Surveiller l’effet du Stress osmotique sur les vésicules de sécrétion et exocytose

Résumé

Le stress osmotique affecte exocytose et la quantité de neurotransmetteur libéré au cours de ce processus. Nous démontrons comment combinant méthodes électrochimiques ainsi que de la microscopie électronique peut être utilisé pour étudier l’effet de la pression osmotique extracellulaire sur l’activité de l’exocytose, la vésicule quantique taille et la quantité de neurotransmetteur libéré au cours de l’exocytose.

Résumé

Ampérométrie enregistrement des cellules soumises à un choc osmotique Voir la répondant par les cellules sécrétrices à ce stress physique en réduisant l’activité de l’exocytose et la quantité de neurotransmetteur libéré des vésicules dans les événements de l’exocytose unique. Il a été suggéré que la réduction des neurotransmetteurs expulsés est en raison de modifications dans les propriétés biophysiques de la membrane lorsque les cellules se rétrécissement en réponse au stress osmotique et hypothèses que sécrétoires vésicules dans le cytoplasme de la cellule ne sont pas affectés par le stress osmotique extracellulaire. Ampérométrie enregistrement d’exocytose surveille ce qui est libéré des cellules du moment une vésicule fusionne avec la membrane plasmique, mais ne fournit pas d’informations sur le contenu de la vésicule avant la fusion des vésicules est déclenchée. Par conséquent, en combinant ampérométrie enregistrement avec d’autres méthodes analytiques complémentaires qui sont capables de caractériser les vésicules sécrétrices avant l’exocytose à cellules est déclenchée offre un aperçu plus large pour l’examen des vésicules sécrétrices comment et la processus d’exocytose sont affectés par choc osmotique. Nous décrivons ici comment compléter ampérométrie enregistrement intracellulaire cytometry électrochimique et imagerie de microscopie électronique (met) de transmission peut être utilisé pour caractériser les modifications dans le contenu de taille et de neurotransmetteur des vésicules sécrétrices à cellules chromaffines par rapport aux activités de l’exocytose avant et après exposition à un stress osmotique. En liant l’information quantitative tirée des expériences utilisant les trois méthodes d’analyses, conclusions apportées précédemment que les vésicules sécrétrices réagissent au stress osmotique extracellulaire en diminution en taille et en réduisant la taille quantiques de vésicules à maintenir une concentration de neurotransmetteur vésicule constant. Par conséquent, ce qui donne quelques précisions au sujet de pourquoi les vésicules, en réponse au stress osmotique, réduisent les neurotransmetteurs montant libérés au cours de la libération de l’exocytose. Les enregistrements ampérométrique ici indiquent que c’est un processus réversible et que la vésicule après un choc osmotique sont remplis avec les neurotransmetteurs lorsque les cellules placées sont revenues dans un milieu isotonique.

Introduction

Les cellules chromaffines dans les glandes surrénales sont des cellules neuroendocrines qui libèrent des molécules de neurotransmetteur dans la circulation sanguine. Cela se produit à travers un processus cellulaire qui comporte l’arrimage et la fusion de vésicules remplies de neurotransmetteurs, résultant en une libération contenue des vésicules à l’espace extracellulaire dans un processus appelé exocytose. Les neurotransmetteurs (adrénaline et noradrénaline) dans les cellules chromaffines sont activement transportés par les protéines de membrane dans les vésicules de grand noyau dense (LDCVs) et stockés à des concentrations élevées (~0.5-1 M)^1,2. Accumulation de neurotransmetteurs à l’intérieur des LDCVs s’effectue par l’affinité des molécules de catécholamines pour la matrice de protéine de noyau dense intravésiculaire composée de chromogranine protéines (~ 169 mg/mL)^{3,4,5 ,6}et une solution de cocktail intravésiculaire contenant des composants clés pour le chargement de catécholamines et de stockage dans la vésicule tels que l’ATP (125-300 mM)⁷, Ca^{2 +} (50-100 µM dans la solution et ~ 40 mM lié à la matrice de protéine)⁸Mg^{2 +} (5 mM)⁹, ascorbate (10-30 mM)¹⁰et un pH de ~5.5^11,12. Les LDCVs maintiennent une condition iso-osmotique avec la cellule cytoplasme (310 mOsm/kg)¹³, même si la concentration en soluté théorique à l’intérieur des vésicules somme jusqu'à plus de 750 mM. La composition des composants intravésiculaire n’est pas seulement essentielle pour le chargement et le stockage des catécholamines, mais aussi pour l’agrégation des solutés à la matrice de protéine de noyau dense. Ceci réduit considérablement l’osmolarité des vésicules est réduit de façon significative et peuvent affecter la catécholamine de quantité qui est libérée au cours de l’exocytose^5,6.

Études sur l’effet de la pression osmotique extracellulaire sur le processus d’exocytose par ampérométrique enregistrement ont rapporté cette forte pression osmotique extracellulaire inhibe l’activité de l’exocytose et réduit le nombre de neurotransmetteurs sécrétés par simple vésicule compartiments^{4,14,15,16,17,18,19}. Les explications de ces observations ont spéculé sur la possible amélioration d’entassement macromoléculaires dans les événements de fusion cellule cytoplasme inhibant vésicule et une altération des propriétés biophysiques de la membrane affectant le nombre de neurotransmetteurs libérés au cours de l’exocytose. Ces pensées suppose que le stress osmotique extracellulaire élevé n’affecte pas la taille quantiques de vésicules, qui définit le nombre de molécules de neurotