JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы подробно описаны два химической основе протоколы для культивирования мышиных эмбриональных стволовых клеток. Этот новый метод использует синергетический механизмы содействия тет опосредованной окисления (витамин C) и подавления de novo синтеза 5-метилцитозин (по PD0325901) для поддержания ДНК hypomethylation и плюрипотентности эмбриональных стволовых клеток мыши.

Аннотация

Эмбриональных стволовых (ES) клетки способны дифференцироваться в любой из трех зародышевых (Эндодерма, мезодермы или эктодермы) и может генерировать много линий для регенеративной медицины. ES клеток культуры в vitro уже давно предметом широкой озабоченности. Классически, клетки мыши ES поддерживаются в сыворотке и лейкемия ингибирующего фактор (LIF)-содержащих среднего. Однако в сыворотке/LIF условиях, клетки Показать разнородность в морфологии и профиль выражение генов, связанных с плюрипотентности и в основном в метастабильного состояния. Кроме того культивируемых клеток ES выставку глобального hypermethylation, но наивно ES клеток внутренней клеточной массы (ICM) и первичных зародышевых клеток (PGCs) находятся в состоянии глобального hypomethylation. Hypomethylated Состояние ICM и PGCs тесно связан с их плюрипотентности. Чтобы улучшить методы культуры клетки мыши ES, мы недавно разработали новый метод, основанный на выборочно комбинированного использования двух соединений мелкомолекулярных поддерживать состояние hypomethylated и плюрипотентных ДНК. Здесь мы представляем, что совместное лечение дефицита витамина C (Vc) и PD0325901 можно стереть около 90% 5-метилцитозин (5мс) на 5 дней в ES клеток мыши. Содержание созданных 5мс сопоставим с в PGCs. Механистический расследование показывает, что PD0325901 вверх регулирует выражение Prdm14 для подавления Dnmt3b (de novo ДНК метилтрансфераза) и Dnmt3l (кофактор Dnmt3b), уменьшая 5мс синтеза de novo . VC облегчает преобразование 5мс 5-Гидроксиметилцитозин (5hmC) главным образом катализируемые Tet1 и Tet2, указывающее участие пассивного и активного demethylations ДНК. Кроме того Vc/PD0325901 условиях, клетки ES мыши Показать однородной морфологии и плюрипотентных государства. Коллективно мы предлагаем Роман и химико Синергия культуры метод для достижения hypomethylation ДНК и поддержания плюрипотентности в клетки мыши ES. Метод химического зависимых мелкомолекулярных преодолевает основные недостатки сыворотки культуры, и держит обещание сформировать однородные клетки ES для дальнейшего клинического применения и исследования.

Введение

Клетки ES возникли от ICM бластоциста1. Клетки находятся в состоянии плюрипотентности и могут образовывать все соматические линий и микрофлорой клетки2. Создание клеток ES обеспечивает возможность исследовать развитие процессов в пробирке и может генерировать клетки медицинской значимости для регенеративной медицины, основанной на их плюрипотентности3.

Seminally созданы две группы линий клетки мыши ES в 1981 году и когда клетки, полученные из раннего эмбриона мыши были культивировали в плода бычьим сывороточным (ФБС)-содержащих средний с мыши эмбриональных фибробластов (MEFs) как фидер слой1,4 . MEFs были инактивированных mitotically и предварительно были выращены в блюда до культивирования клеток ES. MEFs обеспечивают поддержку для мыши ES клеток вложения и производят факторов роста для содействия распространению и подавления дифференциация5, в то время как FBS предлагает основные трофических факторов и гормоны для пролиферации клеток. Последующие исследования указали, что LIF, производимые клетки фидера был ключевых цитокинов для самообновления и поддержания плюрипотентности в ES клеток мыши, и добавлением LIF в среду может подменить фидер клетки6. В настоящее время самообеспечение мыши ES клеток в среде FBS/LIF на кормушки-прежнему стандартный метод, принятый многими исследователями. Однако с этим подходом классической культуры возникают некоторые проблемы. Во-первых фидер клетки секретируют избыток и неконтролируемых факторов и может вызвать загрязнение патогенными7. Чтобы избежать этого вмешательства, покрытие поверхности блюда с желатином и добавлением LIF в сыворотке содержащих среднего, альтернативные методы для поддержания клеток мыши ES без подачи слоя клеток. Кроме того клетки ES мыши, выращенной в условиях, сыворотка/LIF экспонат морфологическая гетерогенность популяции клеток и даже уровень экспрессии факторов, связанных с плюрипотентности8. Последние исследования показывают, что в сыворотке/LIF условиях, связанных с плюрипотентности основных факторов транскрипции (включая SOX2, Nanog и OCT4) могут поддерживать плюрипотентности через LIF и WNT сигнализации; Однако в частности, они также активировать фибробластов фактор роста (ФБП) сигнал для запуска дифференцировки8. Из-за двойственной двойного действия основных факторов транскрипции мыши ES клетки культивировали в сыворотке представляют неоднородность, состоящий из двух взаимозаменяемых популяций, один похож на ICM и другой похожий загрунтовать Эпибласт государства8. Кроме того мышь ES клеток в сыворотке крови часто exhibit глобальной hypermethylation9, тогда как ICM и PGCs находятся в состоянии глобального hypomethylated, который тесно связан с их плюрипотентности9,10.

