JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Fare embriyonik kök hücre kültürü çalışmalarının iki kimyasal tabanlı protokol ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu yeni yöntem Tet-aracılı oksidasyon (vitamin C) teşvik ve DNA hypomethylation ve fare embriyonik kök hücreler pluripotent korumak için 5-metilsitozin (PD0325901 tarafından) de novo sentezi bastırmak sinerjik mekanizmaları kullanır.

Özet

Embriyonik kök (ES) hücre katmanlardan herhangi birini üç germ (endoderm, mesoderm veya ektoderm) ayırt etmek için potansiyel var ve rejeneratif tıp için birçok soy oluşturabilir. ES hücre kültür vitro uzun yaygın kaygıları konu olmuştur. Klasik, fare ES hücreleri serum ve lösemi inhibitör faktörü (LIF) korunur-orta içeren. Ancak, serum/LIF koşullarda hücreleri heterojen Morfoloji ve pluripotency ilgili genlerin ifade profil göster ve çoğunlukla bir metastable durumdadır. Ayrıca, kültürlü ES hücreleri küresel hipermetilasyon sergi, ama saf ES hücrelerinin iç hücre kütlesi (ICM) ve primordial germ hücreleri (PGCs) bir küresel hypomethylation durumdadır. ICM ve PGCs hypomethylated devlet onların pluripotency ile yakından ilişkilidir. Fare ES hücre kültür yöntemleri geliştirmek için biz son zamanlarda iki küçük molekül bileşikler DNA hypomethylated ve pluripotent durumunu korumak için seçmeli olarak kombine kullanımı dayalı yeni bir yöntem geliştirdi. Burada, biz bu vitamin C (Vc) eş tedavisi mevcut ve PD0325901 5-metilsitozin (5mC) yaklaşık yüzde 90'ını fare ES hücrelerde 5 gün silebilirsiniz. Oluşturulan 5mC içerik PGCs içinde için karşılaştırılabilir olduğunu. Mekanik soruşturma PD0325901 up-Prdm14 ifade Dnmt3b bastırmak için düzenleyen olduğunu gösterir (de novo DNA metiltransferaz) ve Dnmt3l (Dnmt3b kofaktör), de novo 5mC sentezini azaltarak. VC pasif ve aktif DNA demethylations tutulumu gösteren 5-Tet1 ve Tet2, esas katalize arasında bakterilerde görülen (5hmC) 5mC dönüşümünü kolaylaştırır. Ayrıca, Vc/PD0325901 koşullar altında fare ES hücreleri homojen Morfoloji ve pluripotent durumu gösterir. Topluca, biz bir roman ve DNA hypomethylation ve pluripotency fare ES hücrelerdeki bakım ulaşmak için kimyasal-synergy kültür yöntemi öneriyoruz. Küçük molekül kimyasal bağımlı yöntem serum kültür ve daha fazla klinik uygulamaları ve araştırmalar için homojen ES hücreler üretmek için tutar söz önemli eksiklikleri üstesinden gelir.

Giriş

ES hücreler blastosist1ICM kökenli. Hücreler pluripotent durumdadır ve tüm somatik soy ve germline hücreleri2oluşabilir. Kuruluş ES Hücre geliştirme araştırmak için fırsat vitro işler ve hücreler için onların pluripotency3dayalı rejeneratif tıp tıbbi konu ile ilgili-ebilmek oluşturmak sağlar.

İki grup seminally fare ES hücre hatları 1981 yılında kurulan ve ne zaman erken fare embriyo elde edilen hücreleri (FBS) fetal Sığır serum kültürlü-orta fare embriyonik fibroblastlar (MEFs) ile besleyici katman1,4 içeren . MEFs mitotically inaktive ve yemekleri ES Hücre kültürü çalışmalarının önce önceden yetiştirilmiştir. MEFs fare ES Hücre eki için destek sağlar ve yayma teşvik ve farklılaşma5, FBS temel trofik faktörler ve hormonlar hücre çoğalması için sunarken bastırmak için büyüme faktörleri üretmek. Sonraki çalışmalar besleyici hücreler tarafından üretilen LIF kendini yenileme ve fare ES hücrelerdeki pluripotency için anahtar sitokin yapıldı ve LIF yanı sıra Orta içine için besleyici hücreler6yerine olabilir göstermiştir. Şu anda, fare ES hücrelerde besleyiciler FBS/LIF ortamda sustainment hala pek çok araştırmacı tarafından kabul edilen standart yöntemdir. Ancak, bazı sorunlar ile bu klasik kültür yaklaşım ortaya. İlk olarak, besleyici hücreler aşırı ve kontrolsüz faktör salgılar ve patojen bulaşma7neden olabilir. Yemekleri jelatin ile yüzeyi ve LIF eklenmesi serum içeren kaplama bu girişimi engellemek için orta besleyici katmanlı hücre olmadan fare ES hücreleri korumak için alternatif yöntemler vardır. Ayrıca, fare ES hücreleri serum/LIF koşullar altında yetiştirilen morfolojik heterojenite hücre popülasyonlarının ve hatta pluripotency ile ilgili faktörler8ifade düzeyini sergi. Son yıllarda yapılan çalışmalarda serum/LIF koşullar altında LIF ve WNT sinyal aracılığıyla pluripotency (SOX2, MicroRNAs ve OCT4 dahil) pluripotency ilgili çekirdek transkripsiyon faktörleri ayakta olabilir öneririz; Ancak, özellikle, onlar da farklılaşma8tetiklemek için fibroblast büyüme faktörü (FGF) sinyal etkinleştirin. Çekirdek transkripsiyon faktörleri kararsız çift eylem nedeniyle, fare ES hücre içinde serum kültürlü ICM ve astarlanmalıdır epiblast devlet8benzeyen başka bir benzer bir iki değiştirilebilir nüfus oluşan heterojen, mevcut. Ayrıca, ICM ve PGCs onların pluripotency9,10ile yakından bağlantılı bir küresel hypomethylated durumda ise serum hücrelerde fare ES kez küresel hipermetilasyon9, sergi.

Fare ES Hücre kültürü çalışmalarının için yeni yöntemler geliştirmek için önemli bir talep var. Birkaç gelişmiş protokol 200311 ' den beri kurduk ama orada bazı sınırlamalar ve eksiklikleri7olmaya devam ediyor. 2008, iki küçük molekülü kinaz inhibitörleri, PD0325901 kombine kullanımı (inhibitörü olan mitojenle aktive protein kinaz (MAPK) / hücre dışı sinyal düzenlenir kinaz (ERK) (MEK)) ve CHIR99021 (inhibitörü olan glikojen sentaz kinaz 3 (GSK3)), N2B27 ' Orta LIF ve serum olmadan kodlamayla fare ES12hücreleri için yeni perspektifler açtı. Bu yeni tanımlanmış orta iki inhibitörleri (2i) kullanımı ile karakterizedir. 2i/LIF ortamda kültürlü fare ES Hücre popülasyonlarının ve pluripotency faktörler ifade daha homojen hücrelerdir. Buna ek olarak, 2i/LIF-kültürlü fare ES hücre DNA hypomethylation genel olarak ICM benzeri hücreler9,13için daha yakın olan sergi. Öyle olsa bile, 2i kültür kendi dezavantajları vardır. PD0325901 ve CHIR99021 suda çözünmez ve genellikle dimetil sülfoksit (DMSO) çözülür-kültür ortamında eklemek için hisse senedi çözüm tabanlı. Çalışmalar bu uzun vadeli gösterdi ve hücre düşük doz maruz DMSO sitotoksisite14' e neden olabilir.

Burada, iki küçük molekül bileşikler kullanılan ve fare ES Hücre yeni bir kültür yöntemi geliştirdi. Roman kültür yöntemi DNA hypomethylation hızla tanıtmak için Vc ve MEK inhibitörü PD0325901 birleştirir ve etkili bir şekilde PGC karşılaştırılabilir düzeyde için Vc/PD0325901 kodlamayla protokolü olarak adlandırılmış. Vc/PD0325901-eklendi serum içeren orta fare ES hücrelerde homojenliği morfoloji içinde sergilemek ve bir yere durumda sürekli. 2i kültür için karşılaştırıldığında, Vc/PD0325901 koşullar altında kültürlü fare ES hücre DNA demethylation daha hızlı kinetik sergi ve hypomethylation düzeyi PGC karşılaştırılabilir ulaşabilirsiniz. Buna ek olarak, tek inhibitörü (PD0325901) kullanımı giriş DMSO ile karşılaştırıldığında 2i içinde kullanılan orta içine azaltır (PD0325901/CHIR99021) ve hücrelere zarar azaltır.

Protokol

1. hazırlıkları

  1. Bir çözüm (MEK inhibitörü) 1.0 mm PD0325901 ve 3.0 mM CHIR99021 (GSK3 inhibitörü).
    1. PD0325901 2 mg tartmak ve bir kehribar cam şişede DMSO 4,15 mL ekleyin.
    2. CHIR99021 2 mg tartmak ve bir kehribar cam şişede DMSO 1,43 mL ekleyin.
    3. Aşağıdaki sulandırma, aliquots (50 µL/tüpte 200 µL PCR tüpleri)-20 ° C'de depolayın ve ışıktan korunan. Bir tüp dondurucu ve tezcan, oda sıcaklığında kullanmadan önce dondurulmuş stoktan içeren kaldırın.
  2. Vc 0.0176 g bir santrifüj tüpü 1 mL içine tartmak ve 1 mL 100 mM kullanmadan önce son bir konsantrasyon için steril su ile yeniden oluşturma.
  3. FBS devre dışı bırakabilirsiniz: FBS 500 mL 30 dk 56 ° C'de bir su banyosunda kuluçkaya.
  4. 600 mL temel orta fare ES Hücre kültürü çalışmalarının için hazırlayın.
    1. 40 mL kaldırmak ve bir şişe DMEM/yüksek glikoz Orta (500 mL) kullanın.
    2. FBS (120 mL), 1000 U/mL LIF (107 U/mL stok çözüm 60 µL), 0,1 mM non-gerekli amino asitler (NEAA) (6 mL 10 mM stok çözeltisi), 1 mM sodyum pyruvate (6 mL 100 mM stok çözeltisi) ek 460 mL DMEM/yüksek glikoz orta % 20 ile inaktive , 2 mM L-glutamin (6 mL 200 mM stok çözeltisi), 0,1 mM β-mercaptoethanol (100 mM hisse senedi çözüm 600 µL) ve 33 IU/mL penisilin ve 33 µg/mL streptomisin (penisilin-streptomisin çözüm (10.000 IU/mL penisilin ve 10.000 µg/mL streptomisin) karışık 2 mL) . Temel orta serum aracı olarak tanımlayın.
    3. PD0325901 hisse senedi çözüm 50 µL pipet (1.0 mM) ve Vc (100 mM), sırasıyla, 50 mL serum orta içine (son konsantrasyonu: 1.0 µM PD0325901 ve 100 µM Vc) ve orta Vc/PD0325901 aracı olarak tanımlayın.
      Not: Vc/PD0325901 orta boy taze Vc istikrarsızlık nedeniyle kullanımdan önce hazırlayın.
    4. Bir pipet kullanarak transfer PD0325901 hisse senedi çözüm 50 µL (1.0 mM) ve CHIR99021 (3.0 mM), sırasıyla, 50 mL serum orta içine (son konsantrasyonu: PD0325901 1.0 µM ve CHIR99021 3.0 µM) ve orta 2i aracı olarak tanımlayın.
  5. Jelatin kaplı yemekleri hazırlamak.
    1. %0,1 jelatin çözeltisi hazırlamak: 300 mL Cam reaktif şişe bir kap ile Ultrasaf Su içine jelatin 0.3 g dağıtılması ve 121 ° C'de bir Otoklav içinde oda sıcaklığında steril çözüm için 20 dk. mağaza sterilize.
    2. Hücre kültür yemekleri (6 cm çapında) ile 2 mL % 0,1 jelatin çözeltisi 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya ve jelatin Aspire edin. Bulaşıkları hava kuru ve onları içinde 12 h kullanın.
  6. 15 mL santrifüj tüpü ortamda buz gibi fare ES Hücre 10 mL hazırlamak: % 90 FBS (9 mL) ve % 10 DMSO (1 mL). Orta 1 gün içinde kullanın.
  7. Dondurucu bir kapsayıcı hazırlamak: % 100 izopropil alkol dondurma konteyner dolgu satırına ekleyin ve eski izopropil alkol atın. Yeni izopropil alkol doğrudan beşinci her kullanımdan sonra ekleyin.
  8. Enzimatik sindirim arabellek olun: tartmak 1.2114 g Tris tozu 100 mL 100 mM Tris çözüm hazırlamak ve eklemek için Ultrasaf Su içine konsantre HCl çözüm (yaklaşık 12 M) Tris çözüm pH 7,6 (yaklaşık 0.6 mL konsantre HCl çözeltisi) için ayarlamak için.
  9. Radyo immunoprecipitation tahlil arabelleği (RIPA arabellek) 50 mL hazırlamak: 20 mM Tris, pH 7.4, 1 mM MgCl2, 150 mM NaCl, % 20 gliserol, %0,5 NP40, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA. 1 mM ile DTT, proteaz inhibitörü kokteyl X 1 ve 1 mM PMSF kullanmadan önce ek. PMSF eklendikten sonra 30 dk içinde arabellek kullanın.

2. fare ES hücrelerin jelatin kaplı yemekleri büyümesine

  1. Orta, tripsin ve tamponlanmış fosfat çözümde 37 ° C'de bir su banyosu (PBS) önceden sıcak fare ES hücreleri (vahşi türü, 129 SvEv) kültür
  2. Hücreleri geçiş. Ortamından tamamen çanak ve pipet PBS 2 mL hücreleri durulayın yemekleri Aspire edin.
    1. PBS bir pipet ile kaldırmak ve yeniden PBS 2 mL içeren hücreleri yıkayın.
    2. PBS kaldırmak ve tripsin-EDTA (% 0,25) 0.3 mL her yemek için ekleyin.
    3. Hızlı bir şekilde tripsin ile bütün çanak kapağı ve hemen kaldırın.
    4. Çanak çanak hücrelerden ayırmak 1 dk 37 ° C'de bir kuluçka koymak. Kuluçka makinesi yemeklerini çıkar ve sonlandırma tripsin eylemi için önceden ısıtılmış serum Orta 2 mL ekleyin.
    5. Hücre kolonilerinin bir pipet (5 mL pipet ucu) ile 10 kez resuspending tarafından bir tek hücre süspansiyon ayırmak.
  3. Hücre çözümü (bir hemasitometre ile sayma tarafından yaklaşık 190.000 hücreleri) 2 mL 150 µL yeni bir jelatin kaplı kabına aktarın ve taze yapılmış Vc/PD0325901 orta 6 cm kültür çanak başına 3 mL ile ek. 37 ° C kuluçka %5 CO2hücre kültür.
  4. Kuluçka, süre her 24 h eski kültür orta kaldırın ve taze Vc/PD0325901-orta 3 mL Vc. Expect 70-%80 confluency istikrarsızlık nedeniyle kültür çanak içine 2-3 gün sonra ekleyin.
  5. % 70-80 confluency ulaşan sonra hücreleri geçiş ve onları 2.2-2.4 adımlarda açıklandığı gibi kültür devam ediyor.

3. donma ve fare ES hücreleri tezcan

  1. Fare ES hücreleri dondur.
    1. Tripsin bulaşıkta hücrelerden takip adım 2.2 bağlantısını kesin.
    2. Hücreleri bir 15 mL plastik tüp ve 800 g ve oda sıcaklığında x 3 dk santrifüj içine aktarın.
    3. Süpernatant yavaşça bir ölçek dökümü ve hücre Pelet ile 1 mL taze dondurma orta yaptı resuspend. Dondurucu orta 30 dk önce kullanmadan önce oda sıcaklığında olduğundan emin olmak için bu adımı hazırlayın.
    4. 1 mL pipet ile 1,8 mL microcentrifuge tüp ortamına dondurma hücreleri aktarmak ve microcentrifuge tüp dondurucu bir konteyner içine yerleştirin. İzopropil alkol dondurma konteyner dolgu satırına ekleyin ve kullanmadan önce oda sıcaklığında saklayın.
    5. Dondurma kapları gece-80 ° C dondurucuya bırakın.
    6. Microcentrifuge tüpler için 2-3 yıla kadar bir sıvı azot kaba transfer.
      Not: Değil tutmak hücreleri dondurucu orta uzun bir zaman ve hızlı bir şekilde hücreleri-80 ° C dondurucu DMSO toksisite nedeniyle transfer.
  2. Fare ES hücreleri çözülme.
    1. Önceden sıcak 50 mL serum orta 37 ° C su banyosu içinde.
    2. Bir hücreyi içeren flakon sıvı azot konteyner üzerinden çıkar ve 37 ° C su banyosu kepli şişede bırakın. Hızlı bir şekilde çözülmesi su banyosu salla. Hücreleri 1 mL pipet ile 15 mL tüp içine aktarın. Önceden ısıtılmış serum kültür orta 2 mL dondurucu orta sulandırmak ve 800 x g ve oda sıcaklığında 3 dk santrifüj kapasitesi için tüp içine ekleyin.
    3. Süpernatant kaldır ve yavaşça hücre topakları ile 3 mL 5 mL pipet kullanarak taze Vc/PD0325901 orta resuspend.
    4. Hücreleri 15 mL tüp sizden bir jelatin kaplı yemek için aktarmak ve 24 h kültür için hücreleri tekrar 2. adımda açıklandığı gibi hücre kültür.

4. Toplam Protein hücrelerden hulâsa

  1. Kendine hakim hücre PBS 1 mL ile durulayın ve 800 x g ve oda sıcaklığında 3 dk santrifüj kapasitesi.
  2. Süpernatant Aspire edin ve hücre Pelet DTT, proteaz inhibitörü kokteyl ve PMSF ile hafifçe pipetting tarafından desteklenen RIPA arabelleği ile iyice resuspend. RIPA arabellek hücrenin cips yaklaşık 5 x birimdir.
    Not: cep resuspension buz yerine getirir.
  3. Hücreleri RIPA arabellek buz ve santrifüj 13.000 x g ve 4 ° C 5 min için 30 dakika tutun.
  4. Yeni bir tüp süpernatant aktarın ve aliquots-80 ° C'de depolayın
  5. Bir Bradford protein tahlil kiti ile protein konsantrasyonu belirlemek.

5. DNA hücre Özet DNA hulâsa--dan ve bir tek nükleozit enzimler kullanarak

  1. Tripsin hücrelerle 3.1.1 ve 3.1.2 adımlarda açıklandığı gibi toplamak.
  2. DNA ekstraksiyon üreticinin yönergelerini izleyerek bir genomik DNA arıtma kiti ile gerçekleştirin.
  3. Ayıklanan DNA 1 mL santrifüj tüplerde saklayın. Santrifüj tüpüne 100 µL ultrasaf su ekleyin ve yaklaşık 15 kez pipetting tarafından DNA geçiyoruz. Konsantrasyonu belirlemek ve DNA kalitesi 260 absorbans ölçümü ile değerlendirmek nm ve 280 nm15. DNA yaklaşık 500 ng/µL bölgedir.
  4. DNA'ın Özeti 5 µg 50 µL çözüm sistemi: 100 mm Tris-HCl bir çözüm, pH 7,6 5 µL ekleyin (son konsantrasyonu: 10 mM), 2 U buzağı bağırsak fosfataz, 1 U DNaz ben 0.005 U yılan zehri fosfodiesteraz ben ve DNA'ın 5 µg (uzaklık göre eklenen hacim hesaplamak Kırmızı DNA toplama, ~ 10 µL) bir santrifüj tüpü ve artış Ultrasaf Su ile 50 µL çözüm hacmi içine. 37 ° C karisimin gecede kuluçkaya. Sindirilir DNA çözüm 1000 g ve oda sıcaklığında çözüm tüpler altına toplamak 1 dk santrifüj kapasitesi.
  5. Sindirilir DNA çözüm santrifüj tüpleri ultra filtrasyon tüpler içine aktarmak (kesme bir molekül ağırlığı: 3 kDa) ve 13.000 g ve 4 ° C için sindirim enzimleri kaldırmak 30 dk santrifüj.
  6. Örnekleri 5mC ve 5hmC analiz için hazırlayın.
    1. 5hmC analiz için: damlalıklı 36 µL filtre çözüm için yeni bir santrifüj tüp (1 mL) ve bir 5'-(hydroxymethyl-d3)-2'-deoxycytidine 4 µL ekleyin ([D3]-5hmC) ile 3 son konsantrasyonu nM.
    2. 5mC analiz için: 196 µL Ultrasaf Su içine yeni bir santrifüj tüpü ve damlalıklı 4 µL filtre çözüm tüp (50-fold seyreltme), genomik DNA ' 5mC yüksek yoğunluk nedeniyle ekleyin. Yeni bir santrifüj tüpü seyreltilmiş çözeltinin 36 µL nakletmek ve 4 µL eklemek (5'-(methyl-d3)-2'-deoxycytidine ([D3]-5mC) ile son konsantrasyonu 50 nM. Kullanım [D3]-5hmC ve [D3]-5mC 5hmC ve 5mC, anılan sıraya göre ayarlamak için iç standart olarak.
  7. Örnek çözüm için ölçüm tüpler aktarın ve 4 ° C'de depolayın 5mC ve 5hmC çoklu-tepki (UHPLC-MS/MS (MRM)) bir önceki rapor15' te açıklandığı gibi izleme ile ultra yüksek performanslı sıvı kromatografi-triple quadrupole kütle spektrometresi ile analiz.

6. analiz 5mC ve 5hmC UHPLC-MS/MS15 kullanarak

  1. 5mC ve 5hmC analiz etmek için çeşitli parametreleri ayarlamak UHPLC-MS yazılım kullanarak.
    1. Yeni bir yöntem oluşturun. Yazılım açın ve "dosya | Yeni | Yöntem". "Geçerli yöntem için değişiklikleri kaydetmek ister" "Yöntemi Düzenleyicisi" ileti kutusu içeriği ile sergi ve "Hayır"'ı tıklatın.
    2. Örnekleyiciyi parametrelerini oluşturun. Tıklatın "örnekleyici | Kurulum | Enjeksiyon". "Standart enjeksiyon" seçin ve "enjeksiyon ses seviyesinde 5 µL" girişi.
    3. UHPLC içinde pompa parametrelerini oluşturun.
      1. Tıklayın "BinPump2 | Pompa parametreleri oluşturmak için kurulum". "Akış" "0.25 mL/dk" ve "işlem", "15 dakika" ayarlayın.
      2. "Solvent B % 5" ayarlayın ve "sınırları"Max 600 barda"basınç".
      3. Tıklayın "BinPump2 | Uçus tarifesi"isocratic 5mC analiz için elüsyon parametreleri oluşturmak için. Bir satır eklemek için "Ekle" seçeneğini tıklatın. Giriş "0.00" "Zaman" ve "5.0" "B %". Bir kez daha yeni bir satır eklemek için "Ekle" seçeneğini tıklatın. Giriş "15.00" "Zaman" ve "5.0" "B %".
      4. Tıklayın "BinPump2 | Uçus tarifesi"5hmC analiz için degrade elüsyon parametreleri oluşturmak için. "Bir satır eklemek için Append. tıklatın 0.00 zaman ve 5.0 "B %" giriş. Bir kez daha yeni bir satır eklemek için "Ekle" seçeneğini tıklatın. Giriş "3.00" "Zaman" ve "5.0" "B %". "Başka bir 6 kere 6 satır eklemek Ekle" seçeneğini tıklatın. "Zaman" ve "5.0" "B %", "3.01" "Zaman" ve "15,0", "B %", "6,00"Zaman"," ve "15,0" "B %", "6,01" "Zaman" ve "100", "B %", "10.00" "Zaman" ve "100,0", "B %", "10,01"Zaman"," ve "5.0" "B %", "15.00" sırada girdi.
        Not: 5mC ve 5hmC ayrı ayrı UHPLC farklı ayırma şartları nedeniyle analizi gerçekleştirin.
    4. UHPLC sütun kompartımanda (TCC) sıcaklığı parametrelerini oluşturun.
      Tıklatın "TCC | Kurulum | sıcaklık (solda) "ve"30 ° C"girdi.
    5. QQQ-MS/MS parametrelerini kurun.
      1. Tıklatın "MS QQQ | Durma zamanı | Hayır limit/olarak pompa"," İyon kaynağı | ESI"," zaman filtreleme | En yüksek Genişlik: 0,07 min ". Kurmak "zaman kesimleri: başlangıç saati: 0"; "Tarama türü: MRM"; "Div değeri: MS"; "Delta EMV (+): 200" ve "Delta EMV (-): 0".
      2. 5mC, D3geçişler izleme parametreleri oluşturmak-5mC, dC, 5hmC ve D3-5hmC
        1. Tıklatın "MS QQQ | Edinme | Kesimleri taramak: durmak: 90"; "Fragmentor: 90"; "Çarpışma enerji: 5"; "Hücre Hızlandırıcı voltajı: 4" ve "polarizasyon: pozitif".
        2. "5mC" "Bileşik ad?", "242" "Öncü iyon", "126" "Ürün iyon" adlı 5mC analiz için giriş. Sağ tuşuna tıklayın ve "satır ekle" seçin Yeni bir satır eklemek için. Giriş "D3-5mC", "Bileşik ad?", "Öncü iyon", D3için "Ürün iyon", "129", "245"-5mC analizi.
        3. Başka bir üç satır aynı modunu kullanarak ek. "DC" "Bileşik ad?", "228" "Öncü iyon", "112", "Ürün iyon" dC analiz için giriş. "5hmC" "Bileşik ad?", "258" "Öncü iyon", "142" "Ürün iyon" adlı 5hmC analiz için giriş. Giriş D3-adı, "261", "Öncü iyon", D3için "Ürün iyon", "145" bileşik, 5hmC-5hmC analizi.
      3. Gaz kaynak parametrelerini oluşturun. Tıklatın "MS QQQ | Kaynak | Kaynak parametreleri: gaz Temp: 300 ° C "; "Gaz akışı: 11 L/min"; "Nebulizatör: 15 psi"; "Pozitif-kılcal: 3500 V".
      4. Önerilen yöntem kaydedin. Tıklatın "MS QQQ | Araç | «««Kaydet"yöntemi olarak. "Dizin" tarafından önerilen yöntem için bir yol seçin ve "Yöntem", içeriğindeki örneğin girerek yöntemi için bir ad verin: 5mC ve 5hmC analizi.
  2. UHPLC ayırma ve mononucleosides MS/MS Analizi
    1. Mobil faz 5mC ve sitozin için hazırlamak (C) Analizi: mobil faz çözüm A ve B. çözüm A: 500 mL Ultrasaf Su 500 µL formik asit ile (son konsantrasyonu: % 0,1) ve % 100 metanol çözüm B: 500 mL. Çözüm A ve B 95:5 (v: v) 5mC ve (6.1.3.3 adımda ayarla) C elute için mobil faz olarak karıştırın. 0.25 mL/dk (6.1.3.1 adımda ayarla) akış hızını ayarlayın.
    2. Çözelti A ve B tarafından mobil faz 5hmC analiz için hazırlayın. Çözelti A olduğunu 2.0 mM NH4HCO3 sulu çözüm (pH 9.0) (500 mL), ve solvent B % 100 metanol (500 mL). En iyi duruma getirilmiş bir degrade elüsyon tarafından ayrı 5hmC: 0-3 dk, %5,0 B ve % 95 A (v: v); 3-6 dk, %15,0 B ve % 85'a; 6-10 min, %100 B; 10-15 dk, %5,0 B ve % 95'a (6.1.3.4 adımda ayarla). 0.25 mL/dk (6.1.3.1 adımda ayarla) akış hızını ayarlayın.
  3. Electrospray MS/MS elüsyon sütun çözümlemek ve (6.1.5.2.1 adımda ayarla) pozitif iyon modu evlat edinmek için MRM modu (adım 6.1.5.1 ayarlandığında) kullanmaktadır.
    1. Geçişleri izlemek: 5mC, m/z 242→126 (çarpışma enerji, 5 eV); [D3]-5mC, m/z 245→129 (5 eV); dC, m/z 228→112 (5 eV); 5hmC, m/z 258→142 (5 eV); [D3]-5hmC, m/z 261→145 (5 eV) (adım 6.1.5.2.2 kümesinde).
    2. +3,500 V (6.1.5.3 adımda ayarla) kılcal ve parça gerilimleri set verin ve 90 V (içinde 6.1.5.2.1, sırasıyla).
    3. Enjeksiyon 5 µL ayarlamak ve 3 kez (6.1.2 adımda ayarla) her örneğini analiz. 5mC ve 5hmC miktarını değerlendirmek için karşılık gelen standart eğrileri kullanır.
      1. 5mC standart eğri kurmak: 1 – 50 nM transfer (1, 5, 10, 20, 50 nM, son konsantrasyonu) standart çözüm 5mC içine santrifüj tüpleri ve 50 ekleyin nM [D3]-borular için 5mC. Ek için 50 µL. toplam hacim talimatları 5mC örnek (adım 6) için standart 5mC analizini gerçekleştirin.
      2. 5hmC standart eğri oluşturmak: 1 – 20 nM transferi (1, 2, 5, 10, 20 nM, son konsantrasyonu) tüpler santrifüj kapasitesi ve 3 eklemek için 5hmC standart çözüm nM [D3]-tüpler için 5hmC. Ek için 50 µL. toplam hacim talimatları 5hmC örnek (adım 6) için standart 5hmC analizini gerçekleştirin.

7. analiz istatistiksel anlamlılık

  1. İstatistiksel analiz yazılımı kullanarak gerçekleştirin.
    1. Yazılımını açın ve "Sütun" "yeni tablo ve grafik içinde" seçin. Parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın: "örnek veri | Başlangıç bir boş veri tablosu"; "Bir grafik ilk modu seçin"; "Çoğaltır veya hata çubukları grafik | Arsa | «««Demek"SEM ile.
    2. "Sırasıyla"A"ve"B"doğrultusunda Vc/PD0325901-tedavi ve kontrol grubunun üç çoğaltır girişine oluştur" u tıklayın. Altı verileri seçin ve "Analiz" "Analiz"'ı tıklatın.
    3. "T testleri (ve parametrik olmayan testler)" "İçinde sütun analizleri" seçin ve sonraki arayüzü girmek için "Tamam"'ı tıklatın.
    4. Parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın: "Seç testi | Test adı | Unpaired t testi; Seçenekleri | İki kuyruklu"; "Güven aralıkları: % 95"; "Basamak | «««Show"4 basamak. Denetim ve Vc/PD0325901 tedavi arasında p değeri elde etmek için "Tamam" düğmesini tıklatın.
  2. Denetim ve unpaired iki kuyruklu öğrenci tistihdam deneysel grupları arasında istatistiksel anlamlılık değerlendirmek-16test.
    Not: p < 0,05 istatistiksel önemi haiz fark gösterir. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.

Sonuçlar

VC/PD0325901 sinerjik fare ES Hücre küresel silme indüklenen. Serum fare ES hücrelerde DNA hipermetilasyon, süre pluripotent ICM hücreler ve PGCs DNA metilasyon küresel silme göstermek ve hypomethylated devlet onların pluripotency9,10ile yakından ilişkilidir sergi.

Daha önce biz ve diğerleri Vc Tet-aracılı 5mC demethylation15,<...

Tartışmalar

Çalışma, biz Vc ve PD0325901 fare ES hücreleri de novo DNA bastırmak ve DNA demethylation Vc tarafından teşvik sinerjik bir eylem tarafından elde edildi bir farklılaşmamış ve hypomethylated devlet sürdürebilmek için birleştirme bir roman yöntemi gösterdi metilasyon tarafından PD0325901. Ayrıca, fare ES hücreleri Vc/PD0325901 kültür sistemi altında büyük morfoloji gösterdi.

Daha iyi fare ES hücreleri durumunu Vc/PD0325901 kültür sistemi içinde sürdürmek...

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir potansiyel çıkar çatışmaları ifşa.

Teşekkürler

Bu eser Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (21435008 ve 21327006 H.W. için) ve stratejik öncelik araştırma programı Çin Bilimler Akademisi tarafından desteklenmiştir (H.W. için XDB14030200).

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
fetal bovine serum Australia sourceCorning35-076-CVComponent of mouse ES cell medium
DMEM/high glucoseHycloneSH30022Component of mouse ES cell medium
LIFMilliporeESG1107Component of mouse ES cell medium
non-essential amino acids (NEAA)Gibco11140050Component of mouse ES cell medium
sodium pyruvateGibco11360070Component of mouse ES cell medium
L-glutamineGibco25030081Component of mouse ES cell medium
penicillin streptomycin solutionGibco15140122Component of mouse ES cell medium
PBSSigmaP5493Cells rinse
trypsinHycloneSH30042Cell dissociation
gelatinSigma48722Dishes coating
PD0325901Stemolecule04-0006-10small-molecule chemical for cell culture
CHIR99021Stemolecule04-0004small-molecule chemical for cell culture
vitamin CSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd XW00508171small-molecule chemical for cell culture
Ultra Bioscience water purification systemrPurelabUltraUltra water
DMSOSigmaD8418Cell freezing medium
centrifugerEppendorf5427RDNA and protein extraction
protease inhibitor cocktailSigmaP8340Component of RIPA buffer
PMSF Protease InhibitorThermoFisher Scientific36978Component of RIPA buffer
DTTSigma43815Component of RIPA buffer
EGTASigmaE3889Component of RIPA buffer
Genomic DNA Purification Kit PromegaA1125Genomic DNA extraction
NanoDrop 2000ThermoFisher ScientificNanoDrop 2000Determination of DNA concentration
calf intestinal phosphataseNew England BiolabsM0290DNA digestion
DNase INew England BiolabsM0303DNA digestion
snake venom phosphodiesterase ISigmaP4506DNA digestion
Nanosep 3K OmegaPallOD003C35filtration of digested DNA
1290 UHPLC systemAgilent 1290UHPLC separation
G6410B triple quadrupole mass spectrometerAgilent G6410BMS/MS analysis
Zorbax Eclipse Plus C18 columnAgilent Zorbax Eclipse Pluscolume for UHPLC separation
5-methylcytosineSolarbio Life SciencesSM8900 standard 5mC
5-hydroxymethylcytosine (standard)Toronto Research ChemicalsM295900standard 5hmC
Prdm14 antibodybioworldBS7634Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3a antibodybioworldBS6587Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3b antibodyabcamab13604Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3l antibodyabcamab3493Western blot analysis-primary antibody
Dnmt1 antibodyabcamab13537Western blot analysis-primary antibody
β-tubulin antibodybioworldBS1482MHWestern blot analysis-primary antibody
goat anti-rabbit IgGabcamab6721Western blot analysis-secondary antibody
goat anti-mouse IgGabcamab6789Western blot analysis-secondary antibody
TrizolInvitrogen15596-026RNA extraction
reverse transcription systemPromegaA3500RNA reverse transcription
GoTaq qPCR Master MixPromegaA6001RT-PCR
StemTAG alkaline phosphatase staining and activity assay kitCells Biolabs, Inc.CBA-302 alkaline phosphatase staining analysis
mouse ES cells: WT, 129 SvEvProvided by Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China)cell strain of mouse ES cells
microscopeZeissLSM510cells observation
GraphPad Prism 5.0GraphPad Prism Software Inc.5.0statistical analysis

Referanslar

  1. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
  2. Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 435-462 (2001).
  3. Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
  4. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78 (12), 7634-7638 (1981).
  5. Eiselleova, L., et al. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int. J. Dev.Biol. 52 (4), 353-363 (2008).
  6. Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).
  7. Tamm, C., Galitó, S. P., Annerén, C. A comparative study of protocols for mouse embryonic stem cell culturing. Plos One. 8 (12), e81156 (2013).
  8. Yamaji, M. PRDM14 ensures naive pluripotency through dual regulation of signaling and epigenetic pathways in mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 368-382 (2013).
  9. Ficz, G., et al. FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency. Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).
  10. Smith, Z. D., et al. A unique regulatory phase of DNA methylation in the early mammalian embryo. Nature. 484 (7394), 339-344 (2012).
  11. Ying, Q. L., Nichols, J., Chambers, I., Smith, A. BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3. Cell. 115 (3), 281-292 (2003).
  12. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  13. Leitch, H. G., et al. Naive pluripotency is associated with global DNA hypomethylation. Nat. Struct. Mol. Biol. 20 (3), 311-316 (2013).
  14. Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).
  15. Yin, R., et al. Ascorbic acid enhances Tet-mediated 5-methylcytosine oxidation and promotes DNA demethylation in mammals. J. Am. Chem. Soc. 135 (28), 10396-10403 (2013).
  16. Guerra, A. D., Rose, W. E., Hematti, P., Kao, W. J. Minocycline modulates NFκB phosphorylation and enhances antimicrobial activity against Staphylococcus aureus in mesenchymal stromal/stem cells. Stem Cell Res. Ther. 8 (1), 171 (2017).
  17. Blaschke, K., et al. Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells. Nature. 500 (7461), 222-226 (2013).
  18. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
  19. Wu, H., Zhang, Y. Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5-methylcytosine oxidation. Genes Dev. 25 (23), 2436-2452 (2011).
  20. Inoue, A., Zhang, Y. Replication-dependent loss of 5-hydroxymethylcytosine in mouse preimplantation embryos. Science. 334 (6053), 194 (2011).
  21. He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).
  22. Maiti, A., Drohat, A. C. Thymine DNA glycosylase can rapidly excise 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine: Potential implications for active demethylation of CpG sites. J. Biol. Chem. 286 (41), 35334-35338 (2011).
  23. Habibi, E., et al. Whole-genome bisulfite sequencing of two distinct interconvertible DNA methylomes of mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (3), 360-369 (2013).
  24. von Meyenn, F., et al. Impairment of DNA methylation maintenance is the main cause of global demethylation in naive embryonic stem cells. Mol. Cell. 62, 848-861 (2016).
  25. Li, C., Liu, B., Zhong, S., Wang, H. MEK inhibitor PD0325901 and vitamin C synergistically induce hypomethylation of mouse embryonic stem cells. Oncotarget. 7 (26), 39730-39739 (2016).
  26. Hackett, J. A., et al. Synergistic mechanisms of DNA demethylation during transition to ground-state pluripotency. Stem Cell Reports. 1 (6), 518-531 (2013).
  27. Nakaki, F., Saitou, M. PRDM14: a unique regulator for pluripotency and epigenetic reprogramming. Trends Biochem. Sci. 39 (6), 289-298 (2014).
  28. Nichols, J., Smith, A. Pluripotency in the embryo and in culture. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4 (8), (2012).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyokimyasay 136C vitaminiPD0325901fare embriyonik k k h creleriDNA hypomethylationPrdm14Nanog

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır