رصد أثر الإجهاد ناضح على الحويصلات الافرازية والرقابة

Summary

ناضح الإجهاد يؤثر على الرقابة، ومبلغ العصبي أثناء هذه العملية. ونحن تبين كيفية الجمع بين الطرق الكهروكيميائية جنبا إلى جنب مع مجهر إلكتروني يمكن استخدامها لدراسة تأثير الضغط الاسموزي خارج الخلية على نشاط الرقابة وحويصله كانتال حجم ومقدار العصبي صدر خلال الرقابة.

Abstract

تسجيل أمبيروميتري الخلايا تعرض لصدمة ناضح وتبين أن الخلايا الافرازية تستجيب لهذا الإجهاد البدني بالحد من نشاط الرقابة ومقدار العصبي صدر من حويصلات في أحداث الرقابة واحدة. ويقترح أن يرجع الانخفاض في العصبية طرد تغييرات في الخصائص الفيزيائية الغشاء عند تقليص الخلايا في استجابة للضغط ناضح ومع الافتراضات التي لا تتأثر الحويصلات الافرازية في السيتوبلازم الخلية بالضغط التناضحي خارج الخلية. تسجيل أمبيروميتري للرقابة ترصد ما أطلق سراحه من الخلايا في الوقت الحالي حويصلة الصمامات مع غشاء البلازما، ولكن عدم تقديم معلومات عن محتوى حويصلة قبل أن يتم تشغيل الانصهار حويصلة. ولذلك، يوفر التسجيل مع أساليب أخرى تحليلية متكاملة قادرة على وصف الحويصلات الافرازية قبل أن يتم تشغيل الرقابة على الخلايا عن طريق الجمع بين أمبيروميتري نظرة أوسع لدراسة الحويصلات الافرازية كيف تتأثر عملية الرقابة بصدمة ناضح. ونحن هنا تصف كيف يمكن استخدام تكملة أمبيروميتري تسجيل مع الخلوي داخل الخلايا الكهروكيميائية وانتقال الميكروسكوب الإلكتروني (TEM) تصوير لوصف التغييرات في محتوى الحويصلات الافرازية الحجم والعصبي في تشرومافين الخلايا بالنسبة لنشاط الرقابة قبل وبعد التعرض للضغط التناضحي. عن طريق ربط المعلومات الكمية المكتسبة من تجارب باستخدام جميع الأساليب التحليلية الثلاث، قدمت استنتاجات سابقا أن الحويصلات الافرازية تستجيب للضغط التناضحي خارج الخلية بالتقلص في الحجم وتقليل حجم حويصلة كانتال إلى الحفاظ على تركيز عصبي حويصلة مستمر. ومن ثم، وهذا يعطي بعض التوضيحات بشأن لماذا حويصلات، في استجابة للضغط التناضحي، تقليل العصبية المبلغ صدر خلال الإفراج عن الرقابة. تسجيلات أمبيروميتريك هنا تشير إلى هذا هو عملية عكسية وأن حويصلة بعد صدمة ناضح يتم تعبئتها بالعصبية عندما يتم إعادة وضع الخلايا في بيئة متساوي التوتر.

Introduction

الخلايا تشرومافين في الغدد الكظرية هي خلايا الغدد الصم العصبية أن الإفراج عن جزيئات الناقل العصبي في مجرى الدم. وهذا يحدث من خلال عملية الخلوية التي تنطوي على الالتحام والانصهار من حويصلات مملوءة بالعصبي، أسفرت عن الإفراج عن المحتوى من الحويصلات إلى الفضاء خارج الخلية في عملية تسمى الرقابة. العصبية (الأدرينالين ونورادرينالين) في الخلايا تشرومافين بنشاط تنقل عن طريق بروتينات الغشاء إلى حويصلات الأساسية كثيفة كبيرة (لدكفس) وتخزينها في تركيزات عالية (~0.5-1 م)^1،2. يتم إنجاز تراكم العصبية داخل لدكفس بتقارب جزيئات الكاتيكولامينات إلى مصفوفة البروتين الأساسية كثيفة إينترافيسيكولار تتألف من تشروموجرانين البروتينات (~ 169 ملغ/مل)^{3،4،5 ،6}، وحلا كوكتيل إينترافيسيكولار الذي يحتوي على المكونات الرئيسية لتخزين وتحميل الكاتيكولامينات إلى حويصلة مثل ATP (125-300 مم)⁷، Ca^{2 +} (50-100 ميكرومتر في الحل ومم ~ 40 ملزمة مصفوفة البروتين)⁸، Mg^{2 +} (5 ملم)⁹، اسكوربات (10-30 ملم)¹⁰، والرقم الهيدروجيني من ~5.5^11،12. لدكفس الحفاظ على شرط iso ناضح الخلية السيتوبلازم (310 موسم/كغ)¹³، على الرغم من أن تركيز ذائبة النظرية داخل الحويصلات مبلغ يصل إلى أكثر من 750 ملم. تكوين المكونات إينترافيسيكولار ليست فقط ضرورية لتحميل وتخزين الكاتيشولامين، ولكن أيضا لتجميع الذوائب لمصفوفة البروتين الأساسية كثيفة. وهذا يقلل كثيرا من الاسموليه الحويصلات انخفض انخفاضا كبيرا، ويمكن أن تؤثر على الكاتيكولامينات المبلغ تم إصداره من خلال الرقابة^5،6.

وأفادت الدراسات عن تأثير الضغط الاسموزي خارج الخلية في عملية الرقابة عن طريق تسجيل أمبيروميتريك أن ارتفاع الضغط الاسموزي خارج الخلية يحول دون نشاط الرقابة، ويقلل من العدد من أجهزة الإرسال العصبية ويفرز من واحد حويصلة المقصورات^4،،من^{1415،16،17،،}من¹⁸¹⁹. تكهنت التفسيرات لهذه الملاحظات على تعزيز إمكانية مزاحمة الجزيئات في أحداث الانصهار حويصلة المثبطة الخلية السيتوبلازم، وتغيير في غشاء الخصائص الفيزيائية التي تؤثر على عدد أجهزة الإرسال العصبية صدر خلال الرقابة. هذه الأفكار يفترض أن ارتفاع الضغط التناضحي خارج الخلية لا يؤثر على حجم حويصلة كانتال، الذي يحدد عدد جزيئات العصبي المخزنة في حجرة حويصلة في المرحلة السابقة للرقابة المشغلة^{14، 15 , 17 , 19 , 20 , 21}-في القياسات أمبيروميتريك للإفراج عن الرقابة في الخلايا المفردة، يوضع ميكروليكترودي قرص ألياف الكربون في اتصال وثيق مع سطح الخلية، إنشاء مجموعة تجريبية حتى محاكاة التكوين المشبك، حيث أمبيروميتريك بمثابة القطب^22،بوستسينابتيك كاشف (الشكل 1)²³. عن طريق تنشيط خلية للرقابة، واحد يمكن أن يستحث حويصلات مملوءة العصبي تلتحم مع غشاء بلازما الخلية والإفراج عن جزء أو محتوى حويصلة كاملة في الفضاء خارج الخلية. يمكن اكتشاف هذه الجزيئات العصبي صدر على سطح القطب اليكتروتشيميكالي العصبية في حالة اليكترواكتيفي (مثلاً، الكاتيشولامين) بتطبيق محتملة الأكسدة + 700 مقابل أم قطب مرجعي Ag/AgCl . ونتيجة لذلك، سلسلة من المسامير الحالية مناسبة الكشف عن أحداث الرقابة الفردية. من الحالي مقابل تتبع الوقت في تسجيل أمبيروميتريك بالمنطقة تحت كل سبايك أمبيروميتريك واحد يمثل المسؤول عن الكشف عن كل حدث الرقابة ويمكن تحويلها إلى الخلد العصبية في إصدارها، باستخدام المعادلة فاراداي. ومن ثم، تسجيلات أمبيروميتريك تقديم معلومات كمية عن العصبية المبلغ طردوا من أحداث الرقابة واحد وتقرير عن تواتر الأحداث الرقابة، لكن لا تقدم معلومات كمية عن الحويصلات الافرازية المحتوى قبل بدأ الإفراج عن الانصهار والعصبي حويصلة.

ولذلك، للحصول على فهم أفضل للحويصلات الافرازية كيف في الخلية السيتوبلازم يستجيب للضغط التناضحي خارج الخلية قبل أن يتم تشغيل الخلية على الخضوع للرقابة، يمكن استخدام أساليب تحليلية تكميلية أخرى لإثراء هذه المعلومات. على سبيل المثال، للتحقيق في حالة الإجهاد ناضح يغير حجم حويصلة، يمكن استخدام مجهر إلكتروني (TEM) التصوير تحليل لقياس حجم حويصلة من الخلايا بعد التثبيت الكيميائي. لفحص حالة الإجهاد ناضح يؤثر حجم حويصلة كانتال، يمكن تطبيق تقنية أمبيروميتريك المتقدمة مؤخرا تسمى الخلوي داخل الخلايا الكهروكيميائية، للتحديد الكمي لمحتوى العصبي حويصلة في الحويصلات الافرازية في هذه الدولة الأصلية عند الذين ما زالوا يقيمون في السيتوبلازم للخلايا الحية²⁶. في تقنية الخلوي داخل الخلايا الكهروكيميائية، يتم إدراج قطب أسطواني ألياف الكربون نانوتيب برفق في السيتوبلازم للخلايا الحية، وعن طريق تطبيق محتملة أم + 700 لهذا القطب (مقابل Ag/AgCl مرجع قطب كهربائي)، محتوى الكاتيكولامينات في حويصلات يمكن قياسها كمياً بالكشف عن طفرة الأكسدة الحالية من حويصلات وحيد الاصطدام، أدسوربينج، ويمزق بعد ذلك ستوتشاستيكالي على سطح القطب وثم الإفراج عن محتوياتها ضد القطب السطحية²⁶. ومن ثم في أمبيروميتريك الحالية مقابل تتبع الوقت، كل حدث rupturing حويصلة واحدة يمكن أن ينتج عابرة الحالية وعن طريق إدماج مجال كل المصطلحات الحالية، يمكن حساب حجم قوانتال حويصلة استخدام القانون Faraday´s.

ولذلك، من خلال ربط المعلومات الكمية المكتسبة من قياسات حجم حويصلة استخدام التصوير تيم جنبا إلى جنب مع تحليل حجم كانتال حويصلة، كما سجلتها الخلوي داخل الخلايا الكهروكيميائية، حويصلة العصبي تركيز يمكن أيضا يجب تحديد. وهذا يسمح توصيف حويصلة عندما تتعرض الخلايا لمختلف الظروف ناضح ويعطي فكرة أفضل عن كيفية حويصلات قد تستجيب للضغط التناضحي خارج الخلية في المرحلة قبل الرقابة. وقد أظهرت النتائج من الجمع بين هذه الأساليب أن حضور الضغط الاسموزي العالي خارج الخلية، حويصلات تقليص وضبط حجمها كانتال، ومقارنة المعلومات الكمية المتعلقة بالتغيرات النسبية من هذه القياسات تبين أن بينما تتقلص، حويصلات ضبط محتوياتها والحجم للحفاظ على تركيز عصبي مستمر²⁴. وهكذا، هذا الفهم القيمة في الاتصال بالملاحظات التي أبديت على إطلاق سراح العصبي في الخلايا التي تتعرض للضغط التناضحي. في هذه البروتوكولات، يصف لنا استخدام هذه ثلاث منهجيات متكاملة تسمح بتوصيف الحويصلات الافرازية كيف في الرد على البيئة الأصلية ل osmolality خارج الخلية وآثار هذا الرد على الرقابة عملية. وبالإضافة إلى ملاحظاتنا السابقة فيما يتعلق بالتأثير ارتفاع الضغط الاسموزي على الرقابة²⁴، نقدم المزيد من التجارب التي تصف خلية الإنعاش بعد صدمة ناضح وتأثير التحفيز الباريوم متعددة في تشرومافين الخلايا.

Protocol

1-خلية ثقافة من الخلايا تشرومافين البقري معزول بواسطة الهضم الأنزيمي من الغدد الكظرية

1. لعزل خلايا تشرومافين التي تم جمعها من الغدد الكظرية الأبقار، تعقيم الخلايا مع محلول إيثانول 70%. تقليم الدهون بعيداً والنسيج الضام استخدام مشرط. لإزالة الدم، شطف الأوردة الكظرية استخدام حل لوك (مم 154 كلوريد الصوديوم، بوكل 5.6 ملم، NaHCO3 3.6 مم، هيدروكسيثيل حمض بيبيرازينيثانيسولفونيك (هيبيس) 5.6 ملم على درجة الحموضة 7.4) التي تم ثيرموستاتيد إلى 37 درجة مئوية.
2. لهضم الأنسجة، وتضخيم كل الغدة عن طريق حقن حوالي 2.5 مل من الحارة العقيمة التي تمت تصفيتها 0.2% كولاجيناز ف الحل عن طريق الأوردة الكظرية استخدام المحاقن واحتضان الأنسجة لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. فحص الغدد التأكد من اكتمال عملية الهضم لب. يجب أن يشعر الأنسجة الناعمة وليست متوترة.
3. جمع لب هضمها بالقص إيقاف الغدد في الاتجاه الطولي. فرم لب الأنسجة باستخدام مشرط. تصفية تعليق الأنسجة عبر غربال الصلب وتمييع مع حل لوك لحوالي 50 مل وحدة تخزين الحد من نشاط كولاجيناز ص
4. بيليه الخلايا في 300 غرام x في أجهزة الطرد مركزي لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وجمع في أنابيب الاختبار 50 مل العقيمة. إعادة تعليق بيليه التي تم الحصول عليها في حل 20 مل لوك وتصفية الحل عبر شبكة نايلون معقمة 100-ميكرومتر في أنابيب.
5. مزيج من تعليق خلية تشرومافين مع بركل العقيمة (1:1) والطرد المركزي حل الخلية في ز س 18,600 لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. جمع الطبقة العليا من التدرج الكثافة وتصفية الحل عبر شبكة نايلون 100 ميكرومتر في أنابيب.
6. لاستبعاد بركل، تمييع تعليق خلية مع حل لوك وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل إعادة تعليق بيليه في الحل لوك. كثافة الخلية المقدرة بتعليق خلية معزولة حوالي 4 مليون خلايا/مل.
7. لتسجيل أمبيروميتريك للرقابة والقياسات الخلوي داخل الخلايا، خلايا الكولاجين الرابع chromaffin لوحة مغلفة بأطباق بلاستيكية ملم 60 في كثافة حوالي 17.5 × 10³ خلايا/سم² واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في شركة 5%₂ البيئة. القيام بتجارب الكهروكيميائية في 1-3 أيام زراعة الخلايا.
8. تيم التصوير تجارب، لوحة خلايا تشرومافين في 75 سم² خلية ثقافة قوارير في كثافة الخلايا 7 مليون في قارورة واحتضان عند 37 درجة مئوية في بيئة₂ CO 5% لمدة يوم واحد.

