فحص الآلي سريع جيوتاكسيس سلبية متكررة لتحليل سلوك التسلق الكبار في نموذج المورفولوجية نيوروديجينيريشن

Summary

ويحلل هذا البروتوكول خطوة بخطوة المورفولوجية جيوتاكسيس السلبية سلوك استخدام نظام اسطوانة متعددة يستضيف مئات ذباب ويزامن أعمالهم بمحرك كهربائي. عند المزامنة، هو جزيئي السلوك جيوتاكسيس السلبية يطير، المسجلة رقمياً، وتم تحليلها باستخدام البرمجيات رفليديتيكشن المصممة ذاتيا.

Abstract

أمراض الأعصاب ترتبط كثيرا فقدان تدريجي لقدرة الحركة وانخفاض العمر المتوقع نيوروديجينيريشن تعتمد على العمر. لفهم هذه الآلية الخلوية هذه الأحداث، وعلاقاتها السببية مع بعضها البعض، melanogaster المورفولوجية، مع أدوات الجينية متطورة ومميزات سلوكية متنوعة، تستخدم كنماذج المرض لتقييم تعمل الأعصاب. هنا يمكننا وصف أسلوب الفائق لتحليل سلوك الكبار جيوتاكسيس السلبية المورفولوجية ، كمؤشر لعيوب السيارات المرتبطة نيوروديجينيريشن. جهاز الآلي تم تصميمه وتطويره بالتزامن يطير محرك الأقراص باستخدام دفعة كهربائية أولية، في وقت لاحق مما يتيح تسجيل السلوك السلبي جيوتاكسيس وخلال ثوان إلى دقيقة. ثم تتم معالجة الصور من الفيديو المسجلة رقمياً مع برنامج رفليديتيكشن الذاتي المصممة لمعالجة البيانات الإحصائية. مختلفة من الإنزيم جيوتاكسيس السلبية التي تسيطر عليها يدوياً استناداً إلى ذبابة واحدة، يسمح هذا البروتوكول دقيقة وسريعة، والفائق الحصول على البيانات من أكثر من مئات ذباب في الوقت ذاته، توفير نهج فعالة للنهوض بموقعنا فهم في هذه الآلية الكامنة وراء العجز الحركي المرتبطة نيوروديجينيريشن.

Introduction

وقد وضعت مجموعة متنوعة من بروتوكولات وأساليب لتحليل سلوك التسلق الكبار المورفولوجية . بل شاقة، التحليل التقليدي معظمها ينطوي على وضع ذبابة واحدة قنينة فردية ويستخدم قوة يدوية للاستفادة من الذباب إلى أسفل لمزامنة^1،2،3،4. هي شاقة وتستغرق وقتاً طويلاً، وغير ملائمة للدراسات العالية الإنتاجية الكبيرة، والاختلافات المحتملة للقوة اليدوية المستخدمة للاستفادة من انخفاض الذباب، فضلا عن القيود الأخرى. تحسين المقايسة، وضعت مقايسة جيوتاكسيس سلبية تكرارية سريع (الدائري) الذي يسمح تحليل الفائق على مدى العديد من الذباب في الوقت نفسه⁵. بيد الفحص لا يزال يتطلب قوة ممارسة يدوياً لمزامنة العمل يطير. لدينا نسخة التحليل الدائري، نقحت بناء على التحليل السابق، يتضمن قاعدة معدنية لاستضافة عدة قنينات المحتوية على الطاير تلقائياً يسيطر عليها محرك كهربائي محرك تزامن يطير⁶. عند التسجيل، حلل الطاير تسلق فورا بعد أن يتم تسجيل المزامنة ثم استخدام برمجيات مصممة ذاتيا. لدينا المقايسة خاتم الآلي إلغاء عملية شاقة وتتطلب عمالة مكثفة في جمع البيانات من ذبابة واحدة، واحدة في كل مرة، وتمكين عملية الحصول على البيانات لتكون أكثر كفاءة. وبالإضافة إلى ذلك، استخدمت مقايسة خاتم الآلي في عدد من الدراسات توضيح الآلية الكامنة وراء مرض الزهايمر ومرض باركنسون، التحقق من صحة النهج مع كفاءة عالية^7،8،9 .

في هذه المقالة، نبدي المقايسة خاتم الآلي باستخدام DDC Gal4 مدفوعة [رني] الذباب. DDC-Gal4 خط Gal4 على وجه الخصوص معربا عن تتميز (دا) وهرمون السيروتونين من الخلايا العصبية، وبالتالي تمثل أداة عظيمة لتحليل تأثيرات الجينات المستهدفة المرتبطة بالعجز الحركي المرافقين نيوروديجينيريشن¹⁰. وبالإضافة إلى ذلك، يمكننا إدراج UAS-Dicer2، خط الطيران الذي يعزز كفاءة [رني]، لتوليد UAS-Dicer2؛ DDC-Gal4 أداة الخط. [رني] الذباب نختار لاستخدام هو أوكسيلين (aux) v16182 [رني] (عازر¹⁶¹⁸²)، تطير جينات التي حددناها سابقا المعرض لها تأثير على النشاط الحركي⁸. أوكسجفب الذباب مستعدون أيضا لتحليل آثار aux overexpression. ونحن سوف تظهر كيفية استخدام التحليل الدائري الآلي لقياس يطير جيوتاكسيس السلبية وتقديم النتائج ومناقشة أي آثار تم الحصول عليها من النتائج.

Protocol

1-"جمع يطير"

1. الحفاظ على الذباب على الطعام يطير القياسية في 25 درجة مئوية، والرطوبة 70%، ودائرة ضوء/الظلام ح 12/12 ح.
2. جمع UAS -Dicer2؛ DDC-GAL4 فيرجينسوندير يطير غاز ثاني أكسيد الكربون (CO ₂) التخدير.
3. عبور هذه العذارى للذباب الذكور البالغين 2 يوم من العمر يحمل الأنماط الوراثية التالية: UAS-mCD8GFP (المراقبة)، عازر ¹⁶¹⁸² (aux [رني]) ، أوكسجفب (aux overexpression)، و عازر ¹⁶¹⁸²؛ أوكسجفب (الإنقاذ)، مع الذكور: الإناث نسبة 1:2.
4. بشكل منفصل جمع حديثا اكلوسيد الذكور والإناث في قنينات 3 لكل مجموعة لكل تجربة، وضع الذباب 10 في كل قنينة الطيران العادية مع الغذاء القياسية في 25 درجة مئوية.
5. اعتماداً على التجربة، الاحتفاظ جمع الذباب تصل إلى 35 يوما واستخدامها لتحليل الحلقة الآلي في يوم 5 و 15، 25 و 35-

2. الآلي المقايسة خاتم

1. 10 نقل الذباب المجمعة (الجنسين) في النمط الوراثي في كل فيال، ثم تأمين القنينة مع المسمار. تحليل مراقبة الذباب والذباب يحمل الأنماط الجينية المختلفة معا لكل مجموعة من التجارب (ما يصل إلى 10 زجاجة في نفس الوقت، الذباب 10 في كل قنينة).
2. تشغيل الكاميرا الرقمية التي توضع أمام الجهاز، وبدء تسجيل مرة واحدة الذباب جميع محملة وجاهزة-
3. بعد السماح 1 دقيقة للذباب لتسوية في قارورة، قم بتشغيل وحدة تحكم الخطوة التي يتحكم السائق خطوة؛ وهذا يدفع محرك كهربائي صغير للتحكم في ذراع المرفقة حيث أن يرتفع تباعا وصنابير الجهاز 4 مرات في 2 ثانية. انظر الشكل 1.
   1. بعد التنصت، علما أن الذباب تبدأ بالصعود الجدار. ضمان استمرار تسجيل.
4. تكرار التزامن كما هو موضح في الخطوة 2.3 في الفاصل الزمني 60-s للمحاكمات على التوالي 3 إلى 5-
5. كرر التجربة 5، 15، 25، والذباب 35 يوم من العمر. إجراء تجارب مستقلة على الأقل 3 لكل مجموعة، وكل تجربة مع مالا يقل عن 30 المجمعة الذباب (3 قنينات).

3. تحليل بيانات

1. استيراد الفيديو المسجلة إلى الكمبيوتر-
2. أخذ لقطة من الفيديو في 6 s بعد التنصت، لكل محاكمة.
3. استيراد الصورة اللقطة إلى البرنامج رفليديتيكتيون (انظر الشكل 2)، باستخدام ' ملف ' القائمة.
4. تعيين خطوط الأساس العلوي والسفلي من القنينة تحديداً باستخدام رمز خط على شريط الأدوات، ثم استخدام المؤشر لوضع علامة على خطوط الأساس العلوي والسفلي في الصورة-
5. إدخال عدد الذباب كل قنينة (مثلاً، 10 هنا) في ' الذباب في المستطيل ' طول الحقل والقنينة (مثلاً، هنا 14 سم) في ' "ارتفاع أنبوب" ' الميدانية داخل شريط الإعدادات.
   1. علما بأن المواقف يطير الفردية التي تم الكشف عنها والمسمى بالنقاط على الشاشة لكل قنينة.
      ملاحظة: يشير الرقم 2 إلى مواقف جميع نقرات زر القائمة-
6. علما بأن البرنامج يحدد مسافة التسلق لكل ذبابة تلقائياً ويعرض القيم متوسط من الذباب 10 في كل قنينة في جدول على اللوحة اليمنى. (انظر الشكل 2)
7. عملية عدد التسلق مع البرامج الإحصائية (مثلاً، المنشور) لمزيد من التحليل الإحصائي-
8. هذا يعني البيانات ك ± sem.
9. حساب فقيم ذات أهمية (يشار إليه بعلامات نجمية، * ف < 0.05، * * ف < 0.01، * * * ف < 0.001) استخدام ANOVA أحادي الاتجاه مع بونفيروني متعددة مقارنة test.

النتائج

يوضح هذا المقال استخدام مقايسة خاتم الآلي في تقييم سلوك الذبابة جيوتاكسيس السلبية. خلافا للمقايسة الحلقة السابقة، يتضمن المقايسة لدينا جهاز الآلي الذي يوفر قوة كهربائية لمزامنة العمل يطير ويحلل تصل إلى مئات ذباب في وقت واحد (الشكل 1). تحليل Dicer2 ؛ DDC > ع...

Discussion

مقايسة خاتم الآلي الموصوفة هنا يتيح تحليلاً الفائق للسلوك جيوتاكسيس السلبية يطير لمئات ذباب في وقت واحد. سابقا تنطوي الاستراتيجيات القائمة لتحليل تسلق الكبار ملاحظات ذبابة واحدة في قنينة فردية، والكشف عن موقف يطير يدوياً بواسطة العين. في بعض الأحيان قد يسبب هذه العملية شاقة بدلاً من قرا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forma Environmental Chamber	Thermo	3949
Carbon dioxide cylinders	FuLian GAS Technology	GB/T6052
HDR-Camcorder	SONY	HDR-CX220E
Binocular stereomicroscope	Xin Zhen	SMZ-168BL
Electronic scales	MinQiao	SL1002N
Refrigerator	Haier	SC-350
Agar-agar powder	Sinopharm	10000561
Glucose	Sinopharm	10010518
Corn meal	Sinopharm	5464654
Brown sugar	LiuCaiYuan	45467936
Instant dry yeast	AB MAURI	20886
AuxR16182	VDRC	7187
UAS-Dicer2	Bloomington	24650
UAS-mCD8GFP	Bloomington	32185
DDC-Gal4			A gift from Fude Huang
AuxGFP			A gift from Henry Chang