一种自动快速迭代阴性 Geotaxis 分析方法在神经的果蝇模型中的成人攀爬行为

摘要

此 step-by 步骤协议使用自动缸系统来分析果蝇的负 geotaxis 行为, 它承载数以百计的苍蝇并使其动作与电动机同步。在同步时, 采用自行设计的 RflyDetection 软件对飞行负 geotaxis 行为进行检测、数字记录和分析。

摘要

神经退行性疾病往往与运动能力的逐渐丧失, 缩短寿命, 和年龄相关的神经。为了了解这些细胞事件的机制, 以及它们之间的因果关系,果蝇, 用其复杂的遗传工具和多样的行为特征, 作为疾病模型来评估神经退行性表型。在这里, 我们描述了一个高通量的方法来分析果蝇成人负 geotaxis 行为, 作为可能的运动缺陷的迹象, 与神经。一个自动化的机器是设计和开发, 以驱动飞行同步使用最初的电脉冲, 后来允许记录的负 geotaxis 行为的过程中秒到分钟。然后用自行设计的 RflyDetection 软件对数字记录的视频图像进行统计处理。不同于基于单飞的人工控制的负 geotaxis 检测, 这种精确、快速和高通量的协议允许同时获取超过数百个苍蝇的数据, 提供了一种有效的方法来推进我们与神经相关的运动缺陷的基本机制的理解。

引言

为分析果蝇的成人攀爬行为制定了各种协议和方法。比较费力的是, 传统的分析主要涉及将一只苍蝇放入单个小瓶中, 并使用手动的力量来为同步^1,2,3,4。这是单调乏味和费时, 不适合大规模高通量的研究, 并有潜在的变化, 手动力量, 用来打击苍蝇以及其他限制。为了改进这种检测, 我们开发了一种快速的迭代负 Geotaxis (环) 试验, 它允许高通量分析在同一时间的大量苍蝇⁵。然而, 该检测仍需要人工施加力来同步飞行动作。我们的版本的环化验, 修订后, 先前的化验, 包括一个金属基地承载多个装有苍蝇的小瓶自动控制由电机驱动飞行同步⁶。录音后, 同步后立即爬升, 然后使用自行设计的软件进行分析。我们的自动环试验已经消除了繁琐和 labor-intensive 的过程, 收集数据从一个单一的苍蝇, 一次一个, 并使数据采集过程更有效。此外, 在一些研究中使用了自动环法来阐明阿尔茨海默氏症和帕金森病的发病机制, 并以高效率的方法验证了^7,8,9.

在本文中, 我们演示了使用DDC-Gal4驱动的 rna 干扰飞行的自动环检测。DDC-Gal4是在多巴胺能 (DA) 和素神经元中特别表达的 Gal4 线, 因此它代表了分析与神经¹⁰相关的运动缺陷的靶基因效应的一个很好的工具。此外, 我们还合并了UAS-Dicer2, 这是一条提高 rna 干扰效率的飞行线, 用于生成UAS-Dicer2;DDC-Gal4工具行。我们选择使用的 rna 干扰的苍蝇是auxilin (辅助) 的 rna 干扰 v16182 (auxR¹⁶¹⁸²), 一个我们先前确定的基因, 以展示对飞行运动活动的影响⁸。auxGFP苍蝇也准备用于分析在辅助上的效果. 我们将展示如何使用自动环法测量苍蝇负 geotaxis, 提出结果, 并讨论从结果获得的任何影响。

研究方案

1. 飞集

1. 在标准飞行食物上保持苍蝇在25和 #176; C、70% 湿度和 12 h/12 h 光/暗循环.
2. 收集 UAS-Dicer2;DDC-GAL4 飞行 virginsunder 二氧化碳 (CO ₂ ) 麻醉.
3. 将这些处女带到2天大的成年雄蝇携带以下基因型: UAS-mCD8GFP (控制), auxR ¹⁶¹⁸² ( 辅助 干扰) , auxGFP ( 辅助 干扰), 和 auxR ¹⁶¹⁸² ;auxGFP (抢救), 与男性: 女性比率为 1:2.
4. 分别为每个组和 #160;p er 实验收集新 eclosed 的雄性和雌性小瓶, 每只普通的苍蝇小瓶中放置10只苍蝇, 标准食物在和 #160; 25 和 #176; C.
5. 根据实验, 将收集的苍蝇保持35天, 并将其用于5、15、25和35天的自动环分析.

2。自动环形检测

1. 将每种基因型的10只收集的苍蝇 (中性) 转移到每个小瓶中, 然后用螺钉固定药瓶。分析控制苍蝇和苍蝇携带不同基因型一起为每组实验 (最多10瓶同时, 每瓶10只苍蝇).
2. 打开放置在设备前面的数码相机, 一旦苍蝇都装好就开始录音.
3. 在允许1分钟的苍蝇以小瓶结算后, 打开控制步骤驱动程序的步骤控制器; 这将驱动小型电动机控制连接的拉杆, 使其在2秒内连续上升并轻拍设备4次。请参见 图 1 。
   1. 敲击后, 请注意, 苍蝇开始爬上墙。确保录制继续进行.
4. 在3到5连续的试验中重复步骤2.3 中描述的60秒间隔中的同步.
5. 重复试验5、15、25和35天的老苍蝇。每组至少进行3项独立实验, 每次试验至少30只收集的苍蝇 (3 瓶).

3。数据分析

1. 将录制的视频导入计算机.
2. 在敲击后6秒拍摄视频的快照, 用于每个试用版.
3. 将快照映像导入 RflyDetection 软件 (请参见 图 2 ), 使用 #39; 文件和 #39; 菜单.
4. 通过使用工具栏上的基线图标, 然后使用光标标记图像上的上、下基线, 精确设置小瓶的上下基线.
5. 输入每瓶的苍蝇数 (, 如 , 10 在这里) #39; 飞在矩形和 #39; 在和 #39 中的字段和瓶长 (, 如 , 14 厘米); 管高度和 #39; 设置栏中的字段。
   1. 请注意, 每个小瓶都在屏幕上检测到各个飞行位置并标记有点.
      注意: 图 2 指示所有菜单按钮单击的位置.
6. 注意, 软件自动确定每只苍蝇的爬升距离, 并在右侧面板的表格中显示每瓶10只苍蝇的平均值。(请参见 图 2 )
7. 使用统计软件 ( 如 、棱镜) 处理爬数, 以进行进一步的统计分析.
8. 将数据显示为平均值和 #177; SEM.
9. 计算 p 值的重要性 (用星号、* p 和 #60; 0.05、 p 和 #60; 0.01、*** p 和 #60; 0.001) 使用 one-way 方差分析 Bonferroni 多项比较试验.

结果

本文说明了在评估苍蝇负 geotaxis 行为的使用自动环法。与以前的环分析不同的是, 我们的检测包括一个自动装置, 它提供了一种同步飞行动作的电动力量, 并同时对数以百计的苍蝇进行解析 (图 1)。分析了Dicer2;DDC 和 #62; auxR¹⁶¹⁸² 苍蝇在6秒的时间内显示出在攀爬距离上的年龄依赖性下降, 这表明在 DA 神经元中, 辅助表达对飞行活动是至关?...

讨论

在这里描述的自动环分析可以同时对数以百计的苍蝇的飞行负 geotaxis 行为进行高通量研究。以前的分析成人攀登的策略涉及单个小瓶中单飞的观察, 而苍蝇的位置则由眼睛手动检测。这个相当繁琐的过程有时可能会导致对数据的误读或误解, 以及 labor-intensive 的工作。我们的自动环分析从一个简单的点击开始, 该仪器自动同步和评估高达100苍蝇的攀登能力。电同步提供了更精确的控制时间和其他参?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forma Environmental Chamber	Thermo	3949
Carbon dioxide cylinders	FuLian GAS Technology	GB/T6052
HDR-Camcorder	SONY	HDR-CX220E
Binocular stereomicroscope	Xin Zhen	SMZ-168BL
Electronic scales	MinQiao	SL1002N
Refrigerator	Haier	SC-350
Agar-agar powder	Sinopharm	10000561
Glucose	Sinopharm	10010518
Corn meal	Sinopharm	5464654
Brown sugar	LiuCaiYuan	45467936
Instant dry yeast	AB MAURI	20886
AuxR16182	VDRC	7187
UAS-Dicer2	Bloomington	24650
UAS-mCD8GFP	Bloomington	32185
DDC-Gal4			A gift from Fude Huang
AuxGFP			A gift from Henry Chang