Существует значительный спрос для разработки новых методов для культивирования клеток мыши ES. С 2003 года11 были созданы несколько более протоколов, но продолжает быть некоторые ограничения и недостатки7. С 2008 года, комбинированного использования двух малых молекул протеинкиназы ингибиторов, PD0325901 (ингибитор Митоген активации протеинкиназы (MAPK) / внеклеточных сигналов регулируемой киназы (Эрк) (МЭК)) и CHIR99021 (ингибитора синтазы гликогена Киназа 3 (GSK3)), в N2B27 средних с LIF и без сыворотки открыло новые перспективы для культивирования мыши ES клеток12. Это новое средство определенных характеризуется использованием двух ингибиторов (2i). Мыши ES клетки культивировали в среде 2i/LIF более однородны в клеточных популяций и выражение плюрипотентности факторов. Кроме того клетки мыши 2i/LIF-культивированный ES экспонат ДНК hypomethylation глобально, который ближе к ICM-подобных клеток9,13. Несмотря на это 2i культура имеет свои недостатки. PD0325901 и CHIR99021 нерастворимы в воде и как правило, растворяются в диметилсульфоксида (ДМСО)-на основе фондовых решение, чтобы добавить их в питательную среду. Исследования показали, что долгосрочный и воздействия низких доз клеток ДМСО может привести к цитотоксичность14.

Здесь, мы использовали две небольшие молекулы соединений и разработали новый метод культуры клеток мыши ES. Роман культуры метод сочетает ингибитор PD0325901 Vc и MEK содействовать ДНК hypomethylation быстро и эффективно на сопоставимый уровень PGC, названный как Vc/PD0325901 культивирования протокола. Мышь ES клеток в среде Vc/PD0325901-добавлена сыворотки содержащих экспонат однородности в морфологии и выдержаны в первом состоянии. По сравнению с 2i культуры, мыши ES клетки культивировали в условиях Vc/PD0325901 выставку быстрее кинетика ДНК деметилирования и может достичь уровня hypomethylation, сопоставимую с PGC. Кроме того, использование одного ингибитора (PD0325901) уменьшает ввода ДМСО в среду по сравнению с используемой в 2i (PD0325901/CHIR99021) и уменьшает повреждения клеток.

протокол

1. Подготовка

  1. Подготовить раствор 1,0 мм PD0325901 (МЭК ингибитор) и 3,0 мм CHIR99021 (ингибитор GSK3).
    1. Весят 2 мг PD0325901 и добавьте 4.15 мл ДМСО во флаконе из темного стекла.
    2. Весят 2 мг CHIR99021 и добавьте 1,43 мл ДМСО во флаконе из темного стекла.
    3. Следующие растворения, хранить аликвоты (50 мкл/трубки в 200 мкл пробирках, ПЦР) при-20 ° C и защищены от света. Удаление трубка, содержащая замороженные запасы из морозильника и разморозить при комнатной температуре перед использованием.
  2. Весят 0.0176 g Vc 1 мл пластиковых пробирок и воссоздать его с 1 мл стерильной воды до конечной концентрации 100 мм до использования.
  3. Инактивирует FBS: Инкубируйте 500 мл FBS в водяной бане в 56 ° C за 30 мин.
  4. Подготовка 600 мл базовой среды для культивирования клеток мыши ES.
    1. Используйте бутылку DMEM/высокий средний глюкозы (500 мл) и удалить 40 мл.
    2. Дополнение 460 мл DMEM/высокий средний глюкозы с 20% инактивированная FBS (120 мл), 1000 ед/мл LIF (60 мкл 107 ед/мл Стоковый раствор), 0,1 мм несущественные аминокислот (NEAA) (6 мл 10 мм раствор), пируват натрия 1 мм (6 мл Стоковый раствор 100 мм) , 2 мм L-глютамин (6 мл 200 мм раствор), 0,1 мм β-меркаптоэтанол (600 мкл Стоковый раствор 100 мм) и 33 МЕ/мл пенициллина и стрептомицина 33 мкг/мл (2 мл пенициллин стрептомицином смешанного раствора (10 000 МЕ/мл пенициллина и стрептомицина 10 000 мкг/мл)) . Определите основные среды как сыворотки среднего.
    3. Пипетка 50 мкл Стоковый раствор PD0325901 (1,0 мм) и Vc (100 мм), соответственно, в 50 мл сыворотки среды (конечная концентрация: 1.0 мкм PD0325901 и 100 мкм Vc) и определить средство как Vc/PD0325901 среды.
      Примечание: Подготовьте средних свежих Vc/PD0325901 перед использованием из-за нестабильности Vc.
    4. С помощью пипетки, передачи 50 мкл Стоковый раствор PD0325901 (1,0 мм) и CHIR99021 (3,0 мм), соответственно, в 50 мл сыворотки среды (конечная концентрация: PD0325901 1.0 мкм и CHIR99021 3,0 мкм) и определить средства как 2i среднего.
  5. Готовить блюда желатин покрытием.
    1. Подготовьте 0,1% раствор желатина: растворить в 300 мл ультрачистая вода в стеклянной бутылке реагента с крышкой 0,3 г желатина и стерилизовать в автоклаве при температуре 121 ° C для хранения 20 мин стерильный раствор при комнатной температуре.
    2. Проинкубируйте блюда культуры клеток (диаметр 6 см) с 2 мл 0,1% раствора желатина для 15 мин при комнатной температуре и затем аспирационная желатин. Сухие блюда в воздухе и использовать их в течение 12 ч.
  6. Подготовка 10 мл клетки мыши ES замораживания среды в пластиковых пробирок 15мл: 90% FBS (9 мл) и 10% ДМСО (1 мл). Используйте средство в течение 1 дня.
  7. Подготовить заморозки контейнера: добавить 100% изопропиловый спирт до линии заполнения контейнера, замораживания и отбросить старые изопропиловый спирт. Добавьте новые изопропиловый спирт непосредственно после использования каждый пятый.
  8. Сделать буфер ферментативного пищеварения: вес 1.2114 г трис порошка в 100 мл ультрачистая вода подготовить 100 мм трис раствор и добавить концентрированный раствор HCl (около 12 М) в решение трис для регулировки рН 7,6 (около 0,6 мл концентрированный раствор HCl).
  9. Подготовка 50 мл буфера assay иммунопреципитации радио (Буфер RIPA): 20 мм трис, рН 7,4, 1 мм MgCl2, 150 NaCl, 20% глицерина, 0,5% NP40, 1 мм ЭДТА, 1 мм EGTA. Дополнение с 1 мм DTT, 1 X ингибитор протеазы коктейль и 1 мм PMSF до использования. После добавления PMSF используйте буфер в течение 30 мин.

2. рост клеток ES мыши на желатин покрытием блюда

  1. Предварительно теплой мыши ES клеток (дикого типа, 129 SvEv) культура среднего, трипсина и раствора фосфатного буфера (PBS) в водяной бане при температуре 37 ° C.
  2. Проход клетки. Аспирационная средне полностью от блюдо и пипетки 2 мл PBS блюда для полоскания клетки.
    1. Удаление PBS с пипеткой и вымыть клетки снова с 2 мл ФСБ.
    2. Удаление PBS и добавление 0,3 мл трипсина-ЭДТА (0,25%) в каждое блюдо.
    3. Быстро охватывают весь блюдо с трипсина и затем удалите его сразу же.
    4. Поместите блюдо в инкубаторе при 37 ° C за 1 мин до отсоединения клетки от блюдо. Возьмите блюда из инкубатора и добавить 2 мл среды подогретым сыворотки прекратить действие трипсина.
    5. Отмежеваться колоний ячеек в одну ячейку подвеска, resuspending с пипеткой (5 мл наконечник пипетки) в 10 раз.
  3. Перевести 150 мкл 2 мл раствора клеток (около 190 000 клеток путем подсчета с Горяева) в новое блюдо желатин покрытием и дополнить с 3 мл свежеприготовленной Vc/PD0325901 среды в 6 см культуры блюдо. Культура клетки в инкубаторе 37 ° C с 5% CO2.
  4. Каждые 24 часа во время инкубации, удалите старый питательной среды и добавить 3 мл свежего Vc/PD0325901-средних в культуры блюдо из-за нестабильности confluency Vc. Expect 70 – 80% после 2-3 дня.
  5. После достижения 70-80% confluency, проход клетки и продолжать культура их как описано в шагах 2.2-2.4.

3. Замораживание и размораживание мыши ES клеток

  1. Замораживание клеток мыши ES.
    1. Отсоедините клетки от блюда с трипсином, выполнив шаг 2.2.
    2. Перенесите клетки в 15 мл пластиковых труб и центрифуги на 800 x g и комнатной температуре 3 мин.
    3. Дамп супернатант мягко в стакан и Ресуспензируйте клетки лепешка с 1 мл раствора свежеприготовленные замораживания среднего. Подготовьте замораживание среднего 30 мин до этот шаг, чтобы убедиться, что это комнатной температуре перед использованием.
    4. Клетки в замораживания среднего к трубе microcentrifuge 1.8 мл с пипеткой 1 мл перехода и место пробки microcentrifuge в контейнер замораживания. Добавление изопропиловый спирт до линии заполнения контейнера, замораживания и держать его при комнатной температуре перед использованием.
    5. Оставьте на ночь морозильные контейнеры в морозильной камере-80 ° С.
    6. Передача microcentrifuge трубы к контейнеру жидкого азота на срок до 2-3 лет.
      Примечание: Не держите клетки в среде замораживания на долгое время и быстро передавать клетки в морозильной камере-80 ° C из-за токсичности ДМСО.
  2. Размораживание мыши ES клеток.
    1. Предварительно теплой 50 мл сыворотки среды в ванну воды 37 ° C.
    2. Взять из клеток содержащих флакон из контейнера жидкого азота и погружать ограничен флакона в ванну воды 37 ° C. Быстро встряхните его в водяной бане таять. Перенесите клетки в 15 мл с пипеткой 1 мл. Добавьте 2 мл сыворотки подогретым питательной среды в пробирку для разбавления замораживание среднего и затем центрифуги на 800 x g и комнатной температуре 3 мин.
    3. Удалить супернатант и нежно ресуспензируйте клетки окатышей с 3 мл свежего Vc/PD0325901 среды с помощью пипетки 5 мл.
    4. Передать желатин покрытием блюдо клетки из 15 мл трубки и культура клетки для 24 h. Культура клетки снова, как описано в шаге 2.

4. извлечение общего белка из клетки

  1. Промойте собранные клетки с 1 мл раствора PBS и затем центрифуги на 800 x g и комнатной температуре 3 мин.
  2. Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте Пелле клетки тщательно с Буфер RIPA дополнена с DTT, ингибитор протеазы коктейль и PMSF закупорить осторожно. Объем Буфер RIPA составляет около 5 x, что ячейки Пелле.
    Примечание: Выполняют клетки ресуспендирования на льду.
  3. Держите клетки в буфер RIPA 30 мин на льду и центрифуги на 13 000 x g и 4 ° C за 5 мин.
  4. Супернатант передать новой трубки и хранить аликвоты-80 ° c.
  5. Определите концентрацию белка с комплектом assay протеина Брэдфорд.

5. извлечь ДНК из клетки и ДНК дайджест в одном нуклеозидов, используя ферменты

  1. Соберите клетки с трипсином, как описано в шагах 3.1.1 и 3.1.2.
  2. Выполните экстракции ДНК с геномной ДНК очистки комплект следуя инструкциям производителя.
  3. Храните ДНК в 1-мл пробирок. 100 мкл ультрачистая вода в пластиковых пробирок и распустить ДНК, закупорить около 15 раз. Определить концентрацию и оценить качество ДНК путем измерения оптической плотности на 260 Нм и 280 Нм15. Концентрация ДНК составляет около 500 нг/мкл.
  4. Digest 5 мкг ДНК в системе 50 мкл раствора: 5 мкл 100 мм трис-HCl раствор, рН 7,6 (конечная концентрация: 10 мм), 2 U икры кишечной фосфатазы, 1 U DNase I, 0,005 U змея яд фосфодиэстеразы, I и 5 мкг ДНК (рассчитать добавлены тома по данным измерения красный концентрации ДНК, ~ 10 мкл) в пластиковых пробирок и увеличить объем раствора до 50 мкл с ультрачистая вода. Инкубируйте смесь при 37 ° C на ночь. Центрифуга переваривается решение ДНК на 1000 g и комнатной температуре в течение 1 мин для сбора раствора в нижней части трубы.
  5. Перевести переваривается решение ДНК из пробирок на ультрафильтрации трубы (вес молекулы среза: 3 кДа) и центрифуги на 13000 g и 4 ° C на 30 минут, чтобы удалить ферменты пищеварения.
  6. Подготовка пробы для анализа 5мс и 5hmC.
    1. Для 5hmC анализа: Пипетки 36 мкл раствора фильтр для новых центрифуг (1 мл) и мкл 4 5'-(hydroxymethyl-d3)-2'-Дезоксицитидин ([D3]-5hmC) с конечной концентрации 3 Нм.
    2. Для анализа 5мс: добавить 196 мкл ультрачистая вода в новых пластиковых пробирок и пипетки 4 мкл раствора фильтр к трубе (разбавления производится), из-за высокой плотности 5мс в геномной ДНК. Перевести 36 мкл разбавленного раствора для новых пластиковых пробирок и 4 мкл (5'-(methyl-d3)-2'-Дезоксицитидин ([D3]-5мс) с конечной концентрации 50 Нм. Используйте [3D]-5hmC и [D3]-5мс как внутренний стандарт для калибровки 5hmC и 5мс, соответственно.
  7. Пример решения передать измерительных трубок и хранить при 4 ° C. Анализируйте 5мс и 5hmC с ультра-высокой производительности жидкого хроматографии тройной квадрупольного масс-спектрометрии с несколькими реакция мониторинг (UHPLC-MS/MS (MRM)), как описано в предыдущем докладе15.

6. анализ 5мс и 5hmC с помощью UHPLC-MS/MS15

  1. Настройка различных параметров для анализа 5мс и 5hmC с помощью программного обеспечения UHPLC-MS.
    1. Создать новый метод. Открытое программное обеспечение и нажмите кнопку «файл | Новые | Метод». Экспонат окно сообщения «Редактора метода» с содержанием «Вы хотите сохранить изменения для текущего метода» и нажмите кнопку «Нет».
    2. Создайте параметры сэмплер. Нажмите кнопку «сборники | Настройка | Инъекция». Выберите «Стандартные инъекция» и ввода «5 мкл на объем впрыска».
    3. Создание параметров насоса в UHPLC.
      1. Нажмите кнопку «BinPump2 | Установка» для создания параметров насоса. Настройка «Поток» в «0,25 мл/мин» и «Остановить время» в «15 минут».
      2. Настройка «Растворителя B 5%» и «Ограничения давления» на «Макс 600 бар».
      3. Нажмите кнопку «BinPump2 | Расписание «построить Изократические элюции параметров для анализа 5мс. Нажмите кнопку «Добавить» для добавления строки. Ввод «0.00» на «Время» и «5.0» на «B %». Нажмите кнопку «Добавить» еще раз, чтобы добавить новую строку. Ввод «15.00» на «Время» и «5.0» на «B %».
      4. Нажмите кнопку «BinPump2 | Расписание» для создания градиента элюции параметры для 5hmC анализа. Нажмите кнопку «Добавить для добавления строки. Ввод 0.00 в время и 5.0 на «B %». Нажмите кнопку «Добавить» еще раз, чтобы добавить новую строку. Ввод «3.00» на «Время» и «5.0» на «B %». Нажмите кнопку «Добавить» для другого 6 раз для добавления 6 строк. Ввод «3.01» на «Время» и «15,0» на «B %», «6.00» на «Время» и «15,0» на «B %», «6.01» на «Время» и «100» на «B %», «10.00» на «Время» и «100,0» на «B %», «10.01» на «Время» и «5.0» на «B %», «15.00» на «Время» и «5.0» на «B %» в последовательности.
        Примечание: Анализ 5мс и 5hmC индивидуально из-за разделения различных условий UHPLC.
    4. Создание параметров температуры в салоне столбца (TCC) в UHPLC.
      Нажмите кнопку «TCC | Настройка | Температура (слева)» и «30 ° C».
    5. Устанавливают параметры QQQ-МС/МС.
      1. Нажмите кнопку «MS QQQ | Остановить время | Нет предела/как насос», «источник ионов | ESI», «время фильтрации | Пик ширина: 0.07 мин». Настройка «время сегментов: время начала: 0»; «Тип сканирования: MRM»; «Div значение: МС»; «Дельта EMV (+): 200» и «Дельта EMV (-): 0».
      2. Создать параметры мониторинга переходы 5мс, Д3-5мс, dC, 5hmC и D3-5hmC
        1. Нажмите кнопку «MS QQQ | Приобретение | Сканировать сегменты: жить: 90"; «Fragmentor: 90»; «Энергия столкновения: 5»; «Сотовый ускоритель напряжения: 4» и «полярность: положительное».
        2. Ввод «5мс» на «Составное имя», «242» на «Прекурсор Ион», «126» на «Продукт Ион» для анализа 5мс. Щелкните правой кнопкой и выберите «Добавить строку» для добавления новой строки. Ввод «D3-5мс» на «Составное имя», «245» на «Прекурсор Ион», «129» на «Продукт Ион» для D3-5мс анализ.
        3. Дополнить еще три строки, используя тот же режим. Вклад «dC» в «Составное имя», «228» на «Прекурсор Ион», «112» в «Продукт Ион» для анализа dC. Ввод «5hmC» на «Составное имя», «258» на «Прекурсор Ион», «142» на «Продукт Ион» для 5hmC анализа. Вход D3-5hmC на составное имя, «261» на «Прекурсор Ион», «145» на «Продукт Ион» для D3-5hmC анализ.
      3. Создайте параметры источника газа. Нажмите кнопку «MS QQQ | Источник | Исходные параметры: газ температура: 300 ° C»; «Газовый поток: 11 Л/мин»; «Небулайзер: 15 psi»; «Положительные капиллярная: 3500 V».
      4. Сохраните предложенного метода. Нажмите кнопку «MS QQQ | Инструмент | Save метод как». Выберите путь для предложенного метода, «Справочник» и присвойте имя для метода путем ввода содержимого в «Метод», например: 5мс и 5hmC анализ.
  2. Разделение UHPLC и МС/МС анализ mononucleosides
    1. Подготовка этапа мобильных 5мс и цитозином (C) анализ: этапа мобильные решения A и B. раствор A: 500 мл ультрачистая вода с 500 мкл муравьиной кислоты (конечная концентрация: 0.1%) и раствор B: 500 мл 100% метанола. Mix решение A и B в 95:5 (v: v) как на мобильный этапе элюировать 5мс и C (набор в шаге 6.1.3.3). Установите скорость потока в 0,25 мл/мин (набор в шаге 6.1.3.1).
    2. Подготовка этапа мобильных растворителей A и B для 5hmC анализа. Растворителем является 2,0 мм NH4HCO3 водный раствор (pH 9.0) (500 мл), и растворителей B является 100% метанола (500 мл). Отдельные 5hmC по оптимизированной градиента Элюирование: 0-3 мин, 5.0% B и 95% A (v: v); 3-6 мин, 15,0% B и 85% A; 6-10 мин, 100% B; 10-15 мин, 5.0% B и 95% (набор в шаге 6.1.3.4). Установите скорость потока в 0,25 мл/мин (набор в шаге 6.1.3.1).
  3. Использовать электроспрей МС/МС с Записями режим (на шаге 6.1.5.1) для анализа элюции из столбца и принять режим положительный ион (набор в шаге 6.1.5.2.1).
    1. Отслеживать переходы: 5мс, m/z 242→126 (энергию столкновения, 5 eV); [D3]-5мс, 245→129 m/z (5 eV); dC, 228→112 m/z (5 eV); 5hmC, 258→142 m/z (5 eV); [D3]-5hmC, 261→145 m/z (5 eV) (набор в шаге 6.1.5.2.2).
    2. Установите капилляров и фрагмент напряжений в +3,500 V (набор в шаге 6.1.5.3) и 90 V (набор в шаге 6.1.5.2.1), соответственно.
    3. Объем впрыска на 5 мкл и анализировать каждый образец 3 раза (набор в шаге 6.1.2). Использовать соответствующие стандартные кривые оценить количество 5мс и 5hmC.
      1. Создание стандартной кривой 5мс: передачи 1 – 50 Нм (1, 5, 10, 20, 50 Нм, конечная концентрация) стандартный раствор 5мс в центрифуге трубки и добавить 50 Нм [3D]-5мс труб. Дополнение общий объем до 50 мкл. анализ стандартных 5мс следуя инструкциям для 5мс образца (шаг 6).
      2. Построение калибровочной кривой 5hmC: передачи 1 – 20 Нм (1, 2, 5, 10, 20 Нм, конечная концентрация) стандартный раствор 5hmC центрифуга трубы и добавить 3 Нм [3D]-5hmC к трубкам. Дополнение общий объем до 50 мкл. анализ стандартных 5hmC после инструкции для 5hmC образца (шаг 6).

7. анализ статистической значимости

  1. Выполните статистический анализ с использованием программного обеспечения.
    1. Откройте программу и выберите «Столбец» в «Новая таблица и график». Установите параметры следующим образом: «образец данных | Начать с пустой таблицей»; «Выбрать график первый режим»; «Построение графиков реплицирует или погрешностей | Земельный участок | Значит, с SEM».
    2. Нажмите кнопку «Создать», чтобы ввести три реплицирует группы управления и Vc/PD0325901-лечение в строке «A» и «B», соответственно. Выберите шесть данные и нажмите кнопку «Анализировать» в «Анализа».
    3. В «Столбец анализа» выберите «t тесты (и непараметрических тестов)» и нажмите кнопку «ОК», чтобы войти в следующий интерфейс.
    4. Установите параметры следующим образом: «выбрать тест | Имя теста | Непарные t -тест; Параметры | 2 хвост»; «Доверительные интервалы: 95%»; «Значащих цифр | Показать 4 значащих цифр». Нажмите кнопку «ОК», чтобы получить значение p между режимом управления и Vc/PD0325901.
  2. Оценка статистической значимости между элементом управления и экспериментальных групп, используя двустороннее и непарных студент t-теста16.
    Примечание: p < 0,05 означает разницу, обладающие статистической значимости. * p < 0,05, ** p < 0.01, *** p < 0,001.

Результаты

VC/PD0325901 синергетически индуцированной глобальной стирания мыши ES клеток. Мышь ES клеток в сыворотке экспонат гиперметилирование ДНК, в то время как клетки pluripotent ICM и PGCs Показать глобальные стирания метилирования и состояние hypomethylated тесно связан с их плюрипотентности

Обсуждение

В работе мы продемонстрировали новый метод сочетания Vc и PD0325901 для поддержания клеток мыши ES в недифференцированных и hypomethylated состоянии, которое было достигнуто путем синергических действий поощрения ДНК деметилирования, Vc и подавления de novo ДНК Метилирование по PD0325901. Кроме того к...

Раскрытие информации

Авторы раскрывают не потенциальные конфликты интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальный фонд Китая естественных наук (21435008 и 21327006 в США) и стратегических приоритетных исследований программа Китайской академии наук (XDB14030200 Г.У).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
fetal bovine serum Australia sourceCorning35-076-CVComponent of mouse ES cell medium
DMEM/high glucoseHycloneSH30022Component of mouse ES cell medium
LIFMilliporeESG1107Component of mouse ES cell medium
non-essential amino acids (NEAA)Gibco11140050Component of mouse ES cell medium
sodium pyruvateGibco11360070Component of mouse ES cell medium
L-glutamineGibco25030081Component of mouse ES cell medium
penicillin streptomycin solutionGibco15140122Component of mouse ES cell medium
PBSSigmaP5493Cells rinse
trypsinHycloneSH30042Cell dissociation
gelatinSigma48722Dishes coating
PD0325901Stemolecule04-0006-10small-molecule chemical for cell culture
CHIR99021Stemolecule04-0004small-molecule chemical for cell culture
vitamin CSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd XW00508171small-molecule chemical for cell culture
Ultra Bioscience water purification systemrPurelabUltraUltra water
DMSOSigmaD8418Cell freezing medium
centrifugerEppendorf5427RDNA and protein extraction
protease inhibitor cocktailSigmaP8340Component of RIPA buffer
PMSF Protease InhibitorThermoFisher Scientific36978Component of RIPA buffer
DTTSigma43815Component of RIPA buffer
EGTASigmaE3889Component of RIPA buffer
Genomic DNA Purification Kit PromegaA1125Genomic DNA extraction
NanoDrop 2000ThermoFisher ScientificNanoDrop 2000Determination of DNA concentration
calf intestinal phosphataseNew England BiolabsM0290DNA digestion
DNase INew England BiolabsM0303DNA digestion
snake venom phosphodiesterase ISigmaP4506DNA digestion
Nanosep 3K OmegaPallOD003C35filtration of digested DNA
1290 UHPLC systemAgilent 1290UHPLC separation
G6410B triple quadrupole mass spectrometerAgilent G6410BMS/MS analysis
Zorbax Eclipse Plus C18 columnAgilent Zorbax Eclipse Pluscolume for UHPLC separation
5-methylcytosineSolarbio Life SciencesSM8900 standard 5mC
5-hydroxymethylcytosine (standard)Toronto Research ChemicalsM295900standard 5hmC
Prdm14 antibodybioworldBS7634Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3a antibodybioworldBS6587Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3b antibodyabcamab13604Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3l antibodyabcamab3493Western blot analysis-primary antibody
Dnmt1 antibodyabcamab13537Western blot analysis-primary antibody
β-tubulin antibodybioworldBS1482MHWestern blot analysis-primary antibody
goat anti-rabbit IgGabcamab6721Western blot analysis-secondary antibody
goat anti-mouse IgGabcamab6789Western blot analysis-secondary antibody
TrizolInvitrogen15596-026RNA extraction
reverse transcription systemPromegaA3500RNA reverse transcription
GoTaq qPCR Master MixPromegaA6001RT-PCR
StemTAG alkaline phosphatase staining and activity assay kitCells Biolabs, Inc.CBA-302 alkaline phosphatase staining analysis
mouse ES cells: WT, 129 SvEvProvided by Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China)cell strain of mouse ES cells
microscopeZeissLSM510cells observation
GraphPad Prism 5.0GraphPad Prism Software Inc.5.0statistical analysis

Ссылки

  1. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
  2. Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 435-462 (2001).
  3. Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
  4. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78 (12), 7634-7638 (1981).
  5. Eiselleova, L., et al. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int. J. Dev.Biol. 52 (4), 353-363 (2008).
  6. Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).
  7. Tamm, C., Galitó, S. P., Annerén, C. A comparative study of protocols for mouse embryonic stem cell culturing. Plos One. 8 (12), e81156 (2013).
  8. Yamaji, M. PRDM14 ensures naive pluripotency through dual regulation of signaling and epigenetic pathways in mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 368-382 (2013).
  9. Ficz, G., et al. FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency. Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).
  10. Smith, Z. D., et al. A unique regulatory phase of DNA methylation in the early mammalian embryo. Nature. 484 (7394), 339-344 (2012).
  11. Ying, Q. L., Nichols, J., Chambers, I., Smith, A. BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3. Cell. 115 (3), 281-292 (2003).
  12. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  13. Leitch, H. G., et al. Naive pluripotency is associated with global DNA hypomethylation. Nat. Struct. Mol. Biol. 20 (3), 311-316 (2013).
  14. Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).
  15. Yin, R., et al. Ascorbic acid enhances Tet-mediated 5-methylcytosine oxidation and promotes DNA demethylation in mammals. J. Am. Chem. Soc. 135 (28), 10396-10403 (2013).
  16. Guerra, A. D., Rose, W. E., Hematti, P., Kao, W. J. Minocycline modulates NFκB phosphorylation and enhances antimicrobial activity against Staphylococcus aureus in mesenchymal stromal/stem cells. Stem Cell Res. Ther. 8 (1), 171 (2017).
  17. Blaschke, K., et al. Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells. Nature. 500 (7461), 222-226 (2013).
  18. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
  19. Wu, H., Zhang, Y. Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5-methylcytosine oxidation. Genes Dev. 25 (23), 2436-2452 (2011).
  20. Inoue, A., Zhang, Y. Replication-dependent loss of 5-hydroxymethylcytosine in mouse preimplantation embryos. Science. 334 (6053), 194 (2011).
  21. He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).
  22. Maiti, A., Drohat, A. C. Thymine DNA glycosylase can rapidly excise 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine: Potential implications for active demethylation of CpG sites. J. Biol. Chem. 286 (41), 35334-35338 (2011).
  23. Habibi, E., et al. Whole-genome bisulfite sequencing of two distinct interconvertible DNA methylomes of mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (3), 360-369 (2013).
  24. von Meyenn, F., et al. Impairment of DNA methylation maintenance is the main cause of global demethylation in naive embryonic stem cells. Mol. Cell. 62, 848-861 (2016).
  25. Li, C., Liu, B., Zhong, S., Wang, H. MEK inhibitor PD0325901 and vitamin C synergistically induce hypomethylation of mouse embryonic stem cells. Oncotarget. 7 (26), 39730-39739 (2016).
  26. Hackett, J. A., et al. Synergistic mechanisms of DNA demethylation during transition to ground-state pluripotency. Stem Cell Reports. 1 (6), 518-531 (2013).
  27. Nakaki, F., Saitou, M. PRDM14: a unique regulator for pluripotency and epigenetic reprogramming. Trends Biochem. Sci. 39 (6), 289-298 (2014).
  28. Nichols, J., Smith, A. Pluripotency in the embryo and in culture. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4 (8), (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

136CPD0325901hypomethylationPrdm14

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены