שיטת תרבות חלופית כדי לשמור על Hypomethylation גנומית של תאי גזע עובריים בעכבר באמצעות MEK מעכב PD0325901 וויטמין C

Summary

אנחנו מתוארות בפרוטרוט שני פרוטוקולים המבוססות על חומרים כימיים עבור culturing בתאי גזע עובריים בעכבר. שיטה חדשה מנצל מנגנונים סינרגטי של קידום חמצון בתיווך טט (על-ידי ויטמין C) ומדכא דה נובו סינתזה של 5-methylcytosine (על-ידי PD0325901) כדי לשמור על ה-DNA hypomethylation pluripotency של תאי גזע עובריים בעכבר.

Abstract

תאי גזע עובריים (ES) יש את היכולת להבדיל בין לכל אחת משלוש שכבות הנבט (האנדודרם, והמזודרם או האאקטודרם), ניתן להפיק שושלות רבות עבור רפואה רגנרטיבית. ES תא תרבות במבחנה כבר זמן רב בנושא חששות נרחבת. באופן קלאסי, העכבר ES תאים נשמרים בסרום ו לוקמיה מעכבות פקטור (LIF)-המכיל בינוני. עם זאת, בתנאים סרום/LIF, תאים להראות הטרוגניות מורפולוגיה, לפרופיל ביטוי של גנים הקשורים pluripotency, בעיקר במצב והשלמת. יתר על כן, בתרבית תאים ES התערוכה הכללית hypermethylation, אך נאיבי ES תאים של התא הפנימי מסה (ICM), בתאי הנבט הקדמוני (PGCs) במצב של hypomethylation העולמית. מדינת hypomethylated ICM, PGCs קשורה קשר הדוק pluripotency שלהם. כדי לשפר את העכבר ES תא תרבות שיטות, לאחרונה פיתחנו שיטה חדשה המבוססת על ניצול סלקטיבי משולב של שתי תרכובות מולקולה קטנה כדי לשמור על המדינה hypomethylated ו pluripotent הדנ א. כאן, אנו מציגים את הטיפול שיתוף של ויטמין C (Vc), PD0325901 יכול למחוק כ 90% 5-methylcytosine (5mC) ב 5 ימים העכבר ES תאים. התוכן שנוצר 5mC דומה לזו של PGCs. החקירה מכניסטית מראה כי PD0325901 up-מווסת את הביטוי Prdm14 לדכא את Dnmt3b (de novo דנ א methyltransferase), Dnmt3l (קופקטור של Dnmt3b), על-ידי הפחתת סינתזה 5mC de novo . Vc מקלה את ההמרה של 5mC 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) בעיקר על ידי Tet1, Tet2, המציין את מעורבותם של demethylations ה-DNA פסיביים ואקטיביים. יתר על כן, בתנאים Vc/PD0325901, העכבר ES תאים מראים pluripotent המדינה ומורפולוגיה הומוגנית. באופן קולקטיבי, אנו מציעים הרומן ושיטת כימית-סינרגיה תרבות להשגת DNA hypomethylation ותחזוקה של pluripotency העכבר ES תאים. השיטה תלויי-כימית מולקולה קטנה מתגבר את החסרונות העיקריים של התרבות סרום, מביאות הבטחה לייצר הומוגניות תאים ES עבור יישומים קליניים נוספים מחקרים.

Introduction

ES תאים שמקורם את ICM של הבלסטוציסט¹. התאים נמצאים במצב pluripotency והוא יכול ליצור כל שושלות הסומטית, תאים germline². הקמת תאים ES מספק ההזדמנות לחקור את ההתפתחות תהליכי במבחנה ניתן להפיק תאים של הרלוונטיות רפואי עבור רפואה רגנרטיבית בהתבסס על שלהם pluripotency³.

