神経変性のショウジョウバエモデル アダルト登山行動を分析するための自動化された迅速な反復負走アッセイ

要約

このステップ バイ ステップのプロトコルは、ハエの数百をホストし、電気モーターで彼らの行動を同期自動マルチ シリンダー システムを用いたショウジョウバエ負の走動作を分析します。試金飛ぶ負走動作同期、デジタル記録および自己設計されていた RflyDetection ソフトウェアを使用して分析しました。

要約

神経変性疾患は、運動能力、減らされた寿命、年齢依存性神経変性の進歩的な損失に頻繁に関連付けられます。これらの細胞のメカニズムを理解するには、イベント、および高度な遺伝学的ツールと多様な行動特徴、相互、キイロショウジョウバエ、これらの因果関係、モデルとして使用疾患を評価するため神経変性の表現型。ここでの神経変性に関連する運動障害のための徴候としてショウジョウバエ大人の負の走動作を分析する高スループット方法をについて説明します。自動機設計、ドライブ飛ぶ同期の後で分に秒の経過とともに負の走動作の記録をできるように、初期の電気衝動を使用するために開発。デジタル録画したビデオからの画像の統計データ操作の自己設計されていた RflyDetection ソフトウェアで処理されます。1 つのフライに基づいて手動で制御される負走アッセイとは異なり、この高速、高精度、高スループット プロトコルにより、データ集録からハエの何百ものよりも、同時に事前に効率的なアプローチを提供すること、神経変性疾患に関連付けられている運動の赤字の基になるメカニズムを理解します。

概要

さまざまなプロトコルおよび方法は、ショウジョウバエ成人登山行動を分析するために開発されています。かなり骨の折れる、伝統的な分析はほとんど 1 つのフライを入れている個々 のバイアルが含まれます、同期^1,2,3,4のハエを叩く手動力を使用します。退屈な時間のかかる、高スループットの大規模研究には不向きで、ハエだけでなく、その他の制限をタップするために使用マニュアルの力の潜在的な変化です。アッセイを改善するために同じ時間⁵時多数のハエを高スループット分析が可能迅速な反復負走 (リング) アッセイを開発されました。ただし、アッセイはまだ飛ぶアクションを同期に手動で発揮力が必要です。改訂前の測定の時にリングの試金の私達のバージョンには、自動的に飛ぶ同期⁶を駆動する電気モーターによって制御される複数のフライを含むバイアルをホスティング金属ベースが含まれています。録音時に同期が、記録された後すぐにクライミング場を用いて自己設計されていたソフトウェア。私たちの自動化されたリングの試金、1 つずつ、1 つのフライからのデータ収集に手間と労力のかかるプロセスを排除しより効率的なデータ取得プロセス。さらに、自動リング アッセイは、機構の基になるアルツハイマーを明らかにする研究、パーキンソン病、高効率^{7,8,9 でのアプローチを検証の数で採用されています。}.

この記事では、RNAi ハエを駆動DDC Gal4を使用して自動化されたリングのアッセイを示しています。DDC Gal4はドーパミン作動性 (DA) とセロトニン神経細胞で具体的に表現する Gal4 ライン¹⁰神経変性を伴う運動障害に関連付けられているターゲット遺伝子の効果を分析するための素晴らしいツールをこうして表します。さらに、我々 はUA Dicer2UAS-Dicer2;を生成するための RNAi の効率を高めるフライラインを組み込むDDC Gal4ライン ツールします。私たちを使用する選択 RNAi ハエはオーキシリン(aux) RNAi v16182 (auxR¹⁶¹⁸²)、我々 は以前の効果を展示する識別した遺伝子飛ぶ運動⁸。auxGFPハエもaux過剰発現に及ぼす影響を分析するため用意しています。自動リング試金を使用してフライ負走を測定、結果を提示し、結果から取得で何か影響を議論する方法を紹介します。

プロトコル

1 飛ぶコレクション

1. 25 ° C、湿度 70%、12/12 h 明暗サイクルで標準的なはえの食糧にハエを維持します。
。
2. 収集 UAS-Dicer2;DDC GAL4 フライ virginsunder 二酸化炭素 (CO ₂) 麻酔
。
3. は 2 日間の古い大人の男性のハエの次の遺伝子型を運ぶにこれらの処女をクロス: UA mCD8GFP (コントロール) auxR ¹⁶¹⁸² (aux RNAi) 、auxGFP (aux 過剰発現)、および auxR ¹⁶¹⁸²;auxGFP (救助)、男性: 女性の比率 1:2
。
4. 個別収集新しく 25 で標準的な食品の各正規フライ バイアルに 10 ハエを配置する実験ごとに各グループの 3 バイアルにこの男女 ° C
5. 実験によって維持、収集まで 35 日間を飛ぶし、5、15、25、35 日で自動リング分析に使用します
。

2。リング測定を自動化

1. 転送 10 採集されたハエ (男女兼用) 遺伝子ごとに各バイアル、し、ネジでバイアル。コントロールや一緒に実験のセットごとに異なる遺伝子型を運ぶ蠅を分析 (最大で 10 バイアル同時に各バイアル 10 ハエ).
2. 装置の前に置かれたデジタル カメラの電源し、ハエを一度録音を開始、すべて読み込まれ、準備ができています
。
3. バイアルに定住するハエの 1 分を可能にした後オンにステップ ドライバー制御ステップ コント ローラー; これは、連続して上昇し、4 回に 2 装置をタップを接続されているレバーを制御する小さな電気モーター ドライブ s。 図 1 を参照してください。
   1. めねじでは、ハエが壁を登るを開始することに注意してください。録音を続けることを確認します
   。
4. 3 に 5 の連続した試験の 2.3 で 60 の間隔の手順の説明に従って、自動同期を繰り返す
。
5. は、5、15、25、35 日間の古いハエの実験を繰り返します。グループごとに、少なくとも 3 の独立した実験を行う、各実験に少なくとも 30 収集飛ぶ (3 バイアル).

3。データ分析

1. 録画したビデオをコンピューターにインポートします
。
2. 6 でビデオのスナップショットを取るトライアルごとにタップした後で s.
3. RflyDetection ソフトウェア スナップショット イメージをインポート ( 図 2 を参照) を使用して、' ファイル ' メニュー
。
4. ツールバーの [ベースライン アイコンを使用して画像の上限と下限のベースラインをマークするカーソルを使用して正確にバイアルの上限と下限のベースラインを設定します
。
5. 入力 (例えば、10 ここ) バイアルあたりハエの数、' rect を飛ぶ ' フィールドとバイアルの長さ (例えば、14 cm ここ) で、' チューブ高さ ' 設定バー内にあるフィールド。
   1. 個々 の飛行位置を検出し、各バイアルの画面上のドットの付いたメモします
      。 注: 図 2 は、すべてのメニューのボタンのクリックの位置を示します
   。
6. ソフトウェアは自動的に各フライの登山距離を決定します、右側のパネルの表に各バイアルに 10 ハエから平均値が表示されます。( 図 2 参照)
7. プロセス、さらに統計分析統計ソフトウェア (例えば プリズム) 登山番号です
。
8. 現在データとして意味 ± SEM.
9. P を計算-意義の値 (アスタリスクで示されている * p < 0.05、* * p < 0.01、* * * p < 0.001) 複数の比較テスト ボンフェローニの一方通行 ANOVA を使用して

結果

この記事では、フライの負の走動作を評価する自動リング アッセイの使用を示します。以前リング アッセイとは異なり、我々 の分析含む飛ぶアクションを同期に電気の力を提供し、数百のハエを分析自動化装置同時に (図 1)。Dicer2; の解析DDC > auxR¹⁶¹⁸² 、DA ニューロンのaux式、フライの自発運動に重要示唆しているハエ?...

ディスカッション

ここで説明した自動リング アッセイはハエの何百ものフライの負の走動作の高スループット解析を同時にできます。以前アダルト登山を分析するための既存の戦略を含む個々 のバイアルで 1 つのフライの観察と目で飛ぶ位置を検出して手動で。このむしろ退屈なプロセスは、誤読や労働集約的な仕事と同様、データの誤解もあります。私たちの自動化されたリングの試金は単純なクリック?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forma Environmental Chamber	Thermo	3949
Carbon dioxide cylinders	FuLian GAS Technology	GB/T6052
HDR-Camcorder	SONY	HDR-CX220E
Binocular stereomicroscope	Xin Zhen	SMZ-168BL
Electronic scales	MinQiao	SL1002N
Refrigerator	Haier	SC-350
Agar-agar powder	Sinopharm	10000561
Glucose	Sinopharm	10010518
Corn meal	Sinopharm	5464654
Brown sugar	LiuCaiYuan	45467936
Instant dry yeast	AB MAURI	20886
AuxR16182	VDRC	7187
UAS-Dicer2	Bloomington	24650
UAS-mCD8GFP	Bloomington	32185
DDC-Gal4			A gift from Fude Huang
AuxGFP			A gift from Henry Chang