2-وحيد الخلية الرقابة أمبيروميتري تجارب²⁴

1. اختﻻق ميكروليكتروديس ألياف الكربون لهذه التجارب، تأخذ كأسه الشعرية مع قطر خارجي مناسبة لصاحب القطب في مرحلة الرأس التي سيتم استخدامها في هذه التجارب. استخدام الشعرية زجاج البورسليكات قطر خارجي من 1.2 مم وقطر داخلي ل 0.69 ملم.
   1. قم بتوصيل أحد طرفي الشعرية أنبوب الشفط مياه. ضع 5 ميكرومتر قطر ألياف الكربون على شيء ما، مثل قطعة من الورق الأبيض، تعزيز التصور.
   2. التعرف واحد من ألياف الكربون وابق الألياف في نهاية واحدة بأصبع لإبقاء ألياف الكربون في المكان في حين وضع نهاية مفتوحة شعري بالقرب من نهاية الحرة من ألياف الكربون. بلطف نضح ألياف الكربون في الزجاج الشعرية حيث أن ألياف الكربون التي تتمسك بها من خلال طرفي شعري. تبتعد قوة الطموح.
2. ضع شعري مع ألياف الكربون إلى ساحبة ميكروبيبيتي وسحب الزجاج الشعرية في نصائح ماصة زجاجية منفصلة اثنين. لفصل ألياف الكربون متصل بين نصائح الزجاج اثنين، استخدام مقص لقطع الألياف الكربونية والحصول على اثنين من ألياف الكربون ميكرويليكتروديس.
3. تحت مجهر، ضع ألياف الكربون على أعلى شريحة مجهر سمكا يسمح القطع اليدوي من ألياف الكربون في الحافة من حيث هو تمديد الألياف من الطلاء الشعرية من الزجاج باستخدام مشرط.
4. بعد قطع ألياف الكربون، ترك تلميح ألياف الكربون المغلفة بزجاج، إدراج عدد قليل مم من طرف القطب حلاً الإيبوكسي لمدة 10 دقيقة سحب ما يصل الإيبوكسي وختم أي مساحة مفتوحة ممكن بين ألياف الكربون والزجاج المحيطة بها. رفع الأقطاب ببطء خارج الحل الإيبوكسي للحيلولة دون تشكيل في غيض مسرى قطرات الغراء ضخمة.
5. وضع أقطاب كهربائية على حامل (مثلاً، عصا خشبية مسطحة) مع الجانب سنتين لزجة الشريط المقاوم للحرارة التي يمكن أن تعلق أقطاب. خبز أقطاب الإيبوكسي تعامل بين عشية وضحاها في فرن عند 100 درجة مئوية. مسرى نصائح كسر بسهولة إذا كانت تتلامس مع سطح، حتى تضمن أقطاب كهربائية مخزنة دائماً بأمان باستخدام حامل فيها أقطاب كهربائية ثابتة في مكان ونصائح لا خطر يجري التطرق.
6. للحصول على سطح قطب قرص مسطح، ضع مسرى في حائز ميكروجريندير وشطب كل قطب من ألياف الكربون في ملاكا 45 °. بعد الميلا، علامة شعري على ظهر المركب استخدام علامة دائمة لمعرفة كيفية تحديد موقع القرص سطح القطب بزاوية 45 درجة عند وضع قطب كهربائي القرب من الخلايا لقياس الرقابة في وقت لاحق.
   ملاحظة: هذه الخطوة مهمة كما هو الحال في هذه التجارب، ومسرى القرص البيضاوي يجب أن يوضع شقة أعلى الخلايا مع التوازي السطحية على سطح طبق بيتري. أيضا، يتم الشطف أقطاب في اليوم نفسه كتجارب لضمان سطح قطب طازجة ونظيفة.
7. قبل الاستخدام، ضع كل ميكرويليكترودي ألياف الكربون في حل اختبار (مثلاً، الدوبامين 0.1 ملم في المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4)) لرصد حالة مستقرة حاليا استخدام فولتاميتري دوري. لمسح دوري فولتاميتري، تطبيق الموجي مثلث محتملة من-0.2 الخامس إلى +0.8 الخامس مقابل يتم الحصول عليها قطب مرجع Ag/AgCl في أم 100/ثانية لضمان رد فعل جيد حركية البيانات التي يتم باﻻتفاق مع القيم المحسوبة نظرياً لقرص قطره 5 ميكرومتر ألياف الكربون ميكروليكترودي²⁵.
8. لتسجيل أمبيروميتري للرقابة، ضع طبق بيتري مع مثقف خلايا تشرومافين إلى مجهر مقلوب. من المهم أن درع المجهر إعداد مع قفص فاراداي للقضاء على الضوضاء الإلكترونية أثناء أمبيروميتري التسجيل، وسبب يجري قياس التيارات الصغيرة جداً. استخدام مجهر تدفئة المرحلة للحفاظ على درجة حرارة 37 درجة مئوية أثناء تجارب الخلية.
9. استخدم أداة المشبك منخفضة الضوضاء تصحيح لتطبيق محتملة مستمر من + 700 أم في مسرى العامل مقابل قطب كهربائي مرجع Ag/AgCl يوضع أيضا في طبق بتري بعيداً عن مسرى العامل. لتسجيل الرقابة من الخلايا تشرومافين، رقمنة الإشارة الساعة 10 كيلوهرتز وتنطبق تمرير منخفض داخلية تصفية بيسل في 2 كيلو هرتز إلى تصفية الإشارات المسجلة.
10. لإجراء أمبيروميتريك تسجيل في الخلايا المفردة، جبل ميكروليكترودي القرص ألياف الكربون طازجة مشطوف واختبارها في حامل القطب المرحلة الرأس التي يتم استخدامها مع بوتينتيوستات.
    1. بلطف ضع مسرى مع القرص مسطحة بيضاوية الشكل القطب السطحية أسفل نحو سطح الخلية قمي ثم ضع مسرى على اتصال بغشاء الخلية باستخدام ميكرومانيبولاتور.
    2. ضبط المسافة بين مسرى الخلية برصد تشوه الخلية الناجمة عن مسرى عند موضع رأس غشاء الخلية، وثم بعناية سحب مسرى إلى مسافة حيث تستعيد الخلية شكل قريب من شكله الأصلي في الخلية . هو المثل الأعلى لتسجيل الكمية والحركية لخلق طبقة رقيقة سائلة من مائة نانومتر للفصل بين سطح القطب، والخلية، وظروف مشابهة للكشف عن بوستسينابتيك للإفراج عن المواد الكيميائية في المشبك.
11. لتحفيز الخلايا للرقابة، موقف ميكروبيبيتي زجاج مع حجم تلميح من 2-3 ميكرومتر القطر، مليئة بحل 5 مم BaCl₂ على مسافة على الأقل 20 ميكرومتر بعيداً عن الخلية، لمنع أي حل تسرب من طرف الماصة للتأثير تجربة وتطبيق نبضة حقن s 5 5 مم BaCl₂ الحل على سطح الخلية لتنشيط الخلية للرقابة.
12. لدراسة آثار عكسية من الضغط الاسموزي في عملية الرقابة، تعد حلاً عازلة متساوي التوتر (150 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملم بوكل، 1.2 mM MgCl2، الجلوكوز 5 مم، 10 مم حبيس، درجة الحموضة 7.4) مع ضغط iso ناضح موسم/كغ 310 ومكثف المخزن مؤقت بواسطة ضبط تركيز كلوريد الصوديوم الحل العازلة متساوي التوتر مع أوسمولاليتي المقابلة لموسم 730/كغ.
13. وضع الخلايا في المخزن المؤقت متساوي التوتر وتنشيط الخلية للرقابة عن طريق تطبيق نبضة حقن باريوم أثناء تسجيل العابرين الحالية أمبيروميتريك أثناء نشاط الرقابة بدأت لحوالي 3 دقائق.
    1. لمقارنة الردود الرقابة في ظروف متساوي التوتر لظروف مكثف، احتضان الخلايا لمدة 10 دقيقة في حل العازلة مكثف وبعد تطبيق نبضة حقن باريوم تحفيز الرقابة وتنفيذ 3 دقيقة لتسجيل أمبيروميتريك.
    2. لاستجابة الخلايا عكسها، احتضان خلايا مرة أخرى لمدة 10 دقيقة في محلول متساوي التوتر المخزن المؤقت وحفز الخلايا عن طريق تطبيق 5s حقن الباريوم النبض وأداء 3 دقيقة لتسجيل الاستجابة الرقابة من الخلية.
14. كما إجراء تجارب التحكم تحديد أثر على نشاط الرقابة عن طريق التحفيز الباريوم متعددة، على تسجيل أمبيروميتريك للإفراج عن الرقابة من ثلاثة متتالية BaCl₂ التحفيز على نفس الخلية وضعها في المخزن المؤقت متساوي التوتر و باستخدام بروتوكول الوقت نفسه لتجارب الاحتضان الخلية على التوالي مع الاسموليه مختلفة.

3-داخل الخلايا الكهروكيميائية الخلوي^24،26

1. لاختلاق أقطاب لقياسات حجم كانتال حويصلة، استخدام نفس المواد والبدء في إعداد من 5 ميكرومتر في القطر القطب ألياف الكربون وفقا للوصف في الأقسام 2-1 و 2-2 من تصنيع ميكروليكترودي للرقابة أمبيروميتريك القياسات.
2. تحت مجهر، استخدام مشرط لقطع تمتد ألياف الكربون من طرف الزجاج حيث أن يترك ألياف الكربون بطول يتراوح من 30 إلى 100 ميكرون تخرج من طرف الزجاج.
3. لإعداد تلميح لهب محفور القطب ألياف الكربون، استخدم لهب غاز بوتان. لتحقيق محفوراً بالتساوي، نصيحة القطب على شكل أسطواني، اضغط مسرى ألياف الكربون على شكل أسطواني أثناء التناوب ومكان ألياف الكربون تمتد من الزجاج إلى حافة الأزرق للهب غاز البوتان حتى يطور غيض الكربون أحمر اللون. وهذا عادة ما يستغرق أقل من 2 ثانية. وفي حالة نجاح هذه النتائج في حجم تلميح قطب محفوراً 50-100 نانومتر في القطر (صورة وزارة شؤون المرأة لهذا تلميح يظهر في الشكل 5ب). بعد لهب النقش، ضع تحت مجهر لتقييم تلميح القطب الكهربائي.
4. إدراج ميكروليكترودي نانوتيب أسطواني في حل الإيبوكسي لمدة 3 دقيقة تليها من 15 s تستنزف من طرف القطب حلاً الأسيتون. وهذا ما يسمح الإيبوكسي لختم مساحة الفجوة المحتملة بين ألياف الكربون ويعزل الجدار الزجاجي الشعرية، بينما يمسح الأسيتون الإيبوكسي قبالة سطح القطب محفوراً من ألياف الكربون. لعلاج الإيبوكسي، خبز أقطاب كهربائية في فرن بين عشية وضحاها في 100 درجة مئوية.
5. قبل الاستخدام، اختبار الحالي حالة ثابتة لكل ميكروليكترودي من ألياف الكربون، كما هو موضح في المقطع 2.7 باستخدام فولتاميتري دوري. لإجراء تجارب عليها، فقط استخدام الأقطاب الكهربائية التي تعرض هضبة الحالية حول 1.5-2.5 غ²⁷.
6. للقياسات أمبيروميتري بين الخلايا، ووضع الخلايا في المجهر كما هو موضح في 2.8 واستخدام نفس إعدادات التجريبية من بوتينتيوستات كما هو موضح في 2-9.
7. للقيام بقياس أمبيروميتريك داخل الخلايا، ومنع الأضرار المادية الكبيرة للخلية، أدخل ميكرويليكترودي أسطواني نانوتيب في الخلية بإضافة ميكانيكية لطيف القوة، ما يكفي لدفع الكهربائي عن طريق خلية البلازما الغشاء وفي السيتوبلازم الخلية باستخدام ميكرومانيبولاتور.
8. بعد الإدراج، ومع غشاء الخلية مختومة حول قطب أسطواني، بدء التسجيل أمبيروميتريك في الموقع في الخلية الحية. في الأكسدة المحتملة التي يتم تطبيقها على مسرى، سوف الجسميات على سطح القطب حويصلات وتمزق ستوتشاستيكالي.  ومن ثم فليس هناك حاجة لأي نوع من التحفيز الشروع في هذه العملية.
9. لتحديد مدى تأثير ناضح على حجم حويصلة كانتال، جمع القياسات الخلوي داخل الخلية من مجموعة من الخلايا التي قد تم المحتضنة في متساوي التوتر ومكثف المخزن المؤقت باستخدام الشرط التجريبية كما هو موضح في المقطع 2.13.

4-بيانات تحليل تسجيلات أمبيروميتري

1. تحليل البيانات أمبيروميتري مسجل من الرقابة وتحليل حجم كانتال حويصلة داخل الخلايا، باستخدام برنامج حاسوبي يسمح تحليل العابرين الحالية الحالية مسجل مقابل تتبع الوقت حتى أن الحركية معلمات الذروة ويمكن تحديد التهمة مجموع متكامل للقمم الفردية الحالية. لتحليل البيانات، وقد استخدمنا البرامج المطورة في مختبر Sulzer تمت كتابته لبرنامج تحليل البيانات إيغور²⁸.
2. عند تحليل أمبيروميتريك المسامير، حدد حد عتبة لقمم ثلاث مرات جذر متوسط مربع (RMS) الانحراف المعياري للضوضاء لكل تسجيل.
3. جمع المسامير أمبيروميتريك من كل خلية التسجيل يدوياً لمنع التموج الكاذبة التي لا تتبع الشكل الضبابي، ومضاعفة المسامير التي يمكن نتيجة لإحداث الرقابة المدمجة، وإلا يقبل المسامير على شكل ضبابي مع الحد الأدنى لثلاث مرات أعلى من ضجيج RMS.
4. جمع البيانات عن مجموع رسوم أمبيروميتريك واحد ذروته واستخدام قانون فاراداي (N = كنف) لحساب مقدار ضرس العصبي الكاتيكولامينات الكشف عن كل الرقابة أو حدث تمزق حويصلة واحدة داخل الخلايا، حيث أن N هو جزيئات من العصبية في الذهاب من خلال فعل الأكسدة والاختزال في سطح القطب، ف = المسؤول عن مجموع الكشف عنها تحت كل سبايك، ن = عدد الإلكترونات المنقولة في تفاعل الأكسدة والاختزال (n = 2 الكاتيشولامين)، و Faraday´s المستمر و = 96485 ج/مول.
5. إجراء التحليل الإحصائي للبيانات المجمعة من أول حساب المسؤول عن متوسط الكشف عن كل حدث لكل خلية. ثم الفرق بين الخلايا، حساب المسؤول عن المتوسط بين الخلايا واستخدام الاختبار t للطالب بين الخلايا افتراض تباين غير متكافئة. استخدمت هذه الدراسة برنامج MATLAB للتحليل الإحصائي.

5-تيم تصوير لتحليل حجم حويصلة

1. أولاً القيام بتصوير تيم للخلايا في مختلف الظروف ناضح، احتضان الخلايا الموجودة في المخزن المؤقت متساوي التوتر أو مكثف لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية في بيئة 5%₂ CO قبل التثبيت الكيميائي للخلايا.
2. إجراء تثبيت الخلية باستخدام الأسلوب مثبت كارنوفسكي²⁹. باستخدام هذا الأسلوب، احتضان الخلايا مع محلول يحتوي على أزيد الصوديوم 0.01% و 1% فورمالدهايد 1.25 ٪ glutaraldehyde التي يمكن تخزينها العينة في 4 درجات مئوية.
3. بعد التثبيت، غسل الخلايا مع المخزن المؤقت كاكوديلاتي الصوديوم 0.15 متر.
4. لوصمة عار الخلية عينات بعد التثبيت، وفي التحضير لل التصوير، احتضان الخلايا مع حل أكسيد أوزميوم 1% ح 2 في 4 درجات مئوية، تليها الحضانة ح 1 في خلات اليورانيل 0.5% عند درجة حرارة الغرفة في الظلام.
5. وفي خطوة تثبيت نهائي، يذوي الخلايا أولاً بدهن الخلايا الموجودة في الإيثانول 100% وشطف ثم الخلايا مع الأسيتون.
6. تضمين عينات الخلايا في ابوكسيريسين وبعد ذلك إجراء الطرد المركزي في 4,000 س ز لمدة 30-40 دقيقة ويسمح نموذج الخلية بلمرة عند 40 درجة مئوية ل 15 ح متبوعاً بحضانة 48 ساعة في 60 درجة مئوية.
7. استعدادا للتصوير، مضمن قسم العينة الخلية في الراتنج 100 أجار إلى شرائح بسمك 60 نانومتر باستخدام أولتراميكروتومي.
8. تخضع الخلايا لحل إيثانول acetate/25% اليورانيل 4% لمدة 4 دقيقة تليها 20 ثانية من الشطف بالماء. تغسل الخلايا مع سترات الرصاص رينولدز ل 3 دقيقة، تليها 20 ثانية من الشطف بالماء.
9. إجراء انتقال تصوير المجهر الإلكتروني لعينات الخلايا. في تجاربنا، وقد استخدمنا مجهر إلكتروني إرسال التي قد تم تشغيلها في 120 كيلوفولت.
10. من كل صورة مسجل قسم الخلية التي توضح أولتراستروكتوري الخلية التي تعرض عدد من الحويصلات في السيتوبلازم الخلية، أولاً معايرة حجم بكسل الصورة التي تتصل بكسل شريط مسجل النطاق في كل صورة تيم. استخدام برامج التصوير لتحديد أحجام حويصلة في كل صورة للخلايا التي تتعرض لظروف متساوي التوتر أو مكثف. في تجاربنا، علينا استخدام برنامج إيماجيج لتحليل الصور. تجدر الإشارة إلى أن تعديل حجم هذه القياسات على أساس سمك أقسام الخلية لتحليل الصور من أولتراستروكتوري الخلوية من صور تيم للخلايا، يحتاج إلى النظر، وقد وصف سابقا Almers´s مختبر³⁰.

النتائج

ونحن هنا وصف البروتوكول لكيفية الجمع بين تصوير تيم جنبا إلى جنب مع اثنين من منهجيات الكهروكيميائية، أمبيروميتري ألياف الكربون والخلوي داخل الخلايا الكهروكيميائية، يمكن أن توفر المعلومات التي تكتسب رؤية أوسع نطاقا في إشارة إلى تأثير الضغط الاسموزي خارج الخلية في عملية الرقابة والحويصلا...

Discussion

نقدم هنا بروتوكولا ومزايا الجمع بين ثلاثة أساليب تحليلية تكميلية لتحليل الحويصلات الافرازية وعملية الرقابة للحصول على فهم أفضل لكيف يمكن أن يؤثر على قوة مادية مثل الضغط التناضحي الحويصلات الافرازية وفي عملية الرقابة في الخلايا الافرازية. وتشمل هذه الأساليب أمبيروميتري ميكروليكترودي أ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma Aldrich	S7653
KCl	Sigma Aldrich	P9333
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma Aldrich	M-2670
Glucose	Sigma Aldrich	G8270
Collagenase P	Roche, Sweden	11 213 857 001
100-µM Nylon mesh	Fisher Sientific	08-771-19
Percoll	Sigma Aldrich	P1677
Collagen IV coated 60 mm plastic dish	VWR	354416
Centrifuge	Avanti J-20XP
Borosilicate glass capillary	Sutter instrument Co., Novato, CA
Micropipette puller	Narishing Inc., Japan	PE-21
Epoxy solutions (A and B)	Epoxy technology, Billerica, MA
Beveller	Narishing Inc.	EG-400
Inverted Microscope	Olympus	IX81
Patch clamp Instrument	Molecular Devices, Sunnyvale, CA	Axopatch 200B
Micromanipulator	Burleigh Instrument Inc., USA	PCS-5000
Butane Flame	Multiflame AB, Hässelholm, Sweden
Transmission electron microscopy	Omega	Leo 912 AB