שתי קבוצות seminally נוסדה הקווים תא העכבר ES בשנת 1981, כאשר תאים שמקורם העובר העכבר בתחילת היו תרבותי בנסיוב שור עוברית (FBS)-המכיל בינוני עם העכבר מתחלקים fibroblasts (MEFs) מזין שכבה^1,4 . MEFs היו לא פעיל mitotically, גדלו מראש במנות לפני culturing תאים ES. MEFs מספקים תמיכה עבור העכבר ES תא מצורף ומפיקים גורמי גדילה כדי לקדם את הפצת ותרסן את הבידול⁵, בעוד FBS מציעה גורמים עם מחלות חיוניות והורמונים עבור התפשטות תאים. מחקרים מאוחרים יותר ציין כי LIF המיוצר על ידי תאי מזין היה ציטוקין מפתח התחדשות עצמית ותחזוקה של pluripotency העכבר ES תאים, התוספת של LIF לתוך האמצעי יכול תחליף מזין תאים⁶. כיום, התפרסות של העכבר ES התאים FBS/LIF בינוני-מזיני הוא עדיין השיטה הרגילה שאומצה על ידי חוקרים רבים. עם זאת, כמה בעיות עולות מתוך תפיסה זו התרבות הקלאסית. ראשית, מזין התאים מפרישים גורמי עודף בלתי מבוקרת, עלול לגרום זיהום פתוגניים⁷. כדי למנוע הפרעה זו, ציפוי המשטח של מנות עם ג'לטין ותוספת של LIF בסרום המכיל בינוני הן שיטות אלטרנטיביות לשמירה על העכבר ES תאים ללא תאים בשכבה מזין. בנוסף, העכבר ES התאים גדלו בתנאים סרום/LIF התערוכה מורפולוגי הטרוגניות אוכלוסיית תאים, אפילו ברמת הביטוי של גורמים הקשורים pluripotency⁸. מחקרים שנעשו לאחרונה מראים כי בתנאים סרום/LIF, גורמי שעתוק הקשורות pluripotency הליבה (כולל SOX2, Nanog ו- OCT4) יכול לקיים את pluripotency דרך LIF ונ ט איתות; עם זאת, ראוי לציין, הם גם מפעילים אות פיברובלסט גורם הגדילה (FGF) כדי לעורר בידול⁸. עקב פעולה כפולה אמביוולנטי גורמי שעתוק הליבה, העכבר ES תאים בתרבית בנסיוב מציגים הטרוגניות, בהיקף של שתי האוכלוסיות להחלפה, אחד דומה ICM ועוד הדומה המדינה כאשר הבחינה epiblast⁸. יתר על כן, העכבר ES תאים בנסיוב לעתים קרובות להפגין hypermethylation העולמי⁹, בעוד ICM ו- PGCs הם במצב hypomethylated הכללית, אשר קשורה קשר הדוק שלהם^9,pluripotency¹⁰.

יש ביקוש רב לפתח שיטות חדשות culturing העכבר ES תאים. מספר פרוטוקולים משופרת הוקמו מאז 2003¹¹ אבל שם ממשיך להיות כמה מגבלות, חסרונות⁷. מאז 2008, ניצול בשילוב של שני מעכבי קינאז מולקולה קטנה, PD0325901 (החומר המדכא של חלבון mitogen מופעל (MAPK) / חוץ-תאית-אות-מוסדר קינאז (טיפשה) (MEK)), CHIR99021 (המדכא של גליקוגן סינתאז קינאז 3 (GSK3)), N₂ב'₂₇ בינוני עם LIF ובלי סרום פתחה אופקים חדשים עבור culturing העכבר ES תאים¹². בינוני מוגדר החדש מאופיין על ידי שימוש שני מעכבי (2i). העכבר ES התאים תרבותי במדיום 2i/LIF הם הומוגנית אוכלוסיות התאים ואת הביטוי של גורמים pluripotency. בנוסף, העכבר 2i/LIF-תרבותי ' ES תאים התערוכה DNA hypomethylation ברחבי העולם, אשר קרובה יותר תאים דמויי ICM^9,13. למרות זאת, תרבות 2i יש החסרונות. PD0325901, CHIR99021 אינם מסיסים במים, בדרך כלל הם מומס דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד)-מבוסס מניות פתרון כדי להוסיף אותם תרבות בינוני. מחקרים הראו כי לטווח ארוך, חשיפה במינון נמוך של תאים דימתיל סולפוקסיד יכול להוביל cytotoxicity¹⁴.

כאן, אנחנו מנוצל שתי תרכובות מולקולה קטנה פיתחה שיטה תרבות חדשה של העכבר ES תאים. שיטת תרבות הרומן משלב Vc מעכב MEK PD0325901 כדי לקדם את ה-DNA hypomethylation במהירות, ביעילות לרמה המקבילה של PGC, בשם פרוטוקול culturing Vc/PD0325901. העכבר ES התאים Vc/PD0325901-נוסף בינוני המכילים סרום התערוכה עניי מורפולוגיה, מתקיימים במצב הקרקע. בהשוואה ל- 2i תרבות, העכבר ES התאים תרבותי בתנאים Vc/PD0325901 שהפגינו קינטיקה מהירה יותר של ה-DNA demethylation, יכול להגיע לרמה hypomethylation לזו של PGC. בנוסף, השימוש מעכב יחיד (PD0325901) מפחית את כמות דימתיל סולפוקסיד. קלט לתוך בינוני בהשוואה בשימוש 2i (PD0325901/CHIR99021) ומפחית את הנזק לתאים.

Protocol

1. תכשירים

1. היכונו פתרון של 1.0 מ מ PD0325901 (מעכב MEK) ו- 3.0 מ מ CHIR99021 (מעכב GSK3).
   1. שוקל 2 מ ג של PD0325901 ולהוסיף 4.15 מיליליטר דימתיל סולפוקסיד ב בקבוקון זכוכית ענבר.
   2. שוקל 2 מ ג של CHIR99021 ולהוסיף 1.43 מיליליטר דימתיל סולפוקסיד ב בקבוקון זכוכית ענבר.
   3. שיחזור הבאים, לאחסן aliquots (50 µL/צינור ב 200 µL המבחנות) ב-20 ° C, מוגן מפני אור. הסר את שפופרת המכילה את המניה קפואים במקפיא, להפשיר בטמפרטורת החדר לפני השימוש.
2. שוקל 0.0176 גר' Vc לתוך 1 מ"ל של שפופרת צנטרפוגה, לשקם אותו עם 1 מ"ל מים סטריליים ריכוז סופי של 100 מ מ לפני השימוש.
3. הפוך ללא פעיל FBS: דגירה 500 מ"ל של FBS באמבט מים ב 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
4. היכונו culturing העכבר ES תאים 600 מ של מדיום בסיסי.
   1. השתמש בקבוק של DMEM/גבוהה גלוקוז בינוני (500 mL) והסר 40 מ.
   2. תוספת 460 מ של DMEM/גבוהה בינונית גלוקוז עם 20% לא פעיל FBS (120 מ ל), 1,000 LIF U/mL (60 µL של פתרון מניות U/mL⁷ 10), מ מ 0.1 שאינם חיוניים חומצות אמינו (NEAA) (6 מ"ל של פתרון מניות 10 מ מ), 1 מ מ נתרן פירובט (6 מ"ל של פתרון מניות 100 מ מ) , 2 מ מגלוטמין (6 מ"ל של פתרון מניות 200 מ"מ), מ מ 0.1 β-mercaptoethanol (600 µL של פתרון מניות 100 מ מ), ואת 33 IU/mL פניצילין µg/mL 33 סטרפטומיצין (2 מ"ל של פניצילין-סטרפטומיצין מעורב פתרון (פניצילין 10,000 IU/mL ו- 10,000 סטרפטומיצין µg/mL)) . להגדיר את המדיום בסיסיים כמו סרום בינוני.
   3. פיפטה 50 µL של פתרון מניות של PD0325901 (1.0 מ מ) ו- Vc (100 מ מ), בהתאמה, לתוך 50 מ של המדיום סרום (הריכוז הסופי: מיקרומטר 1.0 PD0325901 ו 100 מיקרומטר Vc), ולהגדיר את המדיום כמו Vc/PD0325901 בינונית.
      הערה: להכין Vc/PD0325901 הטרייה בינונית לפני השימוש עקב חוסר היציבות של Vc.
   4. באמצעות פיפטה של, להעביר 50 µL של פתרון מניות של PD0325901 (1.0 מ מ), CHIR99021 (3.0 מ מ), בהתאמה, לתוך 50 מ של המדיום סרום (הריכוז הסופי: מיקרומטר PD0325901 1.0 ו- CHIR99021 3.0 מיקרומטר), ולהגדיר את המדיום כמו 2i בינוני.
5. להכין את הכלים מצופים ג'לטין.
   1. להכין את הפתרון ג'לטין 0.1%: להמיס 0.3 גרם ג'לטין לתוך 300 מ ל מים הנדסה גנטית בתוך בקבוק ריאגנט זכוכית עם כובע ולחטא ב החיטוי ב 121 מעלות צלזיוס מינימלית 20 לחנות את פתרון סטרילי בטמפרטורת החדר.
   2. דגירה המנות התרבות התא (קוטר 6 ס"מ) עם 2 מ של 0.1% פתרון ג'לטין למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, ואז האחות הג'לטין. יבש את הכלים אוויר ולהשתמש בהם בתוך 12 שעות.
6. הכינו 10 מ"ל של העכבר ES תא הקפאה במדיום שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל: 90% FBS (9 מ ל) ו- 10% דימתיל סולפוקסיד (1 מ"ל). השתמש המדיום בתוך יום אחד.
7. להכין מיכל ההקפאה: להוסיף 100% אלכוהול איזופרופיל לקו המילוי של המיכל מקפיא, ולמחוק את האלכוהול איזופרופיל הישן. להוסיף אלכוהול איזופרופיל חדש ישירות לאחר כל שימוש החמישי.
8. להפוך את המאגר עיכול אנזימטי: שוקלים 1.2114 גר' אבקה טריס לתוך 100 מ של מים הנדסה גנטית כדי להכין 100 מ מ פתרון טריס ולהוסיף מרוכז פתרון HCl (כ- 12 מ') בתוך תמיסת טריס כדי להתאים את ה-pH ל 7.6 (בערך 0.6 מ"ל של תמיסה HCl מרוכזת).
9. הכנת 50 מ של רדיו immunoprecipitation assay מאגר (מאגר ריפה): 20 מ מ טריס, pH 7.4, 1 מ MgCl₂, 150 מ מ NaCl, 20% גליצרול, 0.5% NP40, 1 מ מ EDTA, 1 מ"מ EGTA. תוספת עם 1 מ DTT, 1 X מעכב פרוטאז קוקטיילים ו- 1 מ מ PMSF לפני השימוש. פעם נוספת את PMSF, להשתמש המאגר תוך 30 דקות.

2. לגדול העכבר ES תאים על מנות מצופים ג'לטין

1. חם מראש העכבר ES תאים (סוג הפרוע, 129 SvEv) תרבות בינוני טריפסין, פתרון פוספט buffered (PBS) באמבט מים בטמפרטורה 37 º c
2. המעבר את התאים. האחות המדיום לחלוטין מן המנה פיפטה 2 מ של PBS לשטוף הכלים לשטוף את התאים.
   1. להסיר את PBS עם פיפטה ולשטוף את התאים שוב עם 2 מ"ל ל- PBS.
   2. הסר את PBS ולהוסיף mL 0.3 של טריפסין-EDTA (0.25%) כל מנה.
   3. מכסים את כל טריפסין במהירות ולאחר מכן הסר אותו באופן מיידי.
   4. הכניסו את המנה אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה לנתק את התאים מתוך קערה. להוציא את הכלים מן החממה ולהוסיף 2 מ של סרום מראש ומחוממת בינוני כדי לסיים את הפעולה של טריפסין.
   5. מביצועם המושבות תא להשעיה תא בודד על-ידי resuspending עם פיפטה (tip פיפטה 5 מ"ל) 10 פעמים.
3. להעביר µL 150 של 2 מ של הפתרון הסלולרי (כ- 190,000 תאים על ידי ספירת עם hemocytometer) לתוך תבשיל חדש מצופים ג'לטין, להשלים עם 3 מ"ל של מדיום Vc/PD0325901 טריים לכל מאכל תרבות 6 ס מ. התרבות התאים חממה 37 ° C עם 5% CO₂.
4. כל 24 שעות ביממה תוך המקננת, להסיר את המדיום התרבות הישנה ולהוסיף 3 מ"ל של טרי Vc/PD0325901-בינוניים לתוך המנה תרבות עקב חוסר היציבות של Vc. מצפה 70 – 80% confluency לאחר 2-3 ימים.
5. כשמגיעים 70-80% confluency, המעבר את התאים ולהמשיך תרבות אותן כמתואר בצעדים 2.2-2.4.

3. הקפאה והפשרה העכבר ES תאים

1. להקפיא העכבר ES תאים.
   1. ניתוק התאים מתוך מבחר המאכלים עם טריפסין צעד בעקבות 2.2.
   2. העבר את התאים לתוך צינור פלסטיק 15 מ"ל צנטריפוגה-800 x g ובטמפרטורת החדר למשך 3 דקות.
   3. זורק את תגובת שיקוע בעדינות לתוך גביע, resuspend בגדר תא עם 1 מ"ל של טריות בינוני מקפיא. הכינו את המקפיא בינוני 30 דקות לפני שלב זה על מנת להבטיח כי זה בטמפרטורת החדר לפני השימוש.
   4. העברת תאי הקפאה בינוניים עד צינור microcentrifuge מ ל 1.8 עם פיפטה 1 מ"ל ולמקם את הצינור microcentrifuge לתוך מיכל ההקפאה. להוסיף אלכוהול איזופרופיל לקו המילוי של המיכל מקפיא ולשמור אותו בטמפרטורת החדר לפני השימוש.
   5. להשאיר את מיכלי הקפאה בן לילה במקפיא-80 ° C.
   6. העברת הצינורות microcentrifuge מיכל חנקן נוזלי עד 2-3 שנים.
      הערה: לא לשמור תאים המדיום קפוא במשך הרבה זמן, מהר להעביר את התאים מקפיא-80 ° C בשל הרעילות של דימתיל סולפוקסיד.
2. הפשרת העכבר ES תאים.
   1. לחמם 50 מ של סרום בינוני באמבט מים 37 º C.
   2. להוציא בקבוקון המכיל תאים מהגורם המכיל חנקן נוזלי, לטבול את המבחנה רצ'ט באמבט מים 37 º C. לנער את זה במהירות באמבט מים להפשיר. העבר את התאים לתוך צינור 15 מ"ל עם פיפטה 1 מ"ל. להוסיף 2 מ של סרום מראש ומחוממת תרבות בינוני לתוך צינור כדי לדלל את המדיום קופא, ואז צנטריפוגה-g 800 x ובטמפרטורת החדר למשך 3 דקות.
   3. הסר את תגובת שיקוע, בעדינות resuspend כדורי תא עם 3 מ"ל של מדיום Vc/PD0325901 טריים באמצעות פיפטה 5 מ.
   4. להעביר את התאים מהצינור 15 מ"ל מאכל מצופה ג'לטין, התרבות התאים עבור ה 24 התרבות התאים שוב כפי שמתואר בשלב 2.

4. לחלץ את החלבון הכולל של תאים

1. לשטוף את התאים שנאספו מ ל 1 ל- PBS, ואז צנטריפוגה-g 800 x ובטמפרטורת החדר למשך 3 דקות.
2. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא ביסודיות באמצעות מאגר ריפה בתוספת עם DTT, מעכבי פרוטאז קוקטייל PMSF pipetting בעדינות. אמצעי האחסון ריפה המאגר נמצא כ 5 x זה של התא גלולה.
   הערה: לבצע את resuspension תא על קרח.
3. שמור את התאים במאגר ריפה במשך 30 דקות על קרח, צנטריפוגה ב 13,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
4. להעביר את תגובת שיקוע צינור ולאחסן aliquots ב-80 מעלות צלזיוס.
5. לקבוע את הריכוז של החלבון עם ערכת וזמינותו של חלבון ברדפורד.

5. לחלץ את הדנ א מן התאים תקציר DNA לתוך נוקלאוטיד יחיד באמצעות אנזימים

1. לאסוף את התאים עם טריפסין כפי שתואר בשלבים 3.1.1 ו- 3.1.2.
2. לבצע את החילוץ DNA עם ערכת טיהור DNA גנומי ההוראות של היצרן.
3. אחסן את ה-DNA שחולץ צינורות 1-mL צנטריפוגה. להוסיף 100 µL של הנדסה גנטית מים לתוך הצינור צנטריפוגה, לפזר את ה-DNA על-ידי pipetting כ 15 פעמים. לקבוע את הריכוז ולהעריך את איכות ה-DNA על ידי מדידת ספיגת ב-260 nm ו- 280 ננומטר¹⁵. ריכוז הדנ א הוא כ-500 ng/µL.
4. µG 5 תקציר של ה-DNA במערכת פתרון 50 µL: להוסיף µL 5 מ"מ טריס-HCl פתרון, pH 7.6 (הריכוז הסופי: 10 מ מ), 2 U עגל פוספטאז במעי, 1 U DNase אני, 0.005 U נחש ארס phosphodiesterase, 5 µg של ה-DNA (לחשב את עוצמת הקול שנוספו על-פי measu ריכוז ה-DNA אדום, µL ~ 10) לתוך צנטריפוגה צינור להגביר עוצמת הקול של פתרון µL 50 עם מים הנדסה גנטית. דגירה התערובת ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. Centrifuge הפתרון DNA מעוכל-1000 g ובטמפרטורת החדר במשך 1 דקה לאסוף את הפתרון לחלק התחתון של צינורות.
5. להעביר את פתרון ה-DNA מעוכל מן הצינורות צנטריפוגה לתוך צינורות אולטרה-סינון (משקל מולקולה הקיצוץ: 3 kDa), צנטריפוגה-13,000 g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות להסיר את אנזימי עיכול.
6. להכין את הדגימות 5mC וניתוח 5hmC.
   1. לניתוח 5hmC: pipet 36 µL מסנן לפתרון צנטריפוגה חדש צינור (1 מ"ל) ולהוסיף 4 µL של 5'-(hydroxymethyl-d₃)-2'-deoxycytidine ([D₃]-5hmC) עם הריכוז הסופי של 3 ננומטר.
   2. לניתוח 5mC: להוסיף 196 µL של הנדסה גנטית מים לתוך שפופרת צנטרפוגה חדש pipet 4 µL של פתרון סינון הצינור (דילול 50-fold), עקב צפיפות גבוהה של 5mC ב- DNA גנומי. להעביר µL 36 של הפתרון מדולל שפופרת צנטרפוגה חדש ולהוסיף 4 µL של (5'-(methyl-d₃)-2'-deoxycytidine ([D₃]-5mC) עם הריכוז הסופי של 50 ננומטר. שימוש [D₃]-5hmC [D₃]-5mC כמו תקן פנימי לכיול 5hmC ו- 5mC, בהתאמה.
7. להעביר את הפתרון מדגם צינורות מדידה ולאחסן ב 4 º C. לנתח את 5mC ואת 5hmC עם ביצועים מעולים במיוחד נוזלי כרומטוגרפיה-טריפל פאול ספקטרומטר מסה עם מרובה-תגובה ניטור (UHPLC-MS/MS (MRM)) כפי שמתואר הדוח הקודם¹⁵.

6. לנתח 5mC ואת 5hmC באמצעות UHPLC-MS/MS¹⁵

1. כוונן פרמטרים שונים עבור ניתוח 5mC ו- 5hmC שימוש בתוכנת UHPLC-MS.
   1. להקים שיטה חדשה. פתח את התוכנה ולחץ על "קובץ | חדש | שיטת". התערוכה תיבת ההודעה של "שיטת עורך" עם התוכן "האם ברצונך לשמור את השינויים עבור השיטה הנוכחית" ולחץ על "לא".
   2. לבנות את הפרמטרים של דוגם. לחץ על "דוגם | ההתקנה | הזרקת". בחרו "הזרקת רגיל", קלט "5 µL בווליום הזרקת".
   3. לבנות את הפרמטרים של המשאבה ב- UHPLC.
      1. לחץ על "BinPump2 | הגדרת"לבנות את הפרמטרים של המשאבה. הגדר "זורם" "0.25 mL/min" ו- "לעצור את הזמן" ב- "15 דקות".
      2. הגדרת "ממיס B ב-5%" ולחץ "גבולות"-"מקס 600 בר".
      3. לחץ על "BinPump2 | לוח זמנים"כדי לבנות איזוקראטית • תנאי פרמטרים עבור ניתוח 5mC. לחץ על 'הוספה' כדי להוסיף שורה. קלט "0.00" ב "זמן" ו- "5.0" ב "B %". לחץ על "הוספה" פעם נוספת כדי להוסיף שורה חדשה. קלט "15.00" ב "זמן" ו- "5.0" ב "B %".
      4. לחץ על "BinPump2 | לוח זמנים"לבנות את הפרמטרים • תנאי מעבר לניתוח 5hmC. לחץ על "הוספה כדי להוסיף שורה. קלט 0.00-זמן ו- 5.0-"B %". לחץ על "הוספה" פעם נוספת כדי להוסיף שורה חדשה. קלט "3.00" ב "זמן" ו- "5.0" ב "B %". לחץ על "הוספה" עבור עוד 6 פעמים להוסיף שורות 6. קלט "3.01" ב "הזמן" ו "15.0" ב- "B %", "6.00"-"הזמן" ו- "15.0" ב- "B %", "6.01" ב "זמן" ו- "100" ב- "B %", "10.00" ב "זמן" ואת "100.0" ב- "B %", "10.01"-"הזמן" ו- "5.0" ב- "B %", "15.00" ב "זמן" ו- "5.0" ב- "B %" ברצף.
         הערה: לבצע הניתוח של 5mC ו- 5hmC בנפרד בשל תנאי ההפרדה שונה UHPLC.
   4. לבנות את הפרמטרים של הטמפרטורה של תא עמודה (TCC) ב- UHPLC.
      לחץ על "TCC | ההתקנה | טמפרטורה (משמאל) "קלט"30 ° C".
   5. להקים את הפרמטרים של דני מוליארצוק-MS/MS.
      1. לחץ על "דני מוליארצוק MS | לעצור את הזמן | לא הגבלת/כמו משאבה"," מקור יון | ESI"," זמן סינון | שיא רוחב: 0.07 דקות ". הגדרת "זמן מקטעים: שעת התחלה: 0"; "סוג סריקה: MRM"; "ערך Div: ל MS"; "דלתא EMV (+): 200" ו- "דלתא EMV (-): 0".
      2. לבנות את הפרמטרים של ניטור המעברים של 5mC, D₃-5mC, dC, 5hmC ו- D₃-5hmC
         1. לחץ על "דני מוליארצוק MS | רכישה | לסרוק קטעים: לשכון:-90 אינץ '; "Fragmentor: 90"; "אנרגיית התנגשות: 5"; "תא מאיץ מתח: 4" ו- "קוטביות: חיובי".
         2. קלט "5mC"-מתחם "שם", "242" ב "קודמן יון", "126" ב- "מוצר יון" לניתוח 5mC. לחץ על הלחצן הימני ובחר באפשרות "הוסף שורה" כדי להוסיף שורה חדשה. קלט "D₃-5mC"-מתחם "שם", "245" ב "קודמן יון", "129" ב- "מוצר יון" D₃-ניתוח 5mC.
         3. תוספת אחרת שלוש שורות באמצעות של אותו מצב. קלט "dC"-מתחם "שם", "228" ב "קודמן יון", "112" ב- "מוצר יון" לניתוח dC. קלט "5hmC"-מתחם "שם", "258" ב "קודמן יון", "142" ב- "מוצר יון" לניתוח 5hmC. קלט D₃-5hmC-מתחם שם, "261" ב "קודמן יון", "145" ב- "מוצר יון" D₃-ניתוח 5hmC.
      3. לבנות את הפרמטרים של מקור גז. לחץ על "דני מוליארצוק MS | מקור | מקור פרמטרים: גז Temp: 300 ° C "; "גז זרימה: 11 L/min"; "מפוחים: 15 psi"; "חיובי-נימי: 3500 V".
      4. לשמור את השיטה המוצעת. לחץ על "דני מוליארצוק MS | מכשיר | שמור שיטה כמו". בחר נתיב עבור השיטה המוצעת על ידי "מדריך" ותן שם עבור פעולת השירות על-ידי הזנת התוכן "שיטה", לדוגמה: 5mC וניתוח 5hmC.
2. UHPLC ההפרדה וניתוח MS/MS של mononucleosides
   1. הכן השלב ניידים עבור 5mC ו ציטוזין (C) ניתוח: יוצרים שלב ניידים של פתרון A ו- B. פתרון א': 500 מ ל מים הנדסה גנטית עם 500 µL חומצה פורמית (הריכוז הסופי: 0.1%), ואת פתרון ב': 500 מ ל 100% מתנול. לערבב פתרון A ו- B 95:5 (v: v) כמו השלב נייד כדי elute 5mC ו- C (מוגדרת בשלב 6.1.3.3). לקבוע את קצב הזרימה 0.25 mL/min (מוגדרת בשלב 6.1.3.1).
   2. הכן השלב ניידים על ידי ממס A ו- B לניתוח 5hmC. הממס הוא 2.0 מ מ NH₄HCO₃ תמיסה מימית (pH 9.0) (500 mL), והוא ממיס B 100% מתנול (500 mL). 5hmC נפרדות על-ידי • הדרגתיות אופטימיזציה תנאי: 0-3 דקות, 5.0% B ל- 95% (v: v); 3-6 דקות, 15.0% B ו- 85% A; 6-10 דקות, 100% ב'; 10-15 דקות, 5.0% B ל- 95% A (מוגדרת בשלב 6.1.3.4). לקבוע את קצב הזרימה 0.25 mL/min (מוגדרת בשלב 6.1.3.1).
3. לנצל ספקטרומטריית electrospray MS/MS עם מצב MRM (מוגדרת בשלב 6.1.5.1) כדי לנתח את • תנאי מהעמודה ולאמץ את מצב יון חיובי (מוגדרת בשלב 6.1.5.2.1).
   1. לפקח על המעברים: 5mC, 242→126 מ/z (אנרגיית התנגשות, 5 eV); [D₃]-5mC, 245→129 מ/z (5 eV); dC, מ/z 228→112 (5 eV); 5hmC, 258→142 מ/z (5 eV); [D₃]-5hmC, 261→145 מ/z (5 eV) (מוגדרת בשלב 6.1.5.2.2).
   2. להגדיר את המתחים נים, פרגמנט +3,500 V (מוגדרת בשלב 6.1.5.3) ולהגדיר 90 וולט (בשלב 6.1.5.2.1), בהתאמה.
   3. לקבוע את עוצמת הקול של הזרקת 5 µL ולנתח כל מדגם 3 פעמים (מוגדרת בשלב 6.1.2). מעסיקים את עקומות סטנדרטי המתאים כדי להעריך את כמות 5mC ו- 5hmC.
      1. להקים את עקומת סטנדרטית של 5mC: העברת 1 – 50 ננומטר (1, 5, 10, 20, 50 ננומטר, הריכוז הסופי) תמיסה סטנדרטית של 5mC לתוך צנטריפוגה צינורות ולהוסיף 50 ננומטר [D₃]-5mC על הצינורות. תוספת לנפח הכללי ל- µL 50. לבצע הניתוח של 5mC תקן ביצוע ההוראות עבור הדגימה 5mC (שלב 6).
      2. לבנות את עקומת סטנדרטית של 5hmC: העברת 1 – 20 ננומטר (1, 2, 5, 10, 20 ננומטר, הריכוז הסופי) תמיסה סטנדרטית של 5hmC צנטריפוגה צינורות ולהוסיף 3 ננומטר [D₃]-5hmC על הצינורות. תוספת לנפח הכללי ל- µL 50. לבצע הניתוח של 5hmC תקן ביצוע ההוראות עבור הדגימה 5hmC (שלב 6).

7. לנתח את מובהקות סטטיסטית

1. לבצע ניתוח סטטיסטי באמצעות תוכנה.
   1. לפתוח את התוכנה ובחר "טור" "טבלה חדשה & גרף". הגדר את פרמטרי כדלקמן: "דגום נתונים | התחל עם טבלת נתונים ריק"; "בחר מצב קודם את גרף"; "יצירת גרפים משכפל או קווי שגיאה | מגרש | מתכוון עם SEM."
   2. לחץ על "צור" קלט את שלושת משכפל בקבוצת הבקרה וטיפל Vc/PD0325901 בשורה "A" ו- "B", בהתאמה. בחר את הנתונים שש ' ולחץ על 'נתח' בניתוח"" '.
   3. בחר "בדיקותt (וגם בדיקות nonparametric)" ב- "טור ניתוחים" ולחץ "אישור" כדי להזין את הממשק הבא.
   4. הגדר את פרמטרי כדלקמן: "בחר מבחן | שם הבדיקה | מבחן אינטראקצית t ; אפשרויות | דו-זנבית"; "מרווחי ביטחון: 95%"; "ספרות משמעותיות | הצג 4 ספרות משמעותיות". לחץ על "אישור" כדי לרכוש את ערך p בין הטיפול ובקרה Vc/PD0325901.
2. להעריך את משמעות סטטיסטית בין הפקד הקבוצות ניסיוני העסקת הסטודנט דו-זנבי, אינטראקצית t-מבחן¹⁶.
   הערה: p < 0.05 מציין את ההבדל בעלי מובהקות סטטיסטית. * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001.

תוצאות

Vc/PD0325901 המושרה בסינרגיה מחיקה הכללית של העכבר ES התאים. העכבר ES התאים בנסיוב התערוכה DNA hypermethylation, ואילו תאים pluripotent ICM PGCs מראים מחיקה הכללית של מתילציה DNA המדינה hypomethylated קשורה קשר הדוק עם שלהם^9,pluripotency¹⁰.

בעבר, אנ...

Discussion

עבודה, הפגנו שיטה של שילוב Vc, PD0325901 כדי לקיים את העכבר ES תאים על מצב מובחן ו hypomethylated, אשר הושגה על ידי פעולה סינרגטי של קידום DNA demethylation מאת Vc ודיכוי דה נובו דנ א מתילציה על-ידי PD0325901. יתר על כן, העכבר ES התאים הראו מורפולוגיה נהדר תחת מערכת התרבות Vc/PD0325901.

לקיים יותר של המדינה ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
fetal bovine serum Australia source	Corning	35-076-CV	Component of mouse ES cell medium
DMEM/high glucose	Hyclone	SH30022	Component of mouse ES cell medium
LIF	Millipore	ESG1107	Component of mouse ES cell medium
non-essential amino acids (NEAA)	Gibco	11140050	Component of mouse ES cell medium
sodium pyruvate	Gibco	11360070	Component of mouse ES cell medium
L-glutamine	Gibco	25030081	Component of mouse ES cell medium
penicillin streptomycin solution	Gibco	15140122	Component of mouse ES cell medium
PBS	Sigma	P5493	Cells rinse
trypsin	Hyclone	SH30042	Cell dissociation
gelatin	Sigma	48722	Dishes coating
PD0325901	Stemolecule	04-0006-10	small-molecule chemical for cell culture
CHIR99021	Stemolecule	04-0004	small-molecule chemical for cell culture
vitamin C	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	XW00508171	small-molecule chemical for cell culture
Ultra Bioscience water purification systemr	Purelab	Ultra	Ultra water
DMSO	Sigma	D8418	Cell freezing medium
centrifuger	Eppendorf	5427R	DNA and protein extraction
protease inhibitor cocktail	Sigma	P8340	Component of RIPA buffer
PMSF Protease Inhibitor	ThermoFisher Scientific	36978	Component of RIPA buffer
DTT	Sigma	43815	Component of RIPA buffer
EGTA	Sigma	E3889	Component of RIPA buffer
Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1125	Genomic DNA extraction
NanoDrop 2000	ThermoFisher Scientific	NanoDrop 2000	Determination of DNA concentration
calf intestinal phosphatase	New England Biolabs	M0290	DNA digestion
DNase I	New England Biolabs	M0303	DNA digestion
snake venom phosphodiesterase I	Sigma	P4506	DNA digestion
Nanosep 3K Omega	Pall	OD003C35	filtration of digested DNA
1290 UHPLC system	Agilent	1290	UHPLC separation
G6410B triple quadrupole mass spectrometer	Agilent	G6410B	MS/MS analysis
Zorbax Eclipse Plus C18 column	Agilent	Zorbax Eclipse Plus	colume for UHPLC separation
5-methylcytosine	Solarbio Life Sciences	SM8900	standard 5mC
5-hydroxymethylcytosine (standard)	Toronto Research Chemicals	M295900	standard 5hmC
Prdm14 antibody	bioworld	BS7634	Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3a antibody	bioworld	BS6587	Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3b antibody	abcam	ab13604	Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3l antibody	abcam	ab3493	Western blot analysis-primary antibody
Dnmt1 antibody	abcam	ab13537	Western blot analysis-primary antibody
β-tubulin antibody	bioworld	BS1482MH	Western blot analysis-primary antibody
goat anti-rabbit IgG	abcam	ab6721	Western blot analysis-secondary antibody
goat anti-mouse IgG	abcam	ab6789	Western blot analysis-secondary antibody
Trizol	Invitrogen	15596-026	RNA extraction
reverse transcription system	Promega	A3500	RNA reverse transcription
GoTaq qPCR Master Mix	Promega	A6001	RT-PCR
StemTAG alkaline phosphatase staining and activity assay kit	Cells Biolabs, Inc.	CBA-302	alkaline phosphatase staining analysis
mouse ES cells: WT, 129 SvEv	Provided by Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China)		cell strain of mouse ES cells
microscope	Zeiss	LSM510	cells observation
GraphPad Prism 5.0	GraphPad Prism Software Inc.	5.0	statistical analysis