليل 5mC. انقر فوق "إلحاق" لإضافة صف. إدخال "0.00" في "وقت" و "5.0" في "ب %". انقر فوق "إلحاق" مرة أخرى لإضافة صف جديد. إدخال "15.00" في "وقت" و "5.0" في "ب %".
      4. انقر فوق "BinPump2 | الجدول الزمني "لبناء المعلمات شطف التدرج لتحليل 5hmC. انقر فوق "إلحاق إضافة صف. إدخال 0.00 في الوقت و 5.0 "ب %". انقر فوق "إلحاق" مرة أخرى لإضافة صف جديد. إدخال "3.00" في "وقت" و "5.0" في "ب %". انقر فوق "إلحاق" لآخر 6 مرات لإضافة الصفوف 6. إدخال "3.01" في "وقت" و "15.0" "% ب"، "6.00" في "وقت" و "15.0" "% ب"، "6.01" في "وقت" و "100" في "ب %"، "10.00" في "وقت" و "100.0" "% ب"، "10.01" في "وقت" و "5.0" في "ب %"، "15.00" في "وقت" و "5.0" في "ب %" في تسلسل.
         ملاحظة: إجراء تحليل 5mC و 5hmC على حدة نظراً للظروف فصل مختلف من أوهبلك.
   4. بناء المعلمات من درجة حرارة المقصورة العمود (TCC) في أوهبلك.
      انقر فوق "TCC | الإعداد | درجة الحرارة (يسار) "وإدخال" 30 درجة مئوية ".
   5. إنشاء معلمات ققق-MS/MS.
      1. انقر فوق "MS ققق | إيقاف الوقت | لا حدود/كمضخة "،" مصدر أيون | أي إس أي "،" تصفية وقت | العرض الأقصى: 0.07 دقيقة ". قم بإعداد "وقت شرائح: وقت البدء: 0"؛ "تفحص نوع: الآلية"؛ "القيمة Div: لمرض التصلب العصبي المتعدد"؛ "دلتا EMV (+): 200" و "دلتا EMV (-): 0".
      2. بناء المعلمات لرصد التحولات 5mC، د₃-5mC، العاصمة، 5hmC، ودال-₃-5hmC
         1. انقر فوق "MS ققق | اكتساب | مسح الشرائح: يسكن: "90"؛ "فراجمينتور: 90"؛ "الطاقة الاصطدام: 5"؛ "الخلية الجهد المسرع: 4" و "الأقطاب: إيجابية".
         2. إدخال "5mC" في مجمع "الاسم"، "242" على السلائف "أيون"، "126" في "أيون المنتج" لتحليل 5mC. انقر فوق الزر الأيمن وحدد "إضافة صف" لإضافة صف جديد. إدخال "د₃-5mC" في مجمع "الاسم"، "245" على السلائف "أيون"، "129" في "أيون المنتج" لمد₃-تحليل 5mC.
         3. الملحق آخر ثلاثة صفوف باستخدام نفس الأسلوب. إدخال "دي سي" في مجمع "الاسم"، "228" على السلائف "أيون"، "112" في "أيون المنتج" لتحليل dC. إدخال "5hmC" في مجمع "الاسم"، "258" على السلائف "أيون"، "142" في "أيون المنتج" لتحليل 5hmC. مدخل د₃-5hmC في "اسم مركب"، "261" على السلائف "أيون"، "145" في "أيون المنتج" لمد₃-تحليل 5hmC.
      3. بناء معلمات مصدر الغاز. انقر فوق "MS ققق | مصدر | المصدر المعلمات: Temp الغاز: 300 درجة مئوية "؛ "تدفق الغاز: 11 لتر في الدقيقة"؛ "البخاخات: 15 رطل/بوصة مربعة"؛ "إيجابية-الشعرية: 3500 الخامس".
      4. حفظ الأسلوب المقترح. انقر فوق "MS ققق | أداة | حفظ الأسلوب ك ". حدد مساراً للطريقة المقترحة من "الدليل"، وإعطاء اسم للأسلوب عن طريق إدخال المحتوى في "أسلوب"، على سبيل المثال: تحليل 5mC و 5hmC.
2. الفصل أوهبلك وتحليل MS/MS مونونوكليوسيديس
   1. التحضير لمرحلة الجوال ل 5mC والسيتوزين (ج) التحليل: تشكل المرحلة المتنقلة من الحل أ وب الحل ج: 500 مل من الماء عالي النقاوة مع 500 ميليلتر من حمض الفورميك (التركيز النهائي: 0.1%)، والحل ب: 500 مل من الميثانول 100%. مزيج الحل A و B في نمط (الخامس: الخامس) كمرحلة المتنقلة الوت 5mC وجيم (تعيين في الخطوة 6.1.3.3). تعيين معدل التدفق في 0.25 مل/دقيقة (تعيين في الخطوة 6.1.3.1).
   2. التحضير لمرحلة الجوال بالمذيبات A و B لتحليل 5hmC. المذيبات 2.0 مم NH₄HCO₃ محلول مائي (pH 9.0) (500 مل)، وهو مذيب ب 100 ٪ الميثانول (500 مل). 5hmC منفصلة شطف تدرج أمثل: 0-3 دقيقة، ب 5.0 في المائة و 95 في المائة (الخامس: الخامس)؛ 3-6 دقيقة، 15.0% ب و 85% A؛ 6-10 دقيقة، 100% ب؛ 10-15 دقيقة، 5.0% ب و 95% A (تعيين في الخطوة 6.1.3.4). تعيين معدل التدفق في 0.25 مل/دقيقة (تعيين في الخطوة 6.1.3.1).
3. استخدام اليكتروسبراي MS/MS مع وضع إليه الرصد والإبلاغ (تعيين في الخطوة 6.1.5.1) لتحليل شطف من العمود وتعتمد طريقة أيون إيجابية (تعيين في الخطوة 6.1.5.2.1).
   1. رصد التحولات: 5mC, 242→126 m/z (الطاقة الاصطدام، ف 5)؛ [د₃]-5mC، 245→129 m/z (ف 5)؛ العاصمة، 228→112 m/z (ف 5)؛ 5hmC، 258→142 m/z (ف 5)؛ [د₃]-5hmC، 261→145 m/z (ف 5) (مجموعة في الخطوة 6.1.5.2.2).
   2. تعيين الفولتية الشعرية وجزء في +3,500 الخامس (تعيين في الخطوة 6.1.5.3) و 90 الخامس (تعيين في الخطوة 6.1.5.2.1)، على التوالي.
   3. تعيين حجم الحقن في 5 ميليلتر وتحليل كل عينة 3 مرات (تعيين في الخطوة 6.1.2). استخدام المنحنيات القياسية المطابق لتقييم مقدار 5mC و 5hmC.
      1. إنشاء المنحنى القياسي من 5mC: نقل 1 – 50 نانومتر (1، 5، 10، 20، 50 نانومتر، وتركيز النهائي) أنابيب الحل القياسي من 5mC إلى جهاز الطرد المركزي وإضافة 50 نانومتر [د₃]-5mC للأنابيب. الملحق الحجم الإجمالي إلى 50 ميليلتر. إجراء تحليل 5mC القياسية اتباع التعليمات للحصول على نموذج 5mC (الخطوة 6).
      2. بناء المنحنى القياسي من 5hmC: نقل 1 – 20 نانومتر (1، 2، 5، 10، 20 نانومتر، وتركيز النهائي) الحل القياسي من 5hmC الطرد المركزي أنابيب وإضافة 3 نانومتر [د₃]-5hmC للأنابيب. الملحق الحجم الإجمالي إلى 50 ميليلتر. إجراء تحليل 5hmC القياسية اتباع التعليمات للحصول على نموذج 5hmC (الخطوة 6).

7-تحليل الدلالة الإحصائية

1. إجراء التحليل الإحصائي باستخدام البرنامج.
   1. افتح البرنامج وحدد "العمود" في "جدول جديد والرسم البياني". تعيين المعلمات على النحو التالي: "نموذج بيانات | ابدأ باستخدام جدول بيانات فارغ "؛ "اختر وضع الرسم بياني، أولى"؛ "الرسوم البيانية replicates أو أشرطة الخطأ | ارسم | يعني مع وزارة شؤون المرأة ".
   2. انقر فوق "إنشاء" لإدخال replicates ثلاثة من مجموعة المراقبة والرأسمالي/PD0325901-تعامل في السطر "ألف" و "باء"، على التوالي. حدد ستة بيانات وانقر فوق "تحليل" في "تحليل".
   3. حدد "اختباراتt (واختبارات nonparametric)" في "العمود تحليلات" وانقر فوق "موافق" لإدخال الواجهة التالية.
   4. تعيين المعلمات على النحو التالي: "اختر اختبار | اسم الاختبار | اختبار مزاوج تي ؛ خيارات | 2-الذيل "؛ "فواصل الثقة: 95%"؛ "الأرقام المعنوية | وتظهر الأرقام المعنوية 4 ". انقر فوق "موافق" للحصول على قيمة p بين معاملة السيطرة والرأسمالي/PD0325901.
2. تقييم دلالة إحصائية بين عنصر التحكم والمجموعات التجريبية التي توظف للطالب ذو الذيل اثنين ومزاوج تي-اختبار¹⁶.
   ملاحظة: ف < 0.05 يدل الفرق تمتلك دلالة إحصائية. * ف < 0.05، * * ف < 0.01، * * * ف < 0.001.

النتائج

Vc/PD0325901 فعل تآزر المحو العالمية للماوس دإط الخلايا. خلايا ES الماوس في مصل الدم يحمل هايبرميثيليشن الحمض النووي، بينما pluripotent الخلايا ICM وبجكس إظهار انتفاء مثلايشن الحمض النووي العالمي والدولة هيبوميثيلاتيد يرتبط ارتباطاً وثيقا بما^9،بلوريبوتينسي

Discussion

وفي هذا العمل، أثبتنا طريقة جديدة للجمع بين الرأسمالي و PD0325901 للحفاظ على خلايا الفأر ES في حالة غير متمايزة وهيبوميثيلاتيد، الذي تم التوصل إليه قبل إجراء تعاوني لتعزيز demethylation DNA بالاستثمار الرأسمالي، وقمع حيثياته الحمض النووي مثلايشن التي PD0325901. وعلاوة على ذلك، أظهرت الماوس دإط الخلا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
fetal bovine serum Australia source	Corning	35-076-CV	Component of mouse ES cell medium
DMEM/high glucose	Hyclone	SH30022	Component of mouse ES cell medium
LIF	Millipore	ESG1107	Component of mouse ES cell medium
non-essential amino acids (NEAA)	Gibco	11140050	Component of mouse ES cell medium
sodium pyruvate	Gibco	11360070	Component of mouse ES cell medium
L-glutamine	Gibco	25030081	Component of mouse ES cell medium
penicillin streptomycin solution	Gibco	15140122	Component of mouse ES cell medium
PBS	Sigma	P5493	Cells rinse
trypsin	Hyclone	SH30042	Cell dissociation
gelatin	Sigma	48722	Dishes coating
PD0325901	Stemolecule	04-0006-10	small-molecule chemical for cell culture
CHIR99021	Stemolecule	04-0004	small-molecule chemical for cell culture
vitamin C	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	XW00508171	small-molecule chemical for cell culture
Ultra Bioscience water purification systemr	Purelab	Ultra	Ultra water
DMSO	Sigma	D8418	Cell freezing medium
centrifuger	Eppendorf	5427R	DNA and protein extraction
protease inhibitor cocktail	Sigma	P8340	Component of RIPA buffer
PMSF Protease Inhibitor	ThermoFisher Scientific	36978	Component of RIPA buffer
DTT	Sigma	43815	Component of RIPA buffer
EGTA	Sigma	E3889	Component of RIPA buffer
Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1125	Genomic DNA extraction
NanoDrop 2000	ThermoFisher Scientific	NanoDrop 2000	Determination of DNA concentration
calf intestinal phosphatase	New England Biolabs	M0290	DNA digestion
DNase I	New England Biolabs	M0303	DNA digestion
snake venom phosphodiesterase I	Sigma	P4506	DNA digestion
Nanosep 3K Omega	Pall	OD003C35	filtration of digested DNA
1290 UHPLC system	Agilent	1290	UHPLC separation
G6410B triple quadrupole mass spectrometer	Agilent	G6410B	MS/MS analysis
Zorbax Eclipse Plus C18 column	Agilent	Zorbax Eclipse Plus	colume for UHPLC separation
5-methylcytosine	Solarbio Life Sciences	SM8900	standard 5mC
5-hydroxymethylcytosine (standard)	Toronto Research Chemicals	M295900	standard 5hmC
Prdm14 antibody	bioworld	BS7634	Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3a antibody	bioworld	BS6587	Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3b antibody	abcam	ab13604	Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3l antibody	abcam	ab3493	Western blot analysis-primary antibody
Dnmt1 antibody	abcam	ab13537	Western blot analysis-primary antibody
β-tubulin antibody	bioworld	BS1482MH	Western blot analysis-primary antibody
goat anti-rabbit IgG	abcam	ab6721	Western blot analysis-secondary antibody
goat anti-mouse IgG	abcam	ab6789	Western blot analysis-secondary antibody
Trizol	Invitrogen	15596-026	RNA extraction
reverse transcription system	Promega	A3500	RNA reverse transcription
GoTaq qPCR Master Mix	Promega	A6001	RT-PCR
StemTAG alkaline phosphatase staining and activity assay kit	Cells Biolabs, Inc.	CBA-302	alkaline phosphatase staining analysis
mouse ES cells: WT, 129 SvEv	Provided by Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China)		cell strain of mouse ES cells
microscope	Zeiss	LSM510	cells observation
GraphPad Prism 5.0	GraphPad Prism Software Inc.	5.0	statistical analysis