يعيش خلية Fluorescence مجهرية لمراقبة العمليات الأساسية أثناء نمو الخلايا الميكروبية

Summary

فهم وظيفة العمليات الأساسية في البكتيريا هو التحدي. مجهر الأسفار مع صبغات محددة الهدف يمكن أن توفر أفكاراً رئيسية في تطور النمو ودورة الخلية الخلية الجرثومية. هنا، tumefaciens المتبعة بكتيريا نموذجي لتسليط الضوء على أساليب لتصوير الخلايا الحية لوصف العمليات الأساسية.

Abstract

العمليات الخلوية الأساسية مثل تكرار الحمض النووي، والعزل وتخليق البروتين وتخليق جدار الخلية الحيوي وانقسام الخلية تعتمد على وظيفة البروتينات التي ضرورية لبقاء البكتيرية. يمكن استخدام مجموعة من الأصباغ محددة الهدف كما المسابير لتحسين فهم هذه العمليات. التلوين بالأصباغ محبتين يتيح مراقبة بنية الغشاء، والتصور من الدهون ميكرودومينس، والكشف عن غشاء بليبس. يمكن أن تشير إلى استخدام الأحماض الأمينية فلوري د (فداس) للتحقيق في مواقع التركيب الحيوي peptidoglycan العيوب المحتملة في نشوء حيوي جدار الخلية أو الخلايا النمو الزخرفة. وأخيراً، يمكن أن تشير إلى بقع الحمض النووي العيوب المحتملة في فصل النسخ المتماثل أو صبغي الحمض النووي. الحمض النووي سينين البقع تسمية الخلايا الحية، وهي مناسبة للوقت الفاصل بين الفحص المجهري تمكن الملاحظات في الوقت الحقيقي مورفولوجية نوكليويد أثناء نمو الخلايا. يمكن تطبيق البروتوكولات لوسم الخلية على طفرات نضوب البروتين لتحديد العيوب في هيكل غشاء أو جدار الخلية نشوء حيوي أو العزل الصبغي. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام الوقت الفاصل بين الفحص المجهري لرصد التغييرات الشكلية بروتين ضروري إزالة، ويمكن أن توفر أفكاراً إضافية في وظيفة البروتين. على سبيل المثال، نتائج استنزاف البروتينات انقسام الخلية الأساسية في فيلامينتيشن أو المنطق التفريعي، بينما قد يؤدي استنفاد بروتينات الخلية نمو الخلايا لتصبح أقصر أو مستدير. هنا، يتم توفير بروتوكولات لنمو الخلايا، ووسم محددة الهدف، والوقت الفاصل بين الفحص المجهري لمسببات الأمراض النباتية البكتيرية tumefaciens المتبعة. معا، صبغات محددة الهدف والوقت الفاصل بين الفحص المجهري تمكن وصف العمليات الأساسية في tumefaciens أ. وأخيراً، يمكن سهولة تعديل البروتوكولات المقدمة للتحقيق في العمليات الأساسية في بكتيريا أخرى.

Introduction

ويتطلب التقدم خلال دورة الخلية البكتيرية تنسيق العديد من العمليات بما في ذلك تخليق جدار الخلية والغشاء الحيوي وتكرار الحمض النووي والعزل، وانقسام الخلايا. لنفهم تماما تعقيد بيولوجيا الخلايا البكتيرية، من الضروري دراسة هذه الأحداث الأساسية؛ ومع ذلك، هذا مهمة غير عادية منذ صلاحية خلية للخطر عندما يتم موتاجينيزيد المكونات الرئيسية لهذه المسارات. ابيفلوريسسينسي المجهري مقترنة بالأصباغ محددة الهدف نهج قوية للتحقيق في هذه العمليات الأساسية في wildtype والسلالات البكتيرية المسخ.

الأصباغ بيبتيدوجليكان محددة تشمل المضادات الحيوية الفلورسنت (فانكوميسين-فلوريدا، فلوريدا بوسيلين) والأحماض الأمينية فلوري د (على سبيل المثال، 7-هيدروكسيكومارين-3-كاربوكسيليك حمض-3-أمينو-د-ألانين، الهدا؛ 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino-د-ألانين ، ندى؛ تيتراميثيلرهوداميني-3-أمينو-د-ألانين؛ الأنشطة الإرهابية والتخريبية). في بكتيريا إيجابية، تم استخدام التركيزات المقاسة من الفلورسنت النظير المضادات الحيوية للتحقيق في مواقع من peptidoglycan الحيوي استراتيجية فعالة للكشف عن أنماط peptidoglycan الإدراج^{1،2، 3،4}. بينما وسم فانكومايسين الفلورية قد استخدمت لاكتساب نظرة ثاقبة peptidoglycan أنماط الإدراج في بكتيريا سلبية الغرام الثابتة⁵، الغشاء الخارجي يوفر عموما نفاذية حاجز الذي يمنع استخدام فلوري المضادات الحيوية مجس تخليق peptidoglycan الحيوي في الخلايا الحية. وفي المقابل، نبضات قصيرة من الأحماض الأمينية فلوري د أو الأحماض الأمينية د مع المجموعات الوظيفية بيورثوجونال تساهمي تسمية مناطق الإدراج peptidoglycan الأخيرة في مجموعة واسعة من الخلايا البكتيرية الحية^6،7. وتشمل أنماط الإدراج peptidoglycan التي لوحظت مع الأحماض الأمينية د الاصطناعية الشروريه والحاجز (الإشريكيّة القولونية و نجحت Bacillus)، القطبية والحاجز (tumefaciens المتبعة و الليستريه المستوحدة)، الحاجز فقط (المكوّرات العنقودية الذهبية)، وقمي (فنزويلا متسلسلة)^6،7. هذه الملاحظات تشير إلى أن البكتيريا معرض أنماط متنوعة من نشوء حيوي جدار الخلية وأن استخدام الأحماض الأمينية د الاصطناعية كمجسات لدراسة الزخرفة النمو قيمة استراتيجية في العديد من البكتيريا.

وتشمل الأصباغ التي تسمية الكروموسومات البكتيرية الموثق الاخدود ثانوية محددة الحمض الخلوي الصبغي (DNA) (4,6-دياميدينو-2-فينيليندولي؛ DAPI) والأصباغ سينين تقارب عالية (الأخضر والبرتقالي؛ انظر قائمة المواد). DAPI تلطيخ الخلايا الثابتة ويساعد في تعداد البكتيريا من عينات بيئية⁸، بينما DAPI تلطيخ الخلايا الحية تستخدم للإشارة إلى بقاء البكتيرية⁹. وفي المقابل، سينين الأصباغ مثل البرتقالي والأخضر كثيرا ما يوصف بغشاء الخلية "ميتة" إيمبيرمينت البقع تعداد الخلايا غير قابل للحياة⁹. بشكل ملحوظ، عندما يتم استخدام هذه الكواشف للتحقيق مورفولوجية نوكليويد البكتيرية أثناء نمو الخلايا، DAPI والبرتقالي، والأخضر كانت كلها تبين أن غشاء بيرمينت وقادرة على تسمية الخلايا الحية¹⁰. تعيش خلايا كولاي , DAPI تلطيخ الحمض النووي يظهر منتشر بسبب السيارات-الأسفار من السيتوبلازم والتعرض المتكرر من الخلايا DAPI الملون للأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) إزعاجا هيكل نوكليويد¹⁰. كولاي المصبوغة أو باء-نجحت مع أورانج يكشف أن هذه الصبغة غشاء بيرمينت ويوفر fluorescence طويلة الأمد عند ربط الحمض النووي في الخلايا الحية دون التأثير على نمو الخلايا أو تكرار الحمض النووي الصبغي العزل¹⁰ . هذه الملاحظات تشير إلى أنه يمكن استخدام الأصباغ سينين الحمض النووي لرصد مورفولوجية نوكليويدس أثناء نمو الخلية في العديد من البكتيريا.

فوسفوليبيدسبيسيفيك ستريل الأصباغ مثل N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) فينيل) هيكساترينيل) dibromide بيريدينيوم (4-64؛ انظر قائمة المواد) هي مركبات الأيوني والمنتسبين تفضيلي مع اتهم سلبا فوسفوليبيدات مثل كارديوليبين وفوسفاتيديلجليسيرول¹¹. ولوحظت أنماط متميزة عندما يتم استخدام 4-64 لتسمية غشاء البكتيريا المختلفة. في الإشريكيّة القولونية، 4-64 المخصب في القطبين، في عصابات على طول الجدار الجانبي، وفي مواقع شعبة في وقت متأخر بريديفيسيونال الخلايا¹². نجحت عصية، وسم 4-64 يمكن التصور من الدهن اللوالب¹³. في tumefaciens المتبعة، 4-64 تسميات الغشاء الخارجي، ومن الملاحظ في نمط مميز "حدوة" الذي القطب النمو خالية من العلامات^14،15. هذه الملاحظات تشير إلى أن هذه البكتيريا يحمل توزيعات دهن غير متجانسة بسبب الوجود الدهون المجالات التي تسهم في عدم التناظر الخلوية. التغيرات في أنماط 4-64 وضع العلامات مثل وجود وسم منتشر، بليبس أو حويصلات أو إينفاجينيشنز أو انكماش الغشاء يمكن أن تكون مفيدة في وصف طفرات التي تؤثر على توزيع أو تخليق الحيوي من الدهون.

وراء تلطيخ الخلايا، من الضروري تحديد وظيفة البروتينات المشاركة في العمليات الأساسية. توصيف البروتينات الأساسية صعبة من الناحية الفنية لأنه ليس من الممكن حذف الجينات الأساسية ودراسة آثار المظهرية. وهكذا ظهرت النهج البديلة المستنفدة للبروتين. على سبيل المثال، يمكن وضع جينات أساسية الخاضعة لسيطرة مروج إيندوسيبلي بدلاً من المروج الأصلي لها. إيندوسيبلي المروجين استجابة لجزيئات صغيرة مثل؛ الزنك¹⁶، الأيزوبروبيل β-د-1-ثيوجالاكتوبيرانوسيدي (إيبتج)^{17،18،19،،}من²⁰²¹، أرابينوز²²،²³من فانيلاتي^17،، و xylose²³، وبالتالي يتوقف نسخ الجينات المستهدفة ونفاد بروتين الفائدة عند إزالة محفز. وتشمل النهج البديلة المستنفدة للبروتينات الأساسية التي تهم ريبوسويتشيس الاصطناعية²⁴ التي تستخدم تفاعلات الجزيئات الصغيرة-الجيش الملكي النيبالي لعرقلة نسخ جينات المستهدفة، كريسبر تدخل^25،26 لمنع النسخ من الجينات المستهدفة، والبروتين إيندوسيبلي تدهور^27،28 التي تستخدم علامات الببتيد للبروتينات المستهدفة للتدهور بحوزتي كلبكسب. توفير سلالات استنفاد سوى وقت قصير لتوصيف قبل الخلايا تفقد السلامة، ولذلك، التصوير المجهري للخلايا على مر الزمن من خلال استنزاف البروتين نهج قوية لتوصيف. في الواقع، والفحص المجهري للخلايا البكتيرية الحية مكن الباحثين اكتساب نظرة ثاقبة العمليات البيولوجية الأساسية، بما في ذلك الآليات للمحافظة على شكل الخلية وإفراز تجزئة²⁹.

A. tumefaciens هو مسببات الأمراض النباتية البكتيرية³⁰ و^31،الهندسة الوراثية الطبيعية³². وهكذا، الآليات ذات الصلة بالقدرة الإمراضية، بما في ذلك المضيف الممرض التفاعلات^33،،من³⁴³⁵وإفراز³⁶المضيف تحويل^{30،31، 37} قد تم التحقيق على نطاق واسع. لتصميم استراتيجيات لمنع المرض A. tumefaciens بوساطة أو تعزيز التحول النبات، العمليات الأساسية لبقاء A. tumefaciens بحاجة إلى فهم أفضل. استخدام الأصباغ محددة الهدف وتطوير استراتيجية استنزاف البروتين A. tumefaciens¹⁸ الأخيرة توفر وسيلة للتحقيق في العمليات الأساسية.

هنا، يتم توفير بروتوكولات مفصلة للتحليل المجهري سلالات نضوب wildtype والمسخ والبروتين من توميفاسينس أ . البروتوكولين الأول والثاني وصف كيفية إعداد الخلايا وتسميتها بالأصباغ محددة الهدف. ويوفر البروتوكول الثالث توجيهات خطوة بخطوة لإعداد منصات [اغروس] (الشكل 1)، وتصوير الخلايا البكتيرية (الشكل 2، الشكل 3، الشكل 4). قد تكون هذه البروتوكولات أيضا مناسبة للبكتيريا الأخرى مع إجراء تعديلات إضافية لمراعاة ظروف وسائل الإعلام المختلفة ومعدلات النمو ومتطلبات الأكسجين والهياكل الخلية.

Protocol

1-نمو سلالات A. tumefaciens

1. استزراع سلالات A. tumefaciens
   1. استخدام تلميح عصا أو بيبيت خشبية عقيمة لتطعيم 1 مل وسائط النمو أتجن (انظر قائمة المواد للوصفة) مع مستعمرة واحدة من السلالة المرغوبة.
      ملاحظة: لسلالات استنفاد A. tumefaciens ، أتجن ينبغي أن تتضمن 1 مم إيبتج كمحفز الحفاظ على التركيب الحيوي للبروتين الضروري.
   2. زراعة سلالات A. tumefaciens بين عشية وضحاها في أتجن عند 28 درجة مئوية مع الهز 225 لفة في الدقيقة.
   3. قياس الكثافة الضوئية للخلايا في 600 نانومتر (OD₆₀₀) باستخدام جهاز المطياف الضوئي. تمييع ثقافة الخلية إلى OD₆₀₀ = ~0.2 وتستمر في النمو حتى OD₆₀₀ = ~0.6 هو الذي تم التوصل إليه. لسلالات الاستنفاد، وتواصل نموها مع محفز حتى OD₆₀₀ = ~0.6 هو الذي تم التوصل إليه.
   4. استخدام سلالات A. tumefaciens wildtype والمسخ OD₆₀₀ = ~0.6 لتلطيخ محددة الهدف و/أو الوقت الفاصل بين الفحص المجهري (انظر القسمين 2 و 3-1). لسلالات نضوب، تغسل محفز (انظر الفرع 1-2).
2. إزالة محفز لتوصيف سلالات نضوب البروتين A. tumefaciens
   1. بيليه 1 مل ثقافة أسي (OD₆₀₀ = ~0.4-0.6) باستخدام الطرد المركزي في 7,000 س ز لمدة 5 دقائق في سطح مكتب للطرد مركزي في درجة حرارة الغرفة.
   2. ليغسل، إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه في وسائط جديدة دون محفز وبيليه الخلايا كما هو موضح أعلاه (1.2.1). تغسل الخلايا إجمالي 3 مرات في وسائط الإعلام الجديدة.
   3. ريسوسبيند بيليه النهائي في وسائط جديدة وتركيز الخلايا ل التطوير التنظيمي₆₀₀ = ~0.8 لتلطيخ الفوري مع صبغات محددة الهدف (القسم 2 و الشكل 4B-د) أو الوقت الفاصل بين الفحص المجهري (القسم 3.2 و الشكل 4A) . بدلاً من ذلك، قبل استنزاف الخلايا لمقدار الوقت المطلوب بزراعة الخلايا في وسائل الإعلام دون محفز قبل التلوين والتصوير من الخلايا.

2-خاصة بهدف "تلطيخ" الخلايا A. tumefaciens

1. وصف جدار الخلية الأحماض الأمينية د الفلورسنت
   ملاحظة: فداس هي غير سامة الأحماض الأمينية د الفلورسنت التي هي إدماج بسهولة في بيبتيدوجليكان توميفاسينس (أ) . يسبر هذا الإجراء وضع العلامات بسيطة النمو الزخرفة في الخلايا الحية⁶. بروتوكولات لتوليف فداس الأربعة هي المتاحة³⁸.
   1. بيليه 500 ميليلتر للثقافة الأسية (OD₆₀₀ = ~0.4-0.6) باستخدام الطرد المركزي في 7,000 س ز لمدة 5 دقائق في الطرد سطح مكتب. ريسوسبيند بيليه الخلية في 100 ميليلتر من وسائط جديدة.
   2. إضافة 5 ميليلتر من 5 مم فدا لغسلها وتتركز الخلايا واحتضان لمدة 2 دقيقة في الظلام.
      ملاحظة: قصر فدا التعرض للضوء. وقت حضانة ستختلف تبعاً لمعدل النمو للسلالة. عادة، ينبغي أن تكون أوقات الاحتضان 5-10% من الوقت مضاعفة⁶.
   3. بيليه الخلايا بالطرد المركزي وتغسل الكريات الخلية مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ثلاث مرات.
   4. ريسوسبيند بيليه في ~ 50 ميليلتر PBS.
      ملاحظة: قد تختلف استناداً إلى حجم بيليه حجم برنامج تلفزيوني المستخدمة لاستثارة.
   5. تطبيق 0.8-1 ميليلتر خلايا إلى لوح [اغروس] والصورة باستخدام الفحص المجهري ابيفلوريسسينسي فورا (انظر الفرعين 3.1 و 3.2).
      1. وبدلاً من ذلك، وقف المزيد من إدراج التسمية عن طريق تحديد الخلايا مع المثلج 70% إيثانول. ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل من المثلج 70% إيثانول واحتضان في الثلج لمدة 15 دقيقة.
      2. جمع الخلايا بالطرد المركزي وريسوسبيند في كمية صغيرة من برنامج تلفزيوني للتصوير في وقت لاحق. تخزين تعليق خلية في 4 درجات مئوية والصورة في غضون 48 ساعة.
2. الحمض النووي تلطيخ مع DAPI أو وصمة عار البرتقالي
   ملاحظة: لمراقبة الحمض النووي بنية، تتم تسمية الخلايا مع DAPI أو البرتقالي (خلية ميتة وصمة عار). على الرغم من أن الكلاسيكي توصف بأنها "وصمة عار الميت-خلية"، البرتقالي بيرمينت، فوتوستابل، ولا تؤثر على نمو الخلايا البكتيرية، تمكين خلية يعيش الحمض النووي التصوير¹⁰. في توميفاسينس أ، يعمل التوسيم البرتقال جيدا في الخلايا الحية وهي مناسبة للوقت الفاصل بين الفحص المجهري (الشكل 3). وفي المقابل، الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) التعرض للضوء اللازمة للتصوير الملون DAPI الخلايا سمي ضيائي (الشكل 3) وهكذا DAPI تلطيخ الأنسب لتلطيخ الخلايا الحية للتصوير الفوري أو تلطيخ الخلايا الثابتة.
   1. DAPI تلطيخ الخلايا
      1. بيليه 1 مل ثقافة أسي (OD₆₀₀ = ~0.4-0.6) باستخدام الطرد المركزي في 7,000 س ز لمدة 5 دقائق في الطرد سطح مكتب.
      2. بشكل اختياري، لإصلاح الخلايا قبل التلوين، ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل إيثانول المثلج 70%. تبني على الجليد لجمع الخلايا باستخدام الطرد المركزي كما هو موضح في 2.2.1.1 كحد أدنى 10-15.
      3. ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 1 ميليلتر من حل DAPI الأسهم (1 ملغ/مل؛ انظر الجدول المواد). المزيج بلطف بيبيتينج واحتضان لمدة 5 دقائق في الظلام.
      4. بيليه الخلايا باستخدام الطرد المركزي في 7,000 س ز لمدة 5 دقائق وريسوسبيند في 1 مل من برنامج تلفزيوني لإزالة الزائدة DAPI. تغسل الخلايا مرتين أخريين وريسوسبيند بيليه في برنامج تلفزيوني 50 ميليلتر أو وسائل الإعلام.
      5. تطبيق 0.8-1 ميليلتر خلايا إلى لوح [اغروس] والصورة باستخدام الفحص المجهري ابيفلوريسسينسي فورا. راجع المقاطع 3.1 و 3.2.
         ملاحظة: هذا البروتوكول ليس الأمثل للوقت الفاصل بين الفحص المجهري لمراقبة ديناميات كروموسوم (الشكل 3). النظر في استخدام تلطيخ البرتقال كبديل (انظر الفرع 2.2.2).
   2. تلوين البرتقالي للخلايا الحية
   3. بيليه 1 مل ثقافة أسي (OD₆₀₀ = ~0.4-0.6) باستخدام الطرد المركزي في 7,000 س ز لمدة 5 دقائق في الطرد سطح مكتب. ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 1 ميليلتر من حل الأسهم البرتقالي (انظر قائمة المواد). المزيج بلطف بيبيتينج واحتضان لمدة 5 دقائق في الظلام.
   4. بيليه الخلايا بالطرد المركزي وريسوسبيند في 1 مل من برنامج تلفزيوني لإزالة اللون البرتقالي الزائدة. تغسل الخلايا مرتين أخريين وريسوسبيند بيليه في 50 ميليلتر PBS.
   5. تطبيق 0.8-1 ميليلتر خلايا إلى لوح [اغروس] والصورة باستخدام الفحص المجهري ابيفلوريسسينسي فورا. راجع المقاطع 3.1 و 3.2.
      ملاحظة: هذا البروتوكول يعمل بشكل جيد مع الخلايا الحية، وهو مناسبة للوقت الفاصل بين الفحص المجهري لمراقبة ديناميات كروموسوم (الشكل 3). إذا لم يكن ملائماً صورة مباشرة، يمكن إصلاح الخلايا في المثلج 70% إيثانول (انظر الفرع 2.2.1.2).
3. وصف الغشاء
   ملاحظة: صبغة الفلورسنت ستيريل محبتين 4-64 وقد استخدمت على نطاق واسع لمراقبة غشاء الخلايا البكتيرية. خلافا للعديد من البكتيريا، 4-64 المسماة الخلايا توميفاسينس (أ) عدم تسمية موحدة، ولكن بدلاً من ذلك في كثير من الأحيان يحمل^14،نمط "حدوة"¹⁵. اللافت للنظر القطب النمو تقريبا خاليا من وصمة عار حين مكثف يسمى القطب القديم. وهكذا تمكن 4-64 التصور خلية أنماط النمو وهيكل غشاء في توميفاسينس أ.
   1. أضف FM 4-64 إلى تركيز نهائي 8 ميكروغرام/مل في 1 مل من المرحلة الأسية خلية ثقافة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في الظلام.
   2. بيليه الخلايا المسماة بالطرد المركزي في 7,000 س ز لمدة 5 دقائق في سطح مكتب للطرد مركزي وريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل من برنامج تلفزيوني. تغسل الخلايا ما مجموعة ثلاث مرات لإزالة الصبغة الزائدة.
   3. ريسوسبيند الخلايا في كمية صغيرة من برنامج تلفزيوني وعلى الفور جهاز pad [اغروس] صورة مباشرة. (انظر الفرعين 3.1 و 3.2)
      تنبيه: الخلايا يجب تصويرها فورا مراقبة أنماط وضع العلامات المميزة.

3-تصوير الخلايا A. tumefaciens

1. إعداد لوحة [اغروس]
   ملاحظة: يشتمل على الشكل 1 تسلسل الصور (لوحة أ) والتخطيطي (فريق ب) من منصة نموذجية [اغروس] أعدت للوقت الفاصل بين الفحص المجهري. وتعد منصات [اغروس] عادة حسب الحاجة.
   1. 3.1.1. استخدم ساترة كدليل وقص الفيلم 22 مم × 22 مم مربع مختبر (انظر قائمة المواد) عن طريق تشغيل مشرط حول الحواف.
   2. قطع مربع من وسط الفيلم المختبر ترك ~ 2-5 ملم في الحدود بمثابة طوقا اللوحة [اغروس]. تجاهل في الفصل مركز.
   3. وضع طوقا الفيلم إلى شريحة زجاج (75 مم × 25 مم) تنظيف مع الأمونيا ومنظف خال من الكحول (انظر قائمة المواد) وحرارة حتى ذاب الفيلم قليلاً على الزجاج (الصورة العلوية في الشكل 1A). تذوب الفيلم المختبر، استخدم حافة مجموعة كتلة الحرارة إلى 70 درجة مئوية أو تذوب خفيفا على لهب.
   4. إعداد الحل [اغروس] عن طريق خلط ~0.075 ز [اغروس] (انظر قائمة المواد) في 5 مل من وسائل الإعلام في قارورة صغيرة. الحرارة الحل في فرن ميكروويف مع دوامات الدوري للمزيج حتى يذوب في [اغروس] والحل واضح. يبقى الحل [اغروس] في 55-70 درجة مئوية، وتستخدم لبناء منصات [اغروس] متعددة في غضون 48 ساعة.
   5. ماصة الوسائط التي تحتوي على 1.2-1.5% [اغروس] إلى مركز طوقا.
      ملاحظة: حجم وسائل الإعلام هو عادة 50-60 ميليلتر ولكن سوف تختلف باختلاف حجم طوقا. إضافة الوسائط إلى شريحة باردة يمكن أن يسبب [اغروس] يصلب بسرعة كبيرة جداً، وبالتالي الشريحة يجب أن تبقى على سطح دافئة. تعيين حافة كتلة الحرارة إلى 70 درجة مئوية يعمل جيدا. ويمكن استخدام المياه [اغروس] أو حلول مخزنة بشكل مؤقت [اغروس] مثل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) بدلاً من الوسائط التي تحتوي على [اغروس] لتطبيقات فيها نمو الخلايا استمرار غير مطلوب. يمكن للتصوير سلالات نضوب، محفز موجودة أو غائبة في وسائل الإعلام. وجود محفز يمكن استخدامها كعنصر تحكم بينما سوف تكشف عن عدم وجود محفز النمط الظاهري نضوب.
   6. ضع ساترة من فوق طوقا توزيعها بالتساوي [اغروس].
   7. ضع الشريحة على سطح بارد، والمستوى ترسيخ لدقيقة ~ 2 تجنب overdrying لوحة المفاتيح [اغروس] كهذا سيؤدي إلى سطح التجاعيد على لوحة المفاتيح [اغروس] وتجميع تعليق خلية عند تطبيقه على السطح.
   8. الشريحة بعناية ساترة قبالة لوحة المفاتيح [اغروس].
      تنبيه: لا تتعجل هذه الخطوة. يمكن بسهولة المسيل للدموع لوح [اغروس] وجهاز pad متفاوتة [اغروس] يمكن أن يجعل التصوير صعباً.
   9. تسمح لوحة المفاتيح [اغروس] إلى الهواء الجاف لمدة 1-2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة حتى يظهر سطح لوحة جافة. استخدام مشرط، إزالة شريط صغير من [اغروس] لخلق جيب هوائي (وسط الصورة، الشكل 1A)؛ جيب الجوي عادة ~ 2 مم × 7-10 مم والخلايا توميفاسينس (أ) تميل إلى أن تنمو أفضل قرب جيب الجوي (الشكل 1).
      ملاحظة: لتصوير الخلايا الثابتة أو بموجب الشروط التي لا يتم فيها رصد النمو، جيب هوائي غير ضروري.
   10. بقعة 0.8-1 ميليلتر خلايا على لوح [اغروس] وغطاء مع ساترة جديدة. مكان ساترة بلطف عبر الجزء العلوي من لوحة المفاتيح [اغروس] لتوزيع الخلايا عبر سطح اللوحة [اغروس].
   11. ختم حواف ساترة استخدام فالاب المذابة (انظر الجدول المواد لوصفه؛ الشكل 1A، أسفل الصورة). يمكن أن يؤدي الفشل في ختم على طول جميع حواف وزوايا ساترة تجفيف لوحة المفاتيح [اغروس]، مما يؤدي إلى الانجراف الخلايا أثناء التصوير. ملاحظة: وضع ختم ساترة فقط مطلوب لتصوير مرور الزمن الطويل الأجل.

رقم 1: إعداد لوحة [اغروس]- (أ) صورة تسلسل بروتوكول إعداد لوحة [اغروس]. الصورة 1 من شريحة مع طوقا الفيلم المختبر. في الصورة 2، وهي تصور لوح [اغروس] وجيب الجوي. وأخيراً، تظهر لوحة المفاتيح الكاملة [اغروس] مع الخلايا تحت كوفيرجلاس الصورة 3 ومختومة فالاب. (ب) التخطيطي لجهاز pad [اغروس] للفحص المجهري الوقت الفاصل بين يتم توفيرها. الملامح الرئيسية للوحة المفاتيح [اغروس] وصفت في التخطيطي. (ج) جيب الجوي تعزز نمو A. tumefaciens على منصات [اغروس]. تظهر الصور wildtype A. tumefaciens الخلايا المزروعة على منصة [اغروس] لمدة 20 ساعة. تم أخذ صور في مواقع بعيدة متزايدة من جيب الجوي. يتم إظهار المسافة من حافة الصورة الأقرب إلى جيب الجوي فوق كل صورة. شريط المقياس = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

2. تصوير
   ملاحظة: تدخل فرق التباين والتباين المرحلة وتصوير ابيفلوريسسينسي تتم مع مجهر مقلوب مجهزة autofocusing المستندة إلى الأجهزة، مرحلة الآلي، الفلاتر القياسية، مصدر ضوء LED، وغمر النفط X 60 الأهداف (1.4 نا) لمرحلة التباين أو التدخل التفاضلية التباين (DIC)، وكاميرا تهمة-يقترن-جهاز (امككد) ضرب إلكترون ك 1. وينبغي أن توضع المجهر في غرفة التحكم في درجة حرارة. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدامها على المرحلة الأكثر دفئا أو الدائرة للحفاظ على درجات الحرارة متسقة أثناء التصوير.
   1. ابيفلوريسسينسي المجهري
      ملاحظة: لتصوير صف من الخلايا الحية، من الضروري للحد من عدد الحيازات الصورة وتحسين وقت التعرض للتقليل من فوتوبليتشينج والضيائيه. للتصوير من كل صبغة، من المستحسن للبحث عن وقت تعرض أمثل الذي يوفر الكشف عن الأسفار كافية ولكن لا يؤدي إلى فوتوبليتشينج أو الضيائية. وفي الأرقام 2-4، استخدمت أوقات التعرض لمرض التصلب العصبي المتعدد 200 لجميع الأسفار الصور. لتسلسل الزمن الفاصل هو موضح في الشكل 3، الصور تم الحصول عليها كل 10 دقيقة ح 3.
      1. ضع زيت الغمر على الهدف المنشود ومكان الشريحة مقلوب في حامل الشريحة على المسرح. استخدام المقابض التركيز لإحضار الخلايا إلى التركيز.
      2. الحصول على الصور في مرحلة (أو DIC) وعامل التصفية المطلوب الأسفار.
         ملاحظة: أطوال موجية الإثارة والانبعاثات القصوى للبقع المستخدمة في الشكل 2و الشكل 3و رقم 4 كما يلي: هادا (405/460)، وندي (450/555)، والأنشطة الإرهابية والتخريبية (555/570)، 4-64 (515/640)، DAPI (360/460)، والبرتقال (547/570).
   2. الوقت الفاصل بين الفحص المجهري
      ملاحظة: أثناء الفحص المجهري الوقت الفاصل بين الميزات التالية هي الكمبيوتر التي تسيطر عليها: x و y و z الموقف، الستائر، والأسفار المرشحات. نظام تركيز تلقائي المستندة إلى الأجهزة الأمثل للحفاظ على التركيز خلال الوقت الفاصل بين التصوير. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام حلقة التركيز التلقائي المستندة إلى البرامج.
      1. ضع زيت الغمر على الهدف المنشود ومكان الشريحة مقلوب في حامل الشريحة على المسرح. استخدام المقابض التركيز لإحضار الخلايا إلى التركيز.
      2. بشكل اختياري: اكتساب متعددة (x, y) مناصب. حدد عشوائياً 10 حقول من الخلايا بالقرب من جيب الجوي منصات [اغروس].
      3. إعداد وقت اكتساب تسلسل للصورة في المرحلة أو DIC في الفاصل الزمني المطلوب.
         ملاحظة: للتسلسل الزمني الفاصل هو مبين في الشكل 4، تم اقتناء الصور DIC مع التعرض 30 مللي ثانية كل 10 دقيقة ح 14. عند استخدام التصوير الأسفار خلال الوقت الفاصل بين الفحص المجهري، ضبط الوقت الفاصل الزمني والتعرض لاقتناء للتقليل من فوتوبليتشينج والضيائيه.

النتائج

وسم من wildtype محددة الهدف A. tumefaciens الخلايا
بغية توضيح ذلك مورفولوجيا الخلايا لا تتأثر خطوات الغسيل أو المعاملة مع [دمس] 1% (والذي يستخدم لتخفيف الأصباغ الفلورية)، تم تصويرها الخلايا مباشرة من الثقافة (الشكل 2A، الفريق أقصى ال...

Discussion

يحتوي هذا البروتوكول على سلسلة من الإجراءات لتحقيق سلالات A. tumefaciens wildtype والمسخ، ونضوب. تجدر الإشارة إلى أن جميع الإجراءات المدرجة في قسم البروتوكول يمكن أن يسهل تكييفها للسلالات البكتيرية الأخرى مع تعديلات إضافية لمراعاة وسائط النمو ودرجات الحرارة، ومعدلات النمو.

اس?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacterial Strains
Agrobacterium tumefaciens C58	ATCC	33970	Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plasmid required for virulence of Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol 123:255-264.
Agrobacterium tumefaciens C58ΔtetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-ctrA ΔctrA			Figueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. Mini-Tn7 insertion in an artificial attTn7 site enables depeltion of the essentail master regulator CtrA in the phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Media Components
ATGN Minimal Medium			To 1 L of sterilized water add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose. For plates, add 15 g Bacto Agar to 1 L of water and autoclave. Cool to 55 °C and add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose.
20X AT Buffer			Add 214 g/L KH2PO4 to water and adjust pH to 7.0 with sodium hydroxide. Autoclave.
NaOH	Fisher BioReagents	BP359
KH2PO4	Fisher Chemical	P288
20X AT Salts			Add 40 g/L (NH4)2SO4, 3.2 g/L MgSO4•7H2O, 0.2 g/L CaCl2•2H2O, and 0.024 g/L MnSO4•H2O to water. Autoclave.
(NH4)2SO4	Fisher Chemical	A701
MgSO4•7H2O	Fisher BioReagents	BP213
CaCl2•2H2O	Fisher BioReagents	BP510
MnSO4•H2O	Fisher Chemical	M114
Glucose	Fisher Chemical	D16	Prepare 40% stock in water. Filter sterilize.
Bacto Agar	Fisher BioReagents	BP1423	Add 15 g to 1 L of water when preparing plates.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Optional Media Additives
Kanamycin	GoldBio	K-120	Prepare as a 100 mg/ml stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 200 µg/ml.
IPTG	GoldBio	I2481C5	Prepare as a 1 M stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 1 mM as needed for induction.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopy Materials
Microscope Slides	Fisherbrand	12-550D	25 X 75 X 1.0 mm. Clean with Sparkle glass cleaner.
Microscope Cover Glass	Fisherbrand	12-541-B	22 X 22 mm. No. 1.5. Clean with Sparkle glass cleaner.
Sparkle Glass Cleaner	Home Depot	203261385	Ammonia and alcohol free.
Ultra Pure Agarose	Invitrogen	16500-100	Add to water, PBS, or media to a final concentration of 1 - 1.5%. Melt in microwave and place on 70 C
PBS	Fisher BioReagents	BP399500	10X solution to be diluted to 1X with sterile water.
Parafilm	Bemis	PM-999	Laboratory film used as gasket in agarose pad preparation.
VALAP			Add equal weights of lanolin, parafin wax, and petroleum jelly to a conical tube. Heat tube in 70 °C dry, bead or water bath to melt and mix. Apply VALAP while still molten.
Lanolin Butter	SAAQIN	SQ-LAB-R1
Petroleum Jelly	Target Corp.	06-17644
Paraffin Wax	Crafty Candles	263012
Name	Company	Catalog Number	Comments
Target-specific dyes
DMSO	Fisher BioReagents	BP231-1	Use to dilute stock solutions of dyes as needed.
FDAAs (NADA, HADA,TADA)			FDAAs can be synthesized or acquired through agreement with Mike VanNieuwenhze (Indiana University). Prepare 100 mM stock solution in DMSO. Use at a final concentration of 5 mM.
DAPI	ThermoFisher Scientific	62247	Prepare 1 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 1 µg/ml.
SYTOX Orange Nucleic Acid Stain	Invitrogen	S11368	Stock concentration is 5 mM in DMSO. Use at final concentration of 5 µM.
FM4-64	Invitrogen	T3166	Prepare 8 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 8 µg/ml.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Dry bath	Sheldon Manufacturing, Inc.	52120-200
Metallic thermal beads	Lab Armor	42370-002
Epifluorescence microscope equipped with an EMCDD camera			Nikon Eclipse TiE equipped with a QImaging Rolera em-c2 1K electron-multiplying charge-coupled-device (EMCCD) camera is used in this work.