Eine automatisierte rasche Iterative Negative Geotaxis Assay für die Analyse von Erwachsenen Klettern Verhalten in einem Drosophila -Modell der Neurodegeneration

Zusammenfassung

Dieses schrittweise Protokoll analysiert Drosophila negative Geotaxis Verhalten mit einem automatisierten Multi-Zylinder-System, das beherbergt hunderte von fliegen und synchronisiert ihre Aktion durch einen Elektromotor. Bei der Synchronisation ist fliegen negative Geotaxis Verhalten untersucht, digital erfasst und analysiert mit Hilfe der selbst entworfenen RflyDetection-Software.

Zusammenfassung

Neurodegenerative Erkrankungen gehen häufig einher mit einem fortschreitenden Verlust der Bewegungsfähigkeit, reduzierten Lebensdauer und altersabhängigen Neurodegeneration. Um zu verstehen, den Mechanismus dieser zelluläre Ereignisse und ihre kausale Beziehungen zueinander, Drosophila Melanogaster, mit seiner genetischen Spezialtools und vielfältige Verhaltensstörungen Funktionen, Krankheitsmodelle für die Beurteilung dienen als Neurodegenerative Phänotypen. Hier beschreiben wir eine Hochdurchsatz-Methode zur Drosophila Erwachsene negative Geotaxis Verhalten, als Hinweis auf mögliche motor Mängel verbunden mit neurodegenerativen Erkrankungen zu analysieren. Eine automatische Maschine konzipiert und entwickelt für Antrieb fliegen Synchronisierung verwenden einen ersten elektrischen Impuls, so dass später die Aufnahme der negative Geotaxis Verhalten über einen Verlauf von Sekunden bis Minuten. Bilder von Digital aufgenommenen Videos werden dann mit der selbst gestalteten RflyDetection-Software für statistische Datenmanipulation verarbeitet. Anders als die manuell gesteuerte negative Geotaxis Assay basierend auf Fliege, präzise, schnell und Hochdurchsatz-Protokolls ermöglicht Datenerfassung von mehr als Hunderte von fliegen, gleichzeitig eine effiziente Herangehensweise voraus unsere Verständnis in den zugrunde liegenden Mechanismus der motorischen Defizite verbunden mit neurodegenerativen Erkrankungen.

Einleitung

Eine Vielzahl von Protokollen und Methoden wurden für die Analyse von Drosophila Erwachsenen Klettern Verhalten entwickelt. Eher mühsam, die traditionelle Analyse meistens geht es darum eine Fliege in einem einzelnen Fläschchen und nutzt eine manuelle Kraft zu fliegen nach unten für Synchronisation^1,2,3,4Tippen Sie auf. Es ist mühsam und zeitraubend, ungeeignet für große Hochdurchsatz-Studien und Variationsmöglichkeiten der verwendet, um die fliegen sowie andere Einschränkungen Tippen Sie auf manuelle Kraft hat. Um den Test zu verbessern, wurde ein schnelle Iterative Negative Geotaxis (RING) Assay entwickelt die Hochdurchsatz-Analyse über zahlreiche fliegen in der gleichen Zeit⁵ermöglicht. Der Test erfordert jedoch noch eine manuell auszuüben Kraft zu fliegen Aktion synchronisiert. Unsere Version des RING-Assays, überarbeitet nach der vorherigen Test enthält eine Metallbasis mehrere fliegen-haltigen Fläschchen automatisch gesteuert durch einen Elektromotor fliegen Synchronisation⁶fahren hosten. Bei der Aufnahme, die Fliege, die Besteigung sofort nach einer Synchronisation dann aufgezeichnet wird mit eine selbst entworfene Software analysiert. Unsere automatisierten RING-Assay hat eliminiert die mühsamen und arbeitsaufwändiger Prozess bei der Erhebung von Daten aus einer Fliege, einzeln nacheinander, und aktiviert die Datenerfassung effizienter. Darüber hinaus ist der automatisierte RING-Test in einer Reihe von Studien klären Mechanismus zugrunde liegenden Alzheimer und Parkinson, Validierung des Ansatzes mit hohem Wirkungsgrad^{7,8,9 beschäftigt} .

In diesem Artikel zeigen wir die automatisierte RING-Assay mit DDC-Gal4 getrieben RNAi fliegen. DDC-Gal4 ist eine Gal4-Linie, die speziell mit dem Ausdruck (DA) dopaminergen und serotonergen Neuronen, stellvertretend für ein großartiges Werkzeug für die Analyse der Ziel-gen Auswirkungen im Zusammenhang mit motorischen Defizite begleitenden Neurodegeneration¹⁰. Darüber hinaus integrieren wir UAS-Dicer2, eine Fliegenschnur, die RNAi-Effizienz, um die FH-Dicer2 generieren erhöht; DDC-Gal4 Werkzeug Linie. Die RNAi fliegen wir wählen zu verwenden ist die Auxilin (Aux) RNAi v16182 (AuxR¹⁶¹⁸²), ein Gen, das wir zuvor identifiziert haben, um einen Effekt auf ausstellen fliegen lokomotorische Aktivität⁸. AuxGFP fliegen sind auch bereit, für die Analyse von Auswirkungen auf die Aux -Überexpression. Wir zeigen, wie Sie mithilfe den automatisierten RING-Test messen fliegen negative Geotaxis, präsentieren die Ergebnisse und Auswirkungen gewonnenen Ergebnisse zu diskutieren.

Protokoll

1. fliegen Sammlung

1. die fliegen auf standard fliegen Essen bei 25 ° C, 70 % Luftfeuchtigkeit und einer 12 h/12 h hell/dunkel-Zyklus zu erhalten.
2. Sammeln FH-Dicer2; DDC-GAL4 fliegen Virginsunder Kohlendioxid (CO ₂) Anästhesie.
3. Überqueren Sie diese Jungfrauen auf 2 Tage alten erwachsenen männlichen fliegen tragen die folgenden Genotypen: FH-mCD8GFP (Kontrolle), AuxR ¹⁶¹⁸² (Aux RNAi) AuxGFP (Aux Überexpression), und AuxR ¹⁶¹⁸²; AuxGFP (retten), mit einem Mann: weibliches Verhältnis von 1:2.
4. Separat sammeln neu geschlüpften Männchen und Weibchen in 3 Fläschchen für jede Gruppe pro Experiment, indem 10 fliegen in jedes normale fliegen Fläschchen mit standard-Food bei 25 ° c
5. Je nach dem Experiment, halten Sie die gesammelten fliegt bis zu 35 Tage und nutzen sie für automatisierte Analyse der RING am Tag 5, 15, 25 und 35.

2. Automatisierte RING Assay

1. Transfer 10 gesammelten fliegen (Unisex) pro Genotyp in jedes Fläschchen, dann das Fläschchen mit einer Schraube sichern. Kontrolle fliegen und fliegen mit verschiedenen Genotypen zusammen für jeden Satz von Experimenten zu analysieren (bis zu 10 Ampullen gleichzeitig 10 fliegen in jedes Fläschchen).
2. Schalten Sie die Digitalkamera vor dem Gerät platziert und Aufnahme einmal fliegen sind alle geladen und schussbereit.
3. Nach Abzug 1 min für fliegen in Fläschchen zu begleichen, schalten Sie die Schritt-Steuerung, die den Schritt Treiber steuert, das treibt den kleinen Elektromotor steuern den Hebel befestigt, so dass es nacheinander erhebt sich und das Gerät 4 Mal in 2 klopft s. Siehe Abbildung 1.
   1. Nach dem Abstich, beachten Sie, dass die fliegen an die Wand zu steigen beginnen. Sicherzustellen, dass die Aufnahme wird fortgesetzt,.
4. Wiederholen Sie die Synchronisierung wie unter Punkt 2.3 in 60 s-Intervall für 3 bis 5 aufeinander folgende Versuche beschrieben.
5. Wiederhole das Experiment für 5, 15, 25 und 35 Tage alten fliegen. Mindestens 3 unabhängige Experimente für jede Gruppe, jedes Experiment mit mindestens 30 gesammelten fliegt (3 Ampullen).

3. Analyse der Daten

1. aufgenommene Videos in den Computer zu importieren.
2. Einen Schnappschuss des Videos bei 6 s nach dem Abstich, für jeden Versuch.
3. Das Snapshotbild in die RflyDetection-Software importieren (siehe Abbildung 2), mit der ' Datei ' Menü.
4. Festgelegten der oberen und unteren Grundlinien des Fläschchens genau mithilfe der Baseline-Symbol auf der Symbolleiste und dann mit dem Cursor, markieren Sie die obere und untere Baselines auf das Bild.
5. Geben Sie die Anzahl der fliegen pro Vial (z. B. 10 hier) in der ' Flys in Rect ' Feld und Vial Länge (z. B. 14 cm hier) in der ' Röhre Höhe ' Feld in der Einstellungsleiste auf.
   1. Beachten Sie, dass die Fliege Einzelpositionen werden erkannt und mit Punkten auf dem Bildschirm für jedes Fläschchen gekennzeichnet.
      Hinweis: Abbildung 2 zeigt die Positionen der alle Klicks auf die Schaltfläche Menü.
6. Beachten Sie, dass die Software automatisch den Klettern Abstand für jede Fliege bestimmt und die gemittelten Werte von 10 fliegen in jedes Fläschchen in einer Tabelle an der rechten Seitenwand zeigt. (Siehe Abbildung 2)
7. Klettern Anzahl mit Statistiksoftware (z.B. Prisma) für weitere statistische Auswertungen verarbeiten.
8. Gegenwart, die die Daten als ± SEM meine.
9. Berechnung der p-Werte von Bedeutung (mit Sternchen gekennzeichnet * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001) mit One-Way ANOVA mit Bonferroni mehrere Vergleich Test

Ergebnisse

Dieser Artikel beschreibt die Verwendung von einen automatisierten RING-Test bei der Beurteilung der Fliege negative Geotaxis Verhalten. Im Gegensatz zu den vorherigen RING-Assay, unser Test beinhaltet eine automatisierte Vorrichtung, die eine elektrische Kraft zu fliegen Aktion synchronisiert und analysiert bis zu Hunderte von fliegen gleichzeitig (Abbildung 1). Analyse der Dicer2; DDC > AuxR¹⁶¹⁸² fliegen zeigten einen altersabhängi...

Diskussion

Der automatisierte RING-Test hier beschriebenen ermöglicht gleichzeitig eine Hochdurchsatz-Analyse der Fliege negative Geotaxis Verhalten für Hunderte von fliegen. Bereits bestehende Strategien zur Analyse von Erwachsenen Klettern beinhalten Beobachtungen eine Fliege in einem einzelnen Fläschchen und fliegen Position manuell vom Auge erfasst. Dieses ziemlich langwierige Prozess kann manchmal Fehlinterpretation oder Fehlinterpretation von Daten sowie arbeitsintensiven Arbeit verursachen. Unsere automatisierten RING-Tes...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forma Environmental Chamber	Thermo	3949
Carbon dioxide cylinders	FuLian GAS Technology	GB/T6052
HDR-Camcorder	SONY	HDR-CX220E
Binocular stereomicroscope	Xin Zhen	SMZ-168BL
Electronic scales	MinQiao	SL1002N
Refrigerator	Haier	SC-350
Agar-agar powder	Sinopharm	10000561
Glucose	Sinopharm	10010518
Corn meal	Sinopharm	5464654
Brown sugar	LiuCaiYuan	45467936
Instant dry yeast	AB MAURI	20886
AuxR16182	VDRC	7187
UAS-Dicer2	Bloomington	24650
UAS-mCD8GFP	Bloomington	32185
DDC-Gal4			A gift from Fude Huang
AuxGFP			A gift from Henry Chang