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Resumo

Descrevemos em detalhes dois protocolos de base química para cultivo de células-tronco embrionárias do mouse. Esse novo método utiliza mecanismos sinérgicos de promover oxidação mediada por Tet (vitamina C) e reprimindo a síntese de novo de 5-metilcitosina (por PD0325901) para manter o DNA hypomethylation e pluripotência das células-tronco embrionárias do mouse.

Resumo

Células-tronco embrionárias (ES) têm o potencial de se diferenciar em qualquer uma das três camadas germinativas (ectoderma, mesoderma ou endoderme) e podem gerar muitas linhagens para medicina regenerativa. ES célula cultura em vitro tem sido objecto de preocupação generalizada. Classicamente, pilhas do rato ES são mantidas no fator inibitório de soro e leucemia (LIF)-contendo meio. No entanto, sob condições de soro/LIF, células mostram heterogeneidade na morfologia e o perfil de expressão de genes relacionados ao pluripotência e estão principalmente em um estado metaestável. Além disso, células cultivadas de ES exibem hypermethylation global, mas células de ES ingênua da massa celular interna (ICM) e as células germinativas primordiais (PGCs) estão em um estado de hypomethylation global. O estado de hypomethylated do ICM e PGCs está intimamente associado com sua pluripotência. Para melhorar os métodos de cultura de células de rato ES, recentemente foi desenvolvido um novo método baseado na utilização seletivamente combinada de dois compostos da pequeno-molécula para manter o estado de hypomethylated e pluripotentes de DNA. Aqui, apresentamos que co tratamento da vitamina C (Vc), e a PD0325901 podem apagar cerca de 90% de 5-metilcitosina (5mC) em 5 dias em pilhas do ES do rato. O conteúdo gerado 5mC é comparável em PGCs. A investigação mecanicista mostra que PD0325901 acima-regula a expressão Prdm14 para suprimir Dnmt3b (de novo DNA metiltransferase) e Dnmt3l (o cofator de Dnmt3b), reduzindo a síntese de novo de 5mC. Vc facilita a conversão de 5mC 5-Hidroximetilcitosina (5hmC) catalisada principalmente por Tet1 e Tet2, indicando o envolvimento de demethylations de DNA passivas e ativas. Além disso, em condições de Vc/PD0325901, pilhas do ES do rato mostram morfologia homogênea e estado pluripotentes. Coletivamente, propomos um método de cultura química-sinergia para alcançar o DNA hypomethylation e manutenção da pluripotência em células de rato ES e romance. O pequeno-molécula dependente químico método supera as principais deficiências da cultura de soro e a promessa de porões para gerar células homogêneas de ES para novas aplicações clínicas e pesquisas.

Introdução

Pilhas do ES são originadas do ICM de um blastocisto1. As células estão em um estado de pluripotência e podem formar todas as linhagens somáticas e de células da linha germinal2. Estabelecimento de células ES fornece a oportunidade de investigar o desenvolvimento processa-se em vitro e pode gerar células de relevância médica para medicina regenerativa, com base na sua pluripotência3.

Dois grupos seminally estabeleceram as linhas de células de rato ES em 1981 e em células derivadas do embrião de rato foram cultivadas em soro fetal bovino (FBS)-contendo meio com fibroblastos embrionários de rato (MEFs) como o alimentador camada1,4 . MEFs foram inactivados mitotically e pre-foram cultivadas em pratos antes de cultivo de células ES. MEFs fornecem suporte para fixação de células de rato ES e produzir fatores de crescimento para promover a propagação e reprimir a diferenciação5, enquanto FBS oferece essenciais fatores tróficos e hormônios para proliferação celular. Estudos posteriores indicaram que LIF produzido pelas células do alimentador foi o cytokine chave para autorenovação e manutenção da pluripotência em células de rato ES, pode substituir a adição de LIF no meio de alimentador células6. Atualmente, a sustentação do rato de pilhas do ES no meio de FBS/LIF em alimentadores ainda é o método padrão adotado por muitos pesquisadores. No entanto, alguns problemas surgem com esta abordagem da cultura clássica. Em primeiro lugar, alimentador células secretam fatores excessiva e descontroladas... e podem causar contaminação patogénica7. Para evitar esta interferência, revestir a superfície dos pratos com gelatina e a adição de LIF em soro contendo médio são métodos alternativos para a manutenção de células de rato ES sem células alimentador-camada. Além disso, células de rato ES cultivadas sob condições de soro/LIF apresentam heterogeneidade morfológica em populações de células e mesmo no nível de expressão de fatores relacionados a pluripotência8. Estudos recentes sugerem que, em condições de soro/LIF, os fatores de transcrição do núcleo pluripotência relacionados (incluindo OCT4, SOX2 e Nanog) podem sustentar a pluripotência através de LIF e WNT sinalização; no entanto, nomeadamente, eles também ativar um sinal de (FGF) do fator de crescimento fibroblástico para desencadear a diferenciação8. Devido à ação dupla ambivalente os núcleo de factores de transcrição, o rato ES células cultivadas no soro apresentam heterogeneidade, consistindo de duas populações intercambiáveis, um semelhante ao ICM e outro parecido com o epiblasto aprontada estado8. Além disso, as células de rato ES no soro muitas vezes apresentam hypermethylation global9, Considerando que ICM e PGCs estão em um estado de hypomethylated global, que está intimamente ligado com sua pluripotência9,10.

Há uma demanda considerável para desenvolver novos métodos de cultivo de células de rato ES. Foram estabelecidos vários protocolos melhorados desde 200311 mas continua a haver algumas limitações e deficiências7. Desde 2008, a utilização combinada de dois inibidores da quinase da pequeno-molécula, PD0325901 (inibidor de quinase da proteína mitogen-ativado (MAPK) / extracelular-sinal-regulada quinase (ERK) (MEK)) e CHIR99021 (inibidor de glicogénio sintase quinase 3 (GSK3)), em N2B27 médio com LIF e sem soro, abriu novas perspectivas para células de rato cultivo ES12. Este novo meio definido é caracterizado pelo uso de dois inibidores (2i). ES de mouse células cultivadas em meio de 2i/LIF são mais homogêneas em populações de células e a expressão de fatores de pluripotência. Além disso, pilhas do rato 2i/LIF-cultivadas ES apresentam DNA hypomethylation globalmente, que está mais perto de células ICM9,13. Mesmo assim, a cultura de 2i tem suas desvantagens. PD0325901 e CHIR99021 são insolúveis em água e geralmente dissolvem-se em dimetilsulfóxido (DMSO)-com base em solução para adicioná-los em meio de cultura. Estudos mostram que a longo prazo e baixa dose de exposição das células ao DMSO pode levar a citotoxicidade14.

Aqui, utilizamos dois compostos da pequeno-molécula e desenvolveu um novo método de cultura de células de rato ES. O método de cultura novela combina Vc e MEK inibidor PD0325901 para promover o DNA hypomethylation rapidamente e eficazmente a um nível comparável de PGC, nomeado como o protocolo de cultivo Vc/PD0325901. Pilhas do mouse ES em Vc/PD0325901-adicionado meio contendo soro apresentam homogeneidade na morfologia e são sustentadas em um estado fundamental. Comparado a cultura 2i, cultivadas sob condições de Vc/PD0325901 de pilhas do rato ES exibem cinética mais rápida da demetilação do ADN e podem atingir o nível de hypomethylation comparável do PGC. Além disso, o uso de um único inibidor (PD0325901) diminui a entrada quantidade de DMSO em média em comparação com que usado em 2i (PD0325901/CHIR99021) e reduz os danos às células.

Protocolo

1. preparações

  1. Preparar uma solução de 1,0 mM PD0325901 (inibidor MEK) e 3,0 mM CHIR99021 (inibidor de GSK3).
    1. Pesar 2 mg de PD0325901 e adicionar em um frasco de vidro âmbar 4,15 mL de DMSO.
    2. Pesar de 2 mg de CHIR99021 e adicionar 1,43 mL de DMSO em um frasco de vidro âmbar.
    3. Reconstituição de seguir, armazenar alíquotas (50 µ l/tubo em 200 tubos PCR µ l) a-20 ° C e protegido da luz. Remova um tubo contendo o estoque congelado de um freezer e descongelar à temperatura ambiente antes do uso.
  2. Pesar 0,0176 g de Vc em 1 mL de um tubo de centrífuga e reconstitui-lo com 1 mL de água estéril para uma concentração final de prévia de 100 mM para usar.
  3. Inactivar FBS: incube 500ml de FBS num banho de água a 56 ° C durante 30 min.
  4. Prepare-se para cultivo de células de rato ES 600 mL do meio de base.
    1. Utilize um frasco de meio de glicose DMEM/alto (500 mL) e remover 40 mL.
    2. Suplemento 460 mL de DMEM/alto médio de glicose com 20% inactivadas FBS (120 mL), 1.000 U/mL LIF (60 µ l de 107 U/mL de solução), 0.1 mM não aminoácidos essenciais (timina) (6 mL de solução-mãe de 10mm), piruvato de sódio 1 mM (6 mL de solução estoque de 100 mM) , 2 mM L-glutamina (6 mL de solução-mãe de 200 mM), 0.1 mM β-mercaptoetanol (600 µ l da solução estoque de 100 mM) e 33 UI/mL penicilina e estreptomicina 33 de µ g/mL (2 mL de penicilina-estreptomicina mistura solução (10.000 UI/mL penicilina e estreptomicina 10.000 de µ g/mL)) . Defina o meio básico como meio de soro.
    3. Pipete 50 µ l de solução-mãe de PD0325901 (1,0 mM) e Vc (100 mM), respectivamente, em 50 mL do meio de soro (concentração final: 1,0 µM PD0325901 e Vc de 100 µM) e definir o meio como Vc/PD0325901 médio.
      Nota: Prepare o fresco médio Vc/PD0325901 antes de usar devido à instabilidade de Vc.
    4. Utilizando uma pipeta, transfira 50 µ l de solução-mãe de PD0325901 (1,0 mM) e CHIR99021 (3,0 mM), respectivamente, em 50 mL do meio de soro (concentração final: PD0325901 1.0 µM e CHIR99021 3.0 µM) e definir o meio como meio de 2i.
  5. Prepare os pratos de gelatina-revestido.
    1. Preparar a solução de gelatina de 0,1%: dissolver 0,3 g de gelatina em 300 mL de água ultrapura em um frasco de reagente de vidro com uma tampa e esterilizar em autoclave a 121 ° C por 20 min. loja a solução estéril à temperatura ambiente.
    2. Incubar os pratos de cultura celular (6 cm de diâmetro) com 2 mL de solução de gelatina 0,1% por 15 min à temperatura ambiente e em seguida aspirar a gelatina. Secar os pratos no ar e usá-los no prazo de 12 h.
  6. Prepare-se 10 mL de células de rato ES congelamento médio em um tubo de centrífuga de 15 mL: 90% FBS (9 mL) e 10% DMSO (1 mL). Utilize o meio dentro de 1 dia.
  7. Prepare um recipiente de congelação: Adicionar álcool isopropílico 100% para a linha de enchimento do recipiente de congelação e descartar o velho álcool isopropílico. Adicione novo álcool isopropílico diretamente após cada utilização de quinta.
  8. Fazer o tampão de digestão enzimática: pesar 1,2114 g de Tris pó em 100 mL de água ultrapura para preparar 100 mM Tris solução e adicionar concentrado solução de HCl (cerca de 12 metros) para a solução de Tris para ajustar o pH para 7,6 (cerca de 0,6 mL de solução concentrada de HCl).
  9. Prepare-se 50 mL de tampão de ensaio de imunoprecipitação de rádio (amortecedor de RIPA): 20 mM Tris, pH 7,4, 1 mM MgCl2, 150 mM de NaCl, glicerol 20%, 0,5% NP40, EDTA 1 mM, 1 mM EGTA. Suplemento com 1 mM DTT, 1 X coquetel de inibidor de protease e 1 mM antes PMSF de usar. Se adicionarmos a PMSF, use o tampão dentro de 30 min.

2. crescer pilhas do ES do Mouse em pratos de gelatina-revestido

  1. Cultura de células pre-quente do ES (tipo selvagem, SvEv 129) médio, tripsina e solução de tampão fosfato (PBS) em banho maria a 37 ° C.
  2. Passagem das células. Aspire a médio e a louça para lavar as células completamente do prato e pipeta 2 mL de PBS.
    1. Remover a PBS com uma pipeta e lavar as células novamente com 2 mL de PBS.
    2. Remover a PBS e adicionar 0,3 mL de tripsina-EDTA (0,25%) para cada prato.
    3. Cubra todo o prato com a tripsina rapidamente e depois removê-lo imediatamente.
    4. Coloque o prato em uma incubadora a 37 ° C por 1 min separar as células do prato. Retire os pratos da incubadora e adicione 2 mL do meio de soro pré-aquecido para encerrar a ação da tripsina.
    5. Dissocia as colônias de células em suspensão uma única célula por resuspending com uma pipeta (ponta da pipeta de 5 mL) 10 vezes.
  3. Transferência de 150 µ l de 2 mL da solução de célula (cerca de 190.000 células contando com um hemocytometer) para uma nova placa de gelatina-revestido e complementar com 3 mL de meio de Vc/PD0325901 feito recentemente por placa de cultura de 6 cm. Cultura de células em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO2.
  4. Todos os 24 h durante a incubação, remover o meio de cultura antigo e adicionar 3 mL de meio-Vc/PD0325901 fresco para o prato de cultura devido à instabilidade da confluência Vc. Expect 70 – 80% após 2-3 dias.
  5. Depois de alcançar a confluência de 70-80%, passagem das células e continuar a cultura-los conforme descrito nas etapas 2.2 – 2.4.

3. congelar e descongelar as células ES do Mouse

  1. Congele as células de rato ES.
    1. Separe as células desde os pratos com tripsina a seguir passo 2.2.
    2. Transferi as células em um tubo plástico de 15 mL e centrifugar 800 x g e temperatura de quarto por 3 min.
    3. Despejar o sobrenadante cuidadosamente para um copo e resuspenda o pellet de células com 1 mL de acabadas congelamento médio. Prepare o congelamento médio 30 min antes desta etapa para garantir que é a temperatura ambiente antes do uso.
    4. Transfira as células no meio de um tubo de microcentrifugadora de 1,8 mL com uma pipeta de 1ml de congelação e o tubo de microcentrifugadora em um recipiente de congelação. Adicionar álcool isopropílico para a linha de enchimento do recipiente congelação e mantê-lo em temperatura ambiente antes de usar.
    5. Deixe os recipientes de congelação durante a noite em um freezer-80 ° C.
    6. Transferi os tubos microcentrifuga para um recipiente de nitrogênio líquido para até 2 – 3 anos.
      Nota: Não manter as células no meio de congelação por um longo tempo e transferir rapidamente as células para um freezer-80 ° C, devido à toxicidade de DMSO.
  2. Pilhas do rato ES de descongelar.
    1. Pré-aqueça 50 mL de meio de soro em banho maria a 37 ° C.
    2. Pegue um frasco que contém a célula do contêiner de nitrogênio líquido e mergulhe o frasco tampado em banho maria a 37 ° C. Agitá-lo rapidamente em banho-maria para derreter. Transferi as células em um tubo de 15 mL com uma pipeta de 1 mL. Adicione 2 mL de meio de cultura de soro previamente aquecido dentro do tubo para diluir o meio de congelação e então centrifugar a x 800 g e a temperatura ambiente por 3 min.
    3. Remover o sobrenadante e ressuspender delicadamente as pelotas de célula com 3 mL de meio fresco Vc/PD0325901, usando uma pipeta de 5 mL.
    4. Transferir as células do tubo de 15 mL para um prato de gelatina-revestido e cultura as células por 24 h. cultura de células novamente como descrito na etapa 2.

4. extrair proteína Total de células

  1. Enxagúe as células coletadas com 1 mL de PBS e então centrifugar a x 800 g e a temperatura ambiente por 3 min.
  2. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o celular completamente com o amortecedor de RIPA suplementado com TDT, coquetel de inibidor de protease e PMSF pipetando suavemente. O volume de tampão RIPA é cerca de 5 x que da célula de Pelotas.
    Nota: Efectue a ressuspensão de célula no gelo.
  3. Manter as células no buffer RIPA por 30 min no gelo e centrifugar a 13.000 x g e 4 ° C por 5 min.
  4. Transferir o sobrenadante para um tubo novo e armazenar alíquotas a-80 ° C.
  5. Determine a concentração da proteína com um kit de ensaio de proteína de Bradford.

5. extrair DNA de células e DNA Digest em único nucleosídeo usando enzimas

  1. Colete as células com tripsina conforme descrito nas etapas 3.1.1 e 3.1.2.
  2. Realize a extração de DNA com um kit de purificação de DNA genômico seguindo as instruções do fabricante.
  3. Guarde o DNA extraído em tubos de centrifugação de 1 mL. Adicionar 100 µ l de água ultrapura no tubo de centrífuga e dissolver o DNA pipetando aproximadamente 15 vezes. Determinar a concentração e avaliar a qualidade do DNA por medição da absorvância em 260 nm e 280 nm15. A concentração de DNA é de cerca de 500 ng / µ l.
  4. Digest 5 µ g de DNA em um sistema de 50 µ l de solução: Adicione 5 µ l de solução de Tris-HCl, pH 7,6 a 100 mM (concentração final: 10 mM), 2 fosfatase intestinal de U bezerro, 1 U DNase I, 0.005 U cobra veneno fosfodiesterase, eu e 5 µ g de DNA (calcular o volume adicionado de acordo com a medição concentração de DNA vermelha, ~ 10 µ l) em um tubo de centrífuga e aumento do volume de solução a 50 µ l com água ultrapura. Incube a mistura a 37 ° C durante a noite. Centrifugue a solução de DNA digerida em 1.000 g e temperatura ambiente durante 1 min coletar a solução para o fundo do tubo.
  5. Transferir a solução de DNA digerida dos tubos de centrífuga para tubos de ultrafiltração (um peso de molécula corte: 3 kDa) e centrifugar a 13.000 g e 4 ° C, por 30 min remover as enzimas de digestão.
  6. Prepare as amostras para análise de 5mC e 5hmC.
    1. Para análise de 5hmC: Pipetar 36 µ l da solução de filtro para uma centrífuga de Nova tubo (1ml) e adicione 4 µ l de 5'-(hydroxymethyl-d3)-2'-deoxycytidine ([D3]-5hmC) com a concentração final de 3 nM.
    2. Para a análise de 5mC: Adicionar 196 µ l de água ultrapura para um novo tubo de centrifugação e pipetar 4 µ l da solução de filtro para o tubo (50-fold diluição), devido à alta densidade de 5mC no DNA genômico. 36 µ l da solução diluída de transferência para um novo tubo de centrífuga e adicione 4 µ l de (-(methyl-d3)-2'-deoxycytidine de 5' ([D3]-5mC) com a concentração final de 50 nM. Uso [D3]-5hmC e [D3]-5mC como padrão interno para calibrar 5hmC e 5mC, respectivamente.
  7. Transferir a solução de amostra para tubos de medição e armazenar a 4 ° C. Analise 5mC e 5hmC com ultraelevado-desempenho líquido cromatografia-triplo quadrupolo espectrometria de massa com Múltiplo-reação monitoramento (UHPLC-MS/MS (MRM)), conforme descrito no relatório anterior15.

6. analisar 5mC e 5hmC usando UHPLC-MS/MS15

  1. Configurar vários parâmetros para analisar 5mC e 5hmC usando o software de UHPLC-MS.
    1. Estabelece um novo método. Abra o software e clique em "arquivo | Novo | Método". Exibir a caixa de mensagem "Do Editor de método" com o conteúdo "Você quer salvar as alterações para o método atual" e clique em "Não".
    2. Construa os parâmetros do sampler. Clique em "Sampler | Instalação | Injeção". Selecione "Injeção padrão" e "5 µ l volume de injeção" de entrada.
    3. Construa os parâmetros da bomba em UHPLC.
      1. Clique em "BinPump2 | -Setup"para construir os parâmetros da bomba. Configure o "Fluxo" em "0,25 mL/min" e "Parar o tempo" a "15 min".
      2. Configurar o "Solvente B em 5%" e "Limites de pressão", no "bar Max 600".
      3. Clique em "BinPump2 | Calendário"para construir a isocrática parâmetros de eluição para análise de 5mC. Clique em "Append" para adicionar uma linha. Entrada "0,00" no "Tempo" e "5.0" em "% B". Clique em "Acrescentar" mais uma vez para adicionar uma nova linha. Entrada "15.00" no "Tempo" e "5.0" em "% B".
      4. Clique em "BinPump2 | Calendário"para construir os parâmetros de gradiente de eluição para análise de 5hmC. Clique em "Append para adicionar uma linha. Entrada 0,00 no tempo e 5.0 em "% B". Clique em "Acrescentar" mais uma vez para adicionar uma nova linha. Entrada "3,00" no "Tempo" e "5.0" em "% B". Clique em "Append" para outro 6 vezes adicionar 6 linhas. Entrada "3.01" no "Tempo" e "15,0" em "% B", "6,00" no "Tempo" e "15,0" em "% B", "6.01" no "Tempo" e "100" em "% B", "10,00", no "Tempo" e "100,0" em "% B", "10.01" no "Tempo" e "5.0" em "% B", "15.00" no "Tempo" e "5.0" em "% B" em sequência.
        Nota: Efectuar a análise de 5mC e 5hmC individualmente devido às condições de separação diferente de UHPLC.
    4. Construa os parâmetros da temperatura do compartimento da coluna (TCC) em UHPLC.
      Clique em "TCC | Instalação | temperatura (à esquerda) "e"30 ° C"de entrada.
    5. Estabelece os parâmetros do Queiroz-MS/MS.
      1. Clique em "MS Queiroz | Parar o tempo | Não limite/como bomba"," fonte de íon | ESI"," tempo de filtragem | Largura: 0,07 min ". Configurar "segmentos de tempo: hora de início: 0"; "Tipo de digitalização: MRM"; "Valor Div: A MS"; "Delta EMV (+): 200" e "Delta EMV (-): 0".
      2. Construir os parâmetros de monitoramento das transições de 5mC, D3-5mC, dC, 5hmC e D3-5hmC
        1. Clique em "MS Queiroz | Aquisição | Varredura de segmentos: habitar: 90"; "Fragmentor: 90"; "Energia de colisão: 5"; "Acelerador tensão da pilha: 4" e "polaridade: positivo".
        2. Entrada "5mC" no "Composto nome", "242", no "Precursor Ion", "126" no "Produto íon" para análise de 5mC. Clique com o botão direito e selecione "Adicionar a linha" para adicionar uma nova linha. Entrada "D3-5mC" no "Composto nome", "245" em "Precursor Ion", "129" de"produto" para D3-análise de 5mC.
        3. Outro suplemento três linhas usando o mesmo modo. "DC" no "Composto nome", "228" em "Precursor Ion", "112", de"produto" para análise de dC de entrada. Entrada "5hmC" no "Composto nome", "258" em "Precursor Ion", "142" de"produto" para análise de 5hmC. Entrada D3-5hmC no nome composto, "261" em "Precursor Ion", "145" de"produto" para D3-análise de 5hmC.
      3. Construa os parâmetros da fonte de gás. Clique em "MS Queiroz | Fonte | Parâmetros de origem: gás Temp: 300 ° C "; "Fluxo de gás: 11 L/min"; "Nebulizador: 15 libras por polegada quadrada"; "Positivo-capilar: 3500 V".
      4. Salve o método proposto. Clique em "MS Queiroz | Instrumento | Método como Save". Selecione um caminho para o método proposto pelo "Diretório" e dê um nome para o método inserindo o conteúdo no "Método", por exemplo: análise de 5mC e 5hmC.
  2. Separação de UHPLC e MS/MS análise de mononucleosides
    1. Preparar a fase móvel para 5mC e citosina (C) análise: formam a fase móvel da solução A e B. solução a: 500 mL de água ultrapura com 500 µ l de ácido fórmico (concentração final: 0,1%) e a solução b: 500 mL de metanol 100%. Misturar a solução A e B no 95:5 (v: v) como fase móvel a eluir 5mC e C (definido na etapa 6.1.3.3). Defina a taxa de fluxo em 0,25 mL/min (definido na etapa 6.1.3.1).
    2. Prepare a fase móvel por solvente A e B, para análise de 5hmC. A solvente é 2.0 mM NH4HCO3 aquoso (pH 9,0) (500 mL), e o solvente B é 100% de metanol (500 mL). 5hmC separadas por uma eluição gradiente otimizada: 0-3 min, 5,0% B e 95% por (v: v); 3-6 min, 15,0% B e 85% A; 6-10 min, 100% B; 10-15min, 5,0% B e 95% A (definida na etapa 6.1.3.4). Defina a taxa de fluxo em 0,25 mL/min (definido na etapa 6.1.3.1).
  3. Utilize electrospray MS/MS com modo de MRM (definido na etapa 6.1.5.1) para analisar a eluição da coluna e adotar o modo de íon positivo (definido na etapa 6.1.5.2.1).
    1. Monitorar as transições: 5mC, 242→126 m/z (energia de colisão, eV 5); [D3]-5mC, 245→129 m/z (eV 5); dC, 228→112 m/z (eV 5); 5hmC, 258→142 m/z (eV 5); [D3]-5hmC, 261→145 m/z (5 eV) (definido no passo 6.1.5.2.2).
    2. Definir as tensões capilares e fragmento em +3,500 V (definido na etapa 6.1.5.3) e 90 V (definido na etapa 6.1.5.2.1), respectivamente.
    3. Definir o volume de injeção em 5 µ l e analisar cada amostra 3 vezes (definidos na etapa 6.1.2). Emprega as correspondentes curvas de padrão para avaliar a quantidade de 5mC e 5hmC.
      1. Estabelecer a curva padrão de 5mC: transferir 1 – 50 nM (1, 5, 10, 20, 50 nM, concentração final) solução-padrão de 5mC em centrifugar tubos e adicionar 50 nM [D3]-5mC para tubos. Suplemento do volume total de 50 µ l. efectuar a análise do padrão 5mC, seguindo as instruções para a amostra de 5mC (etapa 6).
      2. Construir a curva padrão de 5hmC: transferir 1 – 20 nM (1, 2, 5, 10, 20 nM, concentração final) solução-padrão de 5hmC tubos de centrifuga e adicionar 3 nM [D3]-5hmC para os tubos. Suplemento do volume total de 50 µ l. efectuar a análise do padrão 5hmC, seguindo as instruções para a amostra de 5hmC (etapa 6).

7. analisar a significância estatística

  1. Realizar a análise estatística utilizando o software.
    1. Abra o software e selecione "Coluna" na "nova tabela & gráfico". Defina os parâmetros da seguinte maneira: "dados de exemplo | Iniciar com uma tabela de dados vazio"; "Escolher um modo gráfico, o primeiro"; "Representação gráfica de repetições ou barras de erro | Sinopse | Quer dizer com SEM".
    2. Clique em "Criar" para entrada as três repetições do grupo controle e Vc/PD0325901-tratados na linha "A" e "B", respectivamente. Selecione os seis dados e clique em "Analisar" na "Análise".
    3. Selecione "testes det (e testes não-paramétricos)" em "Análises de coluna" e clique em "Okey" para entrar na interface de próxima.
    4. Defina os parâmetros da seguinte maneira: "escolha teste | Nome de teste | Unpaired t teste; Opções | Two-tailed"; "Intervalos de confiança: 95%"; "Dígitos significativos | Mostre 4 dígitos significativos". Clique em "Okey" para adquirir o valor de p entre o tratamento controle e Vc/PD0325901.
  2. Avaliar a significância estatística entre o controle e os grupos experimentais empregando o Student bicaudal e unpaired t-teste16.
    Nota: p < 0.05 denota a diferença possuindo significância estatística. * p < 0.05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001.

Resultados

Vc/PD0325901 induzida em sinergia global de eliminação de pilhas do ES do rato. Pilhas do mouse ES no soro apresentam hypermethylation de DNA, enquanto células ICM pluripotentes e PGCs mostram apagamento global de metilação do DNA e o estado de hypomethylated é estreitamente associado com sua pluripotência9,10.

Anteriormente, nós e os outros encontraram que Vc po...

Discussão

No trabalho, temos demonstrado um novo método de combinar Vc e PD0325901 para sustentar as células de rato ES em um estado indiferenciado e hypomethylated, que foi alcançado por uma ação sinérgica de promover demetilação do ADN por Vc e suprimindo de novo DNA metilação de PD0325901. Além disso, as células ES do rato mostraram grande morfologia sob o sistema de cultura Vc/PD0325901.

Para melhor sustentar o estado das pilhas do rato ES no sistema de cultura Vc/PD0325901, exi...

Divulgações

Os autores não divulgar nenhuma potenciais conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Nacional Natural Science Foundation da China (21435008 e 21327006 de h. w) e o programa de pesquisa de prioridade estratégica da Academia Chinesa de Ciências (XDB14030200 de H.W.).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
fetal bovine serum Australia sourceCorning35-076-CVComponent of mouse ES cell medium
DMEM/high glucoseHycloneSH30022Component of mouse ES cell medium
LIFMilliporeESG1107Component of mouse ES cell medium
non-essential amino acids (NEAA)Gibco11140050Component of mouse ES cell medium
sodium pyruvateGibco11360070Component of mouse ES cell medium
L-glutamineGibco25030081Component of mouse ES cell medium
penicillin streptomycin solutionGibco15140122Component of mouse ES cell medium
PBSSigmaP5493Cells rinse
trypsinHycloneSH30042Cell dissociation
gelatinSigma48722Dishes coating
PD0325901Stemolecule04-0006-10small-molecule chemical for cell culture
CHIR99021Stemolecule04-0004small-molecule chemical for cell culture
vitamin CSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd XW00508171small-molecule chemical for cell culture
Ultra Bioscience water purification systemrPurelabUltraUltra water
DMSOSigmaD8418Cell freezing medium
centrifugerEppendorf5427RDNA and protein extraction
protease inhibitor cocktailSigmaP8340Component of RIPA buffer
PMSF Protease InhibitorThermoFisher Scientific36978Component of RIPA buffer
DTTSigma43815Component of RIPA buffer
EGTASigmaE3889Component of RIPA buffer
Genomic DNA Purification Kit PromegaA1125Genomic DNA extraction
NanoDrop 2000ThermoFisher ScientificNanoDrop 2000Determination of DNA concentration
calf intestinal phosphataseNew England BiolabsM0290DNA digestion
DNase INew England BiolabsM0303DNA digestion
snake venom phosphodiesterase ISigmaP4506DNA digestion
Nanosep 3K OmegaPallOD003C35filtration of digested DNA
1290 UHPLC systemAgilent 1290UHPLC separation
G6410B triple quadrupole mass spectrometerAgilent G6410BMS/MS analysis
Zorbax Eclipse Plus C18 columnAgilent Zorbax Eclipse Pluscolume for UHPLC separation
5-methylcytosineSolarbio Life SciencesSM8900 standard 5mC
5-hydroxymethylcytosine (standard)Toronto Research ChemicalsM295900standard 5hmC
Prdm14 antibodybioworldBS7634Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3a antibodybioworldBS6587Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3b antibodyabcamab13604Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3l antibodyabcamab3493Western blot analysis-primary antibody
Dnmt1 antibodyabcamab13537Western blot analysis-primary antibody
β-tubulin antibodybioworldBS1482MHWestern blot analysis-primary antibody
goat anti-rabbit IgGabcamab6721Western blot analysis-secondary antibody
goat anti-mouse IgGabcamab6789Western blot analysis-secondary antibody
TrizolInvitrogen15596-026RNA extraction
reverse transcription systemPromegaA3500RNA reverse transcription
GoTaq qPCR Master MixPromegaA6001RT-PCR
StemTAG alkaline phosphatase staining and activity assay kitCells Biolabs, Inc.CBA-302 alkaline phosphatase staining analysis
mouse ES cells: WT, 129 SvEvProvided by Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China)cell strain of mouse ES cells
microscopeZeissLSM510cells observation
GraphPad Prism 5.0GraphPad Prism Software Inc.5.0statistical analysis

Referências

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