Un dosage automatisé rapide géotaxie négative itérative pour analyser le comportement d’escalade adultes dans un modèle drosophile de la neurodégénérescence

Résumé

Ce protocole étape par étape analyse le comportement de géotaxie négative de drosophile à l’aide d’un système automatisé de multicylindre qui héberge des centaines de mouches et synchronise leur action par un moteur électrique. Lors de la synchronisation, comportement de la mouche géotaxie négative est analysé, enregistrés numériquement et analysées en utilisant le logiciel RflyDetection individu-conçu.

Résumé

Les maladies neurodégénératives sont fréquemment associées à une perte progressive de la capacité de mouvement, la durée de vie réduite et neurodégénérescence âge-dépendante. Pour comprendre le mécanisme cellulaire ces événements et leurs relations causales entre eux, Drosophila melanogaster, avec ses outils génétiques complexes et diverses caractéristiques comportementales, sont utilisées comme modèles de maladies pour évaluer neurodégénératives phénotypes. Nous décrivons ici une méthode de haut-débit pour analyser le comportement de drosophile adulte géotaxie négative, comme une indication pour d’éventuels vices moteurs associé de neurodégénérescence. Une machine automatisée est conçue et développée à la synchronisation de mouche en voiture à l’aide d’une impulsion électrique initiale, plus tard ce qui permet l’enregistrement de comportement géotaxie négative sur un parcours de secondes à minutes. Images de la vidéo enregistrée numériquement sont ensuite traitées avec le logiciel RflyDetection individu-conçu pour la manipulation de données statistiques. Différent de l’essai de commande manuelle géotaxie négative basé à volée unique, ce protocole précis, rapide et haut-débit permet d’acquisition de données de plus de centaines de mouches en même temps, fournissant une approche efficace pour faire progresser notre comprendre le mécanisme sous-jacent de déficits locomoteurs liés à la neurodégénérescence.

Introduction

Une variété de protocoles et méthodes ont été développées pour analyser le comportement escalade adulte de drosophile . Plutôt laborieux, l’analyse traditionnelle pour la plupart consiste à introduire une seule mouche dans un flacon individuel et utilise une force manuelle pour robinet mouches vers le bas pour la synchronisation^1,2,3,4. C’est fastidieux et chronophage, inadapté pour des études de haut débit grande et a des variations potentielles de la force manuelle utilisée pour taper sur les mouches, mais aussi les autres limitations. Pour améliorer le dosage, un rapide géotaxie négative itératif (RING) a été développé qui permet l’analyse de haut-débit au fil de nombreuses mouches dans le même temps⁵. Toutefois, le dosage nécessite toujours une force exerçant manuellement pour synchroniser l’action voler. Notre version de l’essai de l’anneau, révisé lors de l’essai précédent, comprend une base métallique hébergement plusieurs flacons contenant du mouche contrôlées automatiquement par un moteur électrique à entraînement synchronisation volant⁶. Dès l’enregistrement, la mouche montée immédiatement après que synchronisation est enregistrée puis analysées à l’aide d’un logiciel autonome conçu. Notre essai automatisé de RING a éliminé le processus fastidieux et fastidieux à collecter des données d’une seule mouche, un à la fois et activé le processus d’acquisition de données d’être plus efficace. En outre, le test automatisé de RING a été employé dans un certain nombre d’études visant à élucider le mécanisme sous-jacent de maladie d’Alzheimer et de Parkinson, valider l’approche avec le rendement élevé^7,8,9 .

Dans cet article, nous démontrons l’essai anneau automatisé à l’aide de la DDC-Gal4 piloté par ARNi mouches. DDC-Gal4 est une ligne de Gal4 exprimant spécifiquement dans dopaminergique (DA) et les neurones sérotoninergiques, ce qui représente un excellent outil pour analyser les effets du gène cible associées à des déficits locomoteurs accompagnant la neurodégénérescence¹⁰. En outre, nous incorporons SAMU-Dicer2, une ligne de mouche qui améliore l’efficacité de l’ARNi, pour générer le SAMU-Dicer2 ; DDC-Gal4 outil ligne. Les mouches d’Arni, nous choisissons d’utiliser est auxilin (aux), Arni v16182 (auxR¹⁶¹⁸²), un gène que nous avons précédemment identifiées afin de présenter un effet sur voler l’activité locomotrice,⁸. auxGFP mouches sont également préparés pour analyser les effets sur la surexpression aux . Nous allons montrer comment utiliser le test automatisé de RING pour mesurer mouche géotaxie négative, présenter les résultats et discuter des implications acquises à partir des résultats.

Protocole

1. fly Collection

1. maintenir les mouches sur la norme alimentaire mouche à 25 ° C, 70 % d’humidité et un cycle lumière/obscurité de 12 h/12 h.
2. Recueillir SAMU-Dicer2 ; DDC-GAL4 mouche virginsunder dioxyde de carbone (CO ₂) anesthésie.
3. Traverser ces vierges à 2 jours vieux mouches mâles adultes transportant les génotypes suivants : SAMU-mCD8GFP (contrôle), auxR ¹⁶¹⁸² (aux ARNi) auxGFP (aux surexpression), et auxR ¹⁶¹⁸² ; auxGFP (sauvetage), avec un mâle : femelle ratio de 1:2.
4. Séparément recueillir nouvellement éclos mâles et femelles en 3 flacons pour chaque groupe par expérience, plaçant 10 mouches dans chaque flacon mouche ordinaire avec de la nourriture standard à 25 ° C.
5. Selon l’expérience, gardez la collecte vole jusqu'à 35 jours et les utiliser pour l’analyse automatisée des anneaux au jour 5, 15, 25 et 35.

2. ANNEAU de dosage automatisé

1. transférer 10 mouches collectées (unisexe) par génotype dans chaque flacon, puis fixer la cuvette avec une vis. Analyser le contrôle mouches et mouches transportant des génotypes différents ensemble pour chaque série d’expériences (jusqu'à 10 flacons en même temps, 10 mouches dans chaque flacon).
2. Allumez l’appareil photo numérique placé devant l’appareil et commencer à enregistrer une fois les mouches est tout équipé et prêt.
3. Après avoir laissé 1 min pour les mouches de s’installer dans des flacons, tourner sur le contrôleur de l’étape qui contrôle le pilote étape ; cela entraîne le petit moteur électrique pour contrôler le levier fixé afin qu’il consécutivement s’élève et les robinets de l’appareil 4 fois en 2 s. Voir la Figure 1.
   1. Après le tapement, Notez que les mouches commencent à escalader la paroi. S’assurer que l’enregistrement se poursuit.
4. Répéter la synchronisation comme indiqué au point 2.3 en intervalle de 60 s pour 3 à 5 essais consécutifs.
5. Répéter l’expérience pour 5, 15, 25 et 35 jours ans mouches. Effectuer au moins 3 expériences indépendantes pour chaque groupe, chaque expérience au moins 30 recueillies vole (3 flacons).

3. Analyse des données

1. Importer la vidéo enregistrée dans l’ordinateur.
2. Prendre un instantané de la vidéo à 6 s après le tapement, pour chaque essai.
3. Importer l’image de capture instantanée dans le logiciel RflyDetection (voir Figure 2), en utilisant le ' fichier ' menu.
4. Définir les lignes de base supérieures et inférieures du flacon avec précision en utilisant l’icône de la ligne de base sur la barre d’outils, puis en utilisant le curseur pour marquer les lignes supérieures et inférieures de base sur l’image.
5. Entrer le nombre de mouches par flacon (p. ex., 10 ici) dans le ' Flys en rect ' champ et flacon de longueur (par exemple, 14 cm ici) dans la ' hauteur du Tube ' champ dans la barre de réglages.
   1. Note que les positions individuelles de mouche sont détectées et étiquetées avec picots sur l’écran pour chaque flacon.
      Remarque : La Figure 2 indique les positions de tous les clics sur le bouton menu.
6. Note que le logiciel détermine la distance escalade pour chaque volée et affiche automatiquement les valeurs moyennes de 10 mouches dans chaque flacon d’une table sur le panneau de droite. (Voir Figure 2)
7. L’escalade avec un logiciel de statistique (p. ex., prisme) pour une analyse statistique plus poussée du processus.
8. Actuellement les données comme moyenne ± SEM.
9. Calculer la p-valeurs d’importance (indiquées par des astérisques, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001) avec ANOVA à Bonferroni test de comparaison multiple

Résultats

Cet article illustre l’utilisation d’un test d’anneau automatisé pour évaluer le comportement de mouche géotaxie négative. Contrairement à l’essai précédent de RING, notre essai comprend un appareil automatisé qui fournit une force électrique pour synchroniser l’action voler et analyse des centaines de mouches simultanément (Figure 1). Analyse des Dicer2 ; DDC > auxR¹⁶¹⁸² mouches ont montré une diminution de la f...

Discussion

Le dosage d’anneau automatisé décrit ici permet une analyse de haut-débit du comportement de la mouche géotaxie négative pour des centaines de mouches simultanément. Auparavant les stratégies existantes pour l’analyse d’escalade adultes impliquent des observations d’une mouche simple dans un flacon individuel et mouche position est détectée manuellement par oeil. Ce processus plutôt fastidieux peut provoquer parfois mauvaise interprétation ou une mauvaise interprétation des données, ainsi que des tra...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forma Environmental Chamber	Thermo	3949
Carbon dioxide cylinders	FuLian GAS Technology	GB/T6052
HDR-Camcorder	SONY	HDR-CX220E
Binocular stereomicroscope	Xin Zhen	SMZ-168BL
Electronic scales	MinQiao	SL1002N
Refrigerator	Haier	SC-350
Agar-agar powder	Sinopharm	10000561
Glucose	Sinopharm	10010518
Corn meal	Sinopharm	5464654
Brown sugar	LiuCaiYuan	45467936
Instant dry yeast	AB MAURI	20886
AuxR16182	VDRC	7187
UAS-Dicer2	Bloomington	24650
UAS-mCD8GFP	Bloomington	32185
DDC-Gal4			A gift from Fude Huang
AuxGFP			A gift from Henry Chang