라이브 세포 형광 현미경 검사 법 미생물 세포 성장 하는 동안 필수 과정을 관찰 하

요약

박테리아에 필수적인 프로세스의 기능을 이해은 도전 이다. 대상 특정 염료 형광 현미경 검사 법은 미생물 세포 성장과 세포 주기 진행에 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기, Agrobacterium tumefaciens 모델 박테리아로 필수 프로세스의 특성에 대 한 라이브 셀 이미징에 대 한 방법을 강조 하는 데 사용 됩니다.

초록

세균의 생존에 필수적인 단백질의 기능에 의존 하는 DNA 복제 및 분리, 단백질 합성, 세포 벽 생 합성 및 세포 분열 등의 핵심 세포 프로세스. 이러한 프로세스를 이해 하는 더 나은 프로브로 대상 특정 염료의 시리즈를 사용할 수 있습니다. 닥터지 염료와 염색 법 막 구조 관찰, 지질 microdomains의 시각화 및 막 blebs의 감지 수 있습니다. 형광-d-아미노산 생 합성 peptidoglycan의 사이트를 조사 하는 (FDAAs)의 사용은 세포 벽 속 또는 셀 성장 패턴에 잠재적인 결함을 나타낼 수 있습니다. 마지막으로, 핵 산 얼룩 DNA 복제 또는 염색체 분리 가능한 결함을 나타낼 수 있습니다. Cyanine DNA 레이블 셀 생활 얼룩 되며 시간 경과 현미경 세포 성장 동안 핵양체 형태학의 실시간 관측을 사용에 적합 합니다. 막 구조, 세포 벽 속, 또는 염색체 분리에 결함을 식별 하기 위해 단백질 소모 돌연변이에 셀 라벨에 대 한 프로토콜을 적용할 수 있습니다. 또한, 시간 경과 현미경 모니터 형태학 상 변화는 필수적인 단백질 제거 되 고 단백질 기능에 대 한 추가적인 통찰력을 제공할 수 있습니다 사용할 수 있습니다. 예를 들어 필수 세포 분열 단백질의 고갈 결과 filamentation 또는 분기, 반면 세포 성장 단백질의 고갈 짧은 또는 둥글게 되는 셀을 발생할 수 있습니다. 여기, 세포 성장, 특정 대상 레이블 및 시간 경과 현미경 검사 법 프로토콜 Agrobacterium tumefaciens세균성 식물 병원 체에 대 한 제공 됩니다. 대상 특정 염료 및 시간 경과 현미경에 필수적인 프로세스의 특성을 사용 하는 함께, A. tumefaciens. 마지막으로, 제공 하는 프로토콜 프로브 다른 박테리아에 필수적인 프로세스를 쉽게 수정할 수 있습니다.

서문

세균성 세포 주기 진행, 막과 세포 벽 생 합성, 분리, DNA 복제와 세포 분열을 포함 하 여 많은 프로세스의 필요 합니다. 완벽 하 게 이해 하려면 세균성 세포 생물학의 복잡성, 그것은 이러한 필수 이벤트; 공부 하는 데 필요한 그러나이 통로의 주요 구성 요소는 mutagenized 때 세포 생존 능력은 손상 이후,이 아닌-사소한 작업입니다. 대상 특정 염료와 결합 하는 Epifluorescence 현미경 wildtype 및 돌연변이 세균성 긴장에 필수적인 프로세스를 조사 하는 강력한 접근 이다.

Peptidoglycan 특정 염료 등 형광-d-아미노산 (예를 들어 7-hydroxycoumarin-3-carboxylic 산-3-아미노-d-알라닌, HADA; 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino-d-알라닌이 형광 항생제 (vancomycin-플로리다, bocillin-FL) 나 다; tetramethylrhodamine-3-아미노-d-알라닌; 여 깄 어 요)입니다. 그람 양성 세균에 peptidoglycan 생 합성의 사이트를 조사 하에 형광 항생제 아날로그의 sublethal 농도 사용 하 여 공개 peptidoglycan 삽입 패턴^{1,2, 효과적인 전략 되었습니다. 3,4}. 형광 vancomycin 라벨 삽입 패턴 고정 된 그람 음성 박테리아⁵는 peptidoglycan에 통찰력을 얻을 하는 데 사용 되었습니다, 하는 동안 외부 막 일반적으로 형광의 사용을 방지 하는 침투성 방 벽을 제공 라이브 셀에 peptidoglycan 생 합성에 대 한 조사로 항생제. 반면, 형광-d-아미노산 또는 d-아미노산 biorthogonal 기능 그룹의 짧은 펄스 covalently 살아있는 세균성 세포^6,7의 넓은 범위에 최근 peptidoglycan 삽입의 레이블. 합성 d-아미노산으로 관찰 된 peptidoglycan 삽입의 패턴 등이 punctate septal (대장균 및 새 균의 subtilis), 극 지와 septal (Agrobacterium tumefaciens 및 Listeria monocytogenes), septal만 (황색 포도상구균), 그리고 꼭대기 (Streptomyces venezuelae)^6,7. 이러한 관측 나타냅니다 박테리아 세포 벽 속의 다양 한 패턴을 전시 하 고 합성 d-아미노산 성장 패턴을 조사 하기 위한 조사로의 사용은 많은 박테리아에 귀중 한 전략 이다.

세균 염색체 분류 염료 포함 deoxyribonucleic 산 (DNA) 특정 작은 강 저 바인더 (4, 6-diamidino-2-phenylindole; DAPI)와 높은 선호도 cyanine 염료 (녹색 및 오렌지; 자료 목록 참조). 고정된 셀의 얼룩 DAPI DAPI 라이브 셀의 얼룩은 세균 생존⁹를 나타내는 데 사용 하는 반면 환경 샘플⁸, 박테리아의 열거 지원 합니다. 반면, cyanine 염료와 같은 오렌지와 녹색 자주 설명으로 막 impermeant "죽은" 셀 비 가능한 셀⁹열거 하 얼룩. 놀랍게도, 이러한 시 약은 세포 성장 하는 동안 세균의 핵양체의 형태를 조사 하는 데 사용 됩니다, DAPI, 주황색과 녹색 했다 모든 표시 막 permeant 고 라이브 셀¹⁰라벨의 것. 대장균 세포 살고, DAPI DNA의 얼룩 때문에 자동 형광 확산 세포질에서 나타나고 DAPI 스테인드 셀의 자외선 (UV)에 반복된 노출 perturbs 핵양체 구조¹⁰. 얼룩 대장균 또는 오렌지와 B. subtilis 밝혀이 염료 permeant 막 이며, 세포 성장, DNA 복제, 또는 염색체 분리^{10 영향을 주지 않고 라이브 세포에서 dna 바인딩 시 오랫동안 형광을 제공} . 이러한 관측 cyanine DNA 염료 많은 박테리아의 세포 성장 하는 동안 nucleoids의 형태를 모니터링 하는 데 사용 될 수 있다는 것이 좋습니다.

Phospholipid-specific stryl N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) 페 닐 등 염료) hexatrienyl) pyridinium dibromide (4-64; 참조 자료 목록) 양이온 화합물 및 부정 청구와 우선적으로 연결 인지질 cardiolipin 및 phosphatidylglycerol¹¹등. 독특한 패턴 4-64 다른 박테리아의 멤브레인을 사용 하는 경우 관찰 된다. 대장균, 4-64 측면 벽을 따라 밴드에 폴란드에서 농축 하 고 부서 사이트의 pre-divisional에서¹²세포. 새 균의 subtilis에서 4-64 라벨 지질 나선¹³의 시각화 수 있습니다. Agrobacterium tumefaciens, 4-64 레이블 외부 막 하 고 있는 성장 극은^14,15라벨 없는 특성 "편 자" 패턴에서 관찰 됩니다. 이러한 관찰이이 박테리아 세포 비대칭을 지질 도메인의 존재로 인해 다른 유형의 지질 배포판을 나타납니다. 4-64 확산 라벨의 존재와 같은 표시 패턴의 변화, blebs 또는 소포, invaginations, 또는 막 수축 수 있습니다 배포 또는 지질 생 합성에 영향을 주는 돌연변이 특성화에 유익.

세포를 얼룩이 지기, 넘어 필수 프로세스에 참여 하는 단백질의 기능을 결정은 필요 합니다. 필수 단백질의 특성은 필수 유전자를 삭제 하는 phenotypic 결과 공부 불가능 하기 때문에 기술적으로 도전적 이다. 따라서, 단백질을 고갈 다른 방법 등장 했습니다. 예를 들어 필수 유전자의 네이티브 발기인 보다는 유도할 수 있는 발기인의 컨트롤 아래 놓일 수 있다. 유도할 수 있는 발기인은 반응 작은 분자와 같은; ¹⁶, 이소프로필 β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)^{17,,1819,20,21}, arabinose²²,²³, vanillate^17,아연 xylose²³, 따라서 대상 유전자의 녹음 방송을 중단 하 고 관심사의 단백질은 유도 제거 될 때 고갈. 필수 단백질의 고갈에 대 한 대체 방법이 포함 합성 riboswitches²⁴ CRISPR 간섭^{25,26 대상 유전자의 전사를 방해 작은 분자 RNA 상호 작용을 사용 하} 대상 유전자의 유도할 수 있는 단백질 저하^27,28 ClpXP 효소에 의해 저하에 대 한 대상 단백질을 펩 티 드 태그를 사용 하 여 블록 전사 하. 따라서, 단백질 소모 하는 동안 시간이 지남에 세포의 현미경 이미징 특성에 대 한 강력한 접근은, 세포 생존 능력을 잃기 전에 고갈 긴장 특성화에 대 한 짧은 시간을 제공 합니다. 실제로, 살아있는 세균성 세포의 현미경 연구원 세포 모양 유지 보수, 분 비, 및 구획²⁹의 메커니즘을 포함 하 여 기본적인 생물 학적 과정에 대 한 통찰력을 얻을 수 있게 되었습니다.

A. tumefaciens 는 세균성 식물 병원 체³⁰ 자연 유전자 엔지니어^31,32입니다. 따라서, 메커니즘 관련 pathogenicity를 포함 한 호스트 병원 체 상호 작용^33,,3435, 분 비³⁶및 호스트 변환^{30,31, 37} 광범위 하 게 조사. A. tumefaciens 중재 질병을 방지 하거나 공장 변환 향상 전략, 디자인에 A. tumefaciens 생존을 위한 필수 프로세스 더 나은 이해를 해야 합니다. 대상 특정 염료를 사용 하 여 A. tumefaciens¹⁸ 단백질 소모 전략의 최근 개발 필수 프로세스를 조사 하는 수단을 제공 합니다.

여기, A. tumefaciens 의 wildtype, 돌연변이, 그리고 단백질 소모 긴장의 미세한 분석에 대 한 상세한 프로토콜 제공 됩니다. 처음 두 개의 프로토콜 셀을 준비 하 고 특정 대상 염료로 레이블을 지정 하는 방법을 설명 합니다. 세 번째 프로토콜 agarose 패드 (그림 1)를 준비 하 고 (그림 2, , 그림 3 그림 4) 세균성 세포 이미징에 대 한 단계별 지침을 제공 합니다. 이러한 프로토콜은 다양 한 미디어 조건, 성장 속도, 산소 요구 사항 및 셀 구조에 대 한 계정에 추가 적응으로 다른 박테리아에 대 한 적합 한 수도 있습니다.

프로토콜

1. A. tumefaciens 긴장의 성장

1. A. tumefaciens 종자를 배양
   1. 메 마른 나무 지팡이 또는 피펫으로 팁을 사용 하 여 원하는 긴장의 단일 식민지와 ATGN 성장 매체 (제조 법에 대 한 자료 목록 참조)의 1 mL를 접종.
      참고: A. tumefaciens 고갈 변종에 대 한 ATGN는 필수 단백질의 생 합성을 유지 하기 위해 유도로 1mm IPTG를 포함 해야 합니다.
   2. A. tumefaciens 긴장 하룻밤 225 rpm에서 떨고와 28 ° C에 ATGN에서에서 성장.
   3. 600에서 세포의 광학 밀도 측정 nm (OD₆₀₀)는 분 광 광도 계를 사용 하 여. OD₆₀₀ 세포 배양 희석₆₀₀ 세 성장을 계속 하 고 ~0.2 = = ~0.6에 도달. 고갈 변종, 유도 OD₆₀₀ 까지 성장 계속 = ~0.6에 도달.
   4. OD₆₀₀ 의 A. tumefaciens wildtype 및 돌연변이 체 긴장을 사용 하 여 특정 대상 얼룩 및 시간 경과 현미경 (섹션 2와 3.1 참조) ~0.6 =. 고갈 변종에 대 한 세척 유도 (섹션 1.2 참조.)
2. A. tumefaciens 단백질 소모 종자의 특성에 대 한 유도의 제거
   1. 작은 문화 지 수의 1 mL (OD₆₀₀ = ~0.4-0.6) 실 온에서 데스크톱 원심 분리기에서 5 분 7000 x g에서 원심 분리에 의해.
   2. 세척, 상쾌한 제거 하 고 신선한 미디어 유도 없이 펠 릿 resuspend (1.2.1) 위에서 설명한 대로 셀을 펠 렛. 워시 셀 신선한 미디어에 3 회 총.
   3. 신선한 미디어에 마지막 펠 릿을 resuspend 하 고 OD₆₀₀ 세포 집중 대상 특정 염료 (섹션 2와 그림 4B-D) 또는 시간 경과 현미경 (섹션 3.2 및 그림 4A) 즉시 얼룩에 대 한 ~0.8 = . 또는, 사전 고갈 셀 원하는 시간 동안 미디어 얼룩 및 셀의 이미징 이전 유도 없이 셀을 성장 합니다.

2. 특정 대상 A. tumefaciens 셀의 얼룩

1. 형광 d 아미노 산 성 세포 벽 라벨
   참고: FDAAs는 비 독성 형광 d-아미노산 A. tumefaciens peptidoglycan에 쉽게 통합 됩니다. 이 간단한 라벨링 절차 프로브 성장 라이브 셀⁶패턴화 합니다. 4 개의 FDAAs의 합성에 대 한 프로토콜은 사용할 수³⁸입니다.
   1. 문화 지 수의 500 µ L를 펠 렛 (OD₆₀₀ = ~0.4-0.6) 데스크톱 원심 분리기에서 5 분 7000 x g에서 원심 분리에 의해. 신선한 미디어의 100 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend.
   2. 5mm를 FDAA 세포를 집중 고 어둠 속에서 2 분 동안 품 어 씻어 5 µ L를 추가 합니다.
      참고: 제한 빛을 FDAA 노출. 보육 시간 긴장의 성장 속도 따라 달라 집니다. 일반적으로, 부 화 번 배로 시간⁶의 5-10% 이어야 한다.
   3. 원심 분리에 의해 세포를 작은 고 씻어 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)와 펠 릿 셀 세 번.
   4. ~ 50 µ L PBS에 펠 릿을 resuspend.
      참고: 볼륨 PBS 사용 물의 resuspension의 펠 릿 크기에 따라 달라질 수 있습니다.
   5. 0.8-1 적용 agarose 패드 및 epifluorescence 현미경 즉시 (참조 섹션 3.1 및 3.2)를 사용 하 여 이미지 셀의 µ L.
      1. 또는, 더 차가운 70% 에탄올과 셀을 고정 하 여 레이블 설립을 중지 합니다. 얼음 처럼 차가운 70% 에탄올의 1 mL에 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 15 분 동안 얼음에 품 어.
      2. 원심 분리에 의해 세포를 수집 하 고 나중에 영상에 대 한 PBS의 작은 볼륨에서 resuspend. 48 시간 이내에 4 ° C와 이미지 셀 정지를 저장 합니다.
2. DNA DAPI 또는 주황색 얼룩 얼룩
   참고: DNA 관찰 하 구조, 세포 DAPI 또는 오렌지 (죽은 세포 얼룩)로 표시 됩니다. 고전적인 "죽은 세포 얼룩"로 설명, 오렌지는 permeant, photostable,¹⁰이미징 라이브 세포 DNA를 사용 하는 세균성 세포의 성장에 영향을 미치지 않습니다. A. tumefaciens, 오렌지 라벨 작품 살아있는 세포에서 잘 하 고 시간 경과 현미경 (그림 3)에 적합. 대조적으로, 이미징 DAPI 스테인드 세포에 필요한 자외선 (UV) 빛 노출 phototoxic (그림 3) 이며 따라서 DAPI 얼룩 얼룩 즉시 이미징 또는 고정된 세포를 얼룩이 지기에 대 한 라이브 셀에 대 한 가장 적합 하다.
   1. DAPI 셀의 얼룩
      1. 작은 문화 지 수의 1 mL (OD₆₀₀ = ~0.4-0.6) 데스크톱 원심 분리기에서 5 분 7000 x g에서 원심 분리에 의해.
      2. 필요한 경우 해결 하려면 염색 전에 셀, 70% 얼음 에탄올의 1 mL에 셀 펠 릿 resuspend. 10-15 분으로 원심 분리에 의해 셀 2.2.1.1에 설명 된 수집에 대 한 얼음에 품 어.
      3. 1 ml의 PBS DAPI 재고 솔루션 (1 mg/mL; 참조 자료 테이블)의 1 µ L을 포함 하는 셀 펠 릿 resuspend. Pipetting으로 부드럽게 혼합 하 고 어둠 속에서 5 분 동안 품 어.
      4. 5 분 동안 7000 x g에서 원심 분리 하 여 세포를 작은 고 초과 DAPI를 제거 하는 PBS의 1 mL에 resuspend. 셀을 두 번 더 세척 하 고 50 µ L PBS 또는 미디어에 펠 릿을 resuspend.
      5. 0.8-1 적용 agarose 패드 및 즉시 epifluorescence 현미경 검사 법을 사용 하 여 이미지 셀의 µ L. 3.1 및 3.2 섹션을 참조 하십시오.
         참고:이 프로토콜은 시간 경과 현미경 관찰 염색체 역학 (그림 3)에 대 한 최적의. 주황색 얼룩 (2.2.2 섹션 참조) 대신 사용 하십시오.
   2. 라이브 셀의 오렌지 얼룩
   3. 작은 문화 지 수의 1 mL (OD₆₀₀ = ~0.4-0.6) 데스크톱 원심 분리기에서 5 분 7000 x g에서 원심 분리에 의해. 오렌지 재고 솔루션의 1 µ L을 포함 하는 PBS의 1 mL에 셀 펠 릿 resuspend (자료 목록 참조). Pipetting으로 부드럽게 혼합 하 고 어둠 속에서 5 분 동안 품 어.
   4. 원심 분리에 의해 세포를 작은 고 초과 오렌지를 제거 하는 PBS의 1 mL에 resuspend. 셀을 두 번 더 세척 하 고 50 µ L PBS에 펠 릿을 resuspend.
   5. 0.8-1 적용 agarose 패드 및 즉시 epifluorescence 현미경 검사 법을 사용 하 여 이미지 셀의 µ L. 3.1 및 3.2 섹션을 참조 하십시오.
      참고:이 프로토콜 라이브 세포에서 잘 작동 하 고 염색체 역학 (그림 3) 관찰 시간 경과 현미경에 적합. 그것은 바로 이미지를 편리 하 게, 셀 차가운 70% 에탄올 (참조 섹션 2.2.1.2)에서 수정 수 있습니다.
3. 막 라벨
   참고: 닥터지 styryl 형광 염료 4-64 사용 되었습니다 광범위 하 게 세균 세포의 막을 관찰 하. 많은 박테리아와 달리 4-64 A. tumefaciens 셀 표시 균일 하 게, 레이블을 하지 않습니다 하지만 오히려 자주 "편 자" 패턴^14,15전시. 놀랍게도, 반면 오래 된 극 하지 표시 달아 얼룩 없는 거의 성장 극이 이다. 따라서, 4-64 A. tumefaciens에 막 구조와 세포 성장 패턴의 시각화 수 있습니다.
   1. 지 수 단계 세포 배양의 1ml에 8 µ g/mL의 최종 농도에 FM 4-64를 추가 하 고 어둠 속에서 5 분 동안 실 온에서 품 어.
   2. 탁상용 원심 분리기에 5 분 동안 7000 x g에서 원심 분리 하 여 레이블이 지정 된 셀을 작은 고 1 mL의 PBS에 셀 펠 릿 resuspend. 워시 셀 과잉 염료를 제거 하는 데 세 번의 총.
   3. PBS의 및 즉시 이미지를 agarose 패드에 자리 작은 볼륨에서 셀 resuspend (섹션 3.1 및 3.2 참조)
      주의: 셀 해야 합니다 수 몇 군데 즉시 특성 라벨 패턴을 관찰 하는 것.

3. A. tumefaciens 셀의 이미징

1. Agarose 패드 준비
   참고: 그림 1 에 이미지 시퀀스 (패널 A)과 시간 경과 현미경 검사 법에 대 한 준비는 전형적인 agarose 패드의 회로도 (패널 B)가 포함 되어 있습니다. Agarose 패드는 일반적으로 필요에 따라 준비 됩니다.
   1. 3.1.1. 가이드와 컷은 22 m m x 22 m m 실험실의 광장 가장자리 주위 메스를 실행 하 여 (자료 목록 참조) 영화는 coverslip를 사용 합니다.
   2. ~ 2-5를 떠나 실험실 영화 센터 잘라 사각형 agarose 패드에 대 한 가스 켓으로 m m 테두리. 센터 컷아웃을 삭제 합니다.
   3. 영화 가스 켓 (자료 목록 참조)는 암모니아 및 알코올 무료 청소기 청소 유리 슬라이드 (75 m m x 25 m m)에 배치 하 고 영화는 약간 유리 ( 그림 1A에서 상단 이미지)에 녹을 때까지 열. 녹기 연구소 영화, 70 ° C로 열 블록 설정의 가장자리를 사용 하 여 또는 프레임 가볍게 녹아.
   4. Agarose 솔루션 ~0.075 g agarose를 혼합 하 여 준비 (자료 목록 참조) 작은 플라스 크에서 미디어의 5 ml에서. 열 믹스는 agarose 해산 때까지 솔루션을 주기적으로 소용돌이 함께 전자 레인지에서 솔루션은 분명 하다. Agarose 솔루션 55-70 ° C에서 유지 하 고 48 시간 안에 여러 agarose 패드의 건설에 대 한 사용.
   5. 피 펫 미디어는 가스 켓의 중심으로 1.2-1.5 %agarose 포함.
      참고: 미디어의 볼륨은 일반적으로 50-60 µ L 하지만 가스 켓 크기에 따라 달라 집니다. 추가 미디어 감기 슬라이드를 너무 빨리 응고 agarose를 발생할 수 있습니다, 따라서 슬라이드 보관 해야 따뜻한 표면에. 열 블록의 가장자리 설정 70 ° C 작동 잘 합니다. 물 agarose 또는 버퍼링된 agarose 솔루션 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) agarose는 지속적인된 세포 성장 필요 하지 않습니다 응용 프로그램 포함 된 미디어 대신 사용할 수 있습니다. 고갈 긴장 이미징, 유도 될 수 있습니다 제시 또는 미디어에서 결 석. 반면 유도의 부재는 소모 형을 발표할 예정 이다 유도의 존재는 컨트롤로 사용할 수 있습니다.
   6. 장소는 coverslip 균일 하 게 배포는 agarose 가스 켓.
   7. Agarose 패드에 세포 현 탁 액 표면에 적용 될 때의 풀링 주름된 표면에 발생이 ~ 2 분 피 agarose 패드의 overdrying에 대 한 응고에 멋진, 레벨 표면에 슬라이드를 놓습니다.
   8. Agarose 패드에서 coverslip 조심 스럽게 미십시오.
      주의:이 단계를 돌진 하지 마십시오. Agarose 패드 쉽게 찢을 수 있다 그리고 고르지 못한 agarose 패드 어려운 이미지를 만들 수 있습니다.
   9. 허용 공기 agarose 패드 1-2 분에 대 한 건조 실 온에서 패드의 표면 건조가 나타날 때까지. Agarose 만드는 공기 주머니 (중간 이미지, 그림 1A);의 작은 스트립을 제거 메스를 사용 하 여 공기 주머니 일반적으로 ~ 2 m m x 7-10 m m 이며 A. tumefaciens 셀 공기 주머니 (그림 1C) 근처 최고의 성장 하는 경향이 있다.
      참고: 이미징 고정 셀 또는 성장 모니터링 되지 않습니다 조건, 공기 주머니는 필요 하지 않습니다.
   10. 자리 0.8-1 µ L agarose 패드와 새로운 coverslip 커버에 셀의. 부드럽게 agarose 패드의 표면에 세포를 분산을 agarose 패드 위에 coverslip 장소.
   11. 녹 인된 VALAP를 사용 하 여 하는 coverslip의 가장자리를 밀봉 (제조 법; 자료 표 참조 그림 1A, 하단 이미지). 모든 가장자리와 모서리는 coverslip의 인감을 실패 이미징 동안 셀의 표류로 이어질 것입니다 agarose 패드의 건조를 일으킬 수 있습니다. 참고:는 coverslip의 씰링만 장기 시간 경과 영상에 대 한 필요 합니다.

그림 1: Agarose 패드 준비. (A) agarose 패드 준비 프로토콜의 순서를 이미지. 이미지 1 실험실 영화 가스 켓과 슬라이드입니다. 이미지 2, agarose 패드와 공기 주머니 시각화 됩니다. 마지막으로 이미지 3 전체 agarose 패드는 coverglass 아래 셀으로 표시 하 고 VALAP 봉인. 시간 경과입니다 agarose 패드의 (B) 회로도 제공 됩니다. Agarose 패드의 주요 특징은 회로도에 표시 되어 있습니다. (C) 공기 주머니 agarose 패드에 A. tumefaciens 성장의 승진. 20 시간 동안 agarose 패드에 성장 wildtype A. tumefaciens 셀의 이미지 표시 됩니다. 이미지는 점점 공기 주머니에서 먼 위치에 촬영 했다. 이미지의 가장 가까운 가장자리에서 거리 공기 주머니를 각 이미지 위에 표시 됩니다. 눈금 막대 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

2. 이미징
   참고: 미분 간섭 명암, 위상 대조 및 epifluorescence 이미징 하드웨어 기반 autofocusing, 자동화 된 단계, 표준 필터, LED 광원, 60 X 기름 침수 거꾸로 현미경으로 수행 됩니다. 단계 대조 또는 차동 간섭 콘트라스트 (DIC), 목표 (1.4 없음) 고 1 K 전자 멀티 충전-결합-장치 (EMCCD) 카메라. 현미경은 온도 제어 룸에 배치 되어야 합니다. 또는 따뜻한 무대 또는 챔버 이미징 동안 일관 된 온도 유지 하기 위해 사용할 수 있습니다.
   1. Epifluorescence 현미경 검사 법
      참고: 라이브 셀의 형광 이미징, 그것은 이미지 취득의 수를 제한 하 고 photobleaching 및 phototoxicity을 최소화 하기 위해 노출 시간을 최적화 하는 데 필요한. 각 염료의 이미지에 대 한 충분 한 형광 탐지를 제공 하지만 photobleaching 또는 phototoxicity로 이어질 하지 않는 최적의 노출 시간을 찾을 수는 것이 좋습니다. 그림 2-4, 200 ms의 노출 시간 모든 형광 이미지 사용 되었다. 그림 3에 표시 된 시간 시퀀스에 대 한 이미지 3 시간 마다 10 분을 인수 했다.
      1. 원하는 목표에 침수 기름을 놓고 거꾸로 슬라이드 슬라이드 홀더에 스테이지에 배치 합니다. 초점 조절 손잡이 사용 하 여 초점으로 셀을가지고.
      2. 취득 단계 (DIC)에 이미지와 원하는 형광 필터.
         참고: 그림 2, 그림 3및 그림 4 에서 사용 하는 얼룩에 대 한 최대한의 여기 및 방출 파장은 다음과 같습니다: HADA (405/460), 나 (450/555) 다, 타다 (555/570), 4-64 (515/640), DAPI (360/460), 오렌지 (547/570).
   2. 시간 경과 현미경
      참고: 시간 경과 현미경 검사 법 중 다음 특징은 컴퓨터 제어: x, y, 및 z 위치, 셔터, 및 형광 필터. 하드웨어 기반 자동 초점 시스템은 시간 경과 영상 동안 초점을 유지 하기 위해 최적의. 또한, 소프트웨어 기반 자동 초점 루프를 사용할 수 있습니다.
      1. 원하는 목표에 침수 기름을 놓고 거꾸로 슬라이드 슬라이드 홀더에 스테이지에 배치 합니다. 초점 조절 손잡이 사용 하 여 초점으로 셀을가지고.
      2. 필요한 경우: 취득 여러 (x, y) 위치. 임의로 agarose 패드의 공기 주머니에 가까운 근접에서 셀의 10 필드를 선택 합니다.
      3. 시간 순서 인수 이미지 단계 또는 DIC에 원하는 시간 간격 설정 했다.
         참고: 그림 4에 표시 된 시간 시퀀스에 대 한 DIC 이미지 30 ms 노출 14 h에 대 한 모든 10 분 인수 했다. 시간 경과 현미경 중 형광 이미징 사용 하 여, photobleaching 및 phototoxicity을 최소화 하기 위해 수집 간격 및 노출 시간을 조정 합니다.

결과

대상별 wildtype의 라벨 A. tumefaciens 셀
그 셀 형태를 설명 하기 위해 영향을 받지 않습니다 세척 단계 또는 (는 형광 염료를 희석 하는 데 사용 됩니다) 1 %DMSO 치료, 세포로 세포 세척 후 문화 (그림 2A, 맨 왼쪽된 패널)에서 직접 몇 군데 있었다 원심 분리 1.2 (그림 2A, 왼쪽된 패널), 또?...

토론

이 프로토콜에는 A. tumefaciens wildtype, 돌연변이, 그리고 소모 긴장의 조사에 대 한 절차의 일련을 포함 되어 있습니다. 그것은 프로토콜 섹션에 나열 된 절차의 모든 성장 매체, 온도, 및 성장 속도 대 한 계정에 추가 수정 다른 세균성 긴장에 쉽게 적용할 수 있습니다 지적 가치가 있다.

대상 특정 염료를 사용 하 여 세균성 세포에서 세포 주기 이벤트의 상세한 묘사를 제?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacterial Strains
Agrobacterium tumefaciens C58	ATCC	33970	Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plasmid required for virulence of Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol 123:255-264.
Agrobacterium tumefaciens C58ΔtetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-ctrA ΔctrA			Figueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. Mini-Tn7 insertion in an artificial attTn7 site enables depeltion of the essentail master regulator CtrA in the phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Media Components
ATGN Minimal Medium			To 1 L of sterilized water add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose. For plates, add 15 g Bacto Agar to 1 L of water and autoclave. Cool to 55 °C and add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose.
20X AT Buffer			Add 214 g/L KH2PO4 to water and adjust pH to 7.0 with sodium hydroxide. Autoclave.
NaOH	Fisher BioReagents	BP359
KH2PO4	Fisher Chemical	P288
20X AT Salts			Add 40 g/L (NH4)2SO4, 3.2 g/L MgSO4•7H2O, 0.2 g/L CaCl2•2H2O, and 0.024 g/L MnSO4•H2O to water. Autoclave.
(NH4)2SO4	Fisher Chemical	A701
MgSO4•7H2O	Fisher BioReagents	BP213
CaCl2•2H2O	Fisher BioReagents	BP510
MnSO4•H2O	Fisher Chemical	M114
Glucose	Fisher Chemical	D16	Prepare 40% stock in water. Filter sterilize.
Bacto Agar	Fisher BioReagents	BP1423	Add 15 g to 1 L of water when preparing plates.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Optional Media Additives
Kanamycin	GoldBio	K-120	Prepare as a 100 mg/ml stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 200 µg/ml.
IPTG	GoldBio	I2481C5	Prepare as a 1 M stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 1 mM as needed for induction.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopy Materials
Microscope Slides	Fisherbrand	12-550D	25 X 75 X 1.0 mm. Clean with Sparkle glass cleaner.
Microscope Cover Glass	Fisherbrand	12-541-B	22 X 22 mm. No. 1.5. Clean with Sparkle glass cleaner.
Sparkle Glass Cleaner	Home Depot	203261385	Ammonia and alcohol free.
Ultra Pure Agarose	Invitrogen	16500-100	Add to water, PBS, or media to a final concentration of 1 - 1.5%. Melt in microwave and place on 70 C
PBS	Fisher BioReagents	BP399500	10X solution to be diluted to 1X with sterile water.
Parafilm	Bemis	PM-999	Laboratory film used as gasket in agarose pad preparation.
VALAP			Add equal weights of lanolin, parafin wax, and petroleum jelly to a conical tube. Heat tube in 70 °C dry, bead or water bath to melt and mix. Apply VALAP while still molten.
Lanolin Butter	SAAQIN	SQ-LAB-R1
Petroleum Jelly	Target Corp.	06-17644
Paraffin Wax	Crafty Candles	263012
Name	Company	Catalog Number	Comments
Target-specific dyes
DMSO	Fisher BioReagents	BP231-1	Use to dilute stock solutions of dyes as needed.
FDAAs (NADA, HADA,TADA)			FDAAs can be synthesized or acquired through agreement with Mike VanNieuwenhze (Indiana University). Prepare 100 mM stock solution in DMSO. Use at a final concentration of 5 mM.
DAPI	ThermoFisher Scientific	62247	Prepare 1 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 1 µg/ml.
SYTOX Orange Nucleic Acid Stain	Invitrogen	S11368	Stock concentration is 5 mM in DMSO. Use at final concentration of 5 µM.
FM4-64	Invitrogen	T3166	Prepare 8 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 8 µg/ml.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Dry bath	Sheldon Manufacturing, Inc.	52120-200
Metallic thermal beads	Lab Armor	42370-002
Epifluorescence microscope equipped with an EMCDD camera			Nikon Eclipse TiE equipped with a QImaging Rolera em-c2 1K electron-multiplying charge-coupled-device (EMCCD) camera is used in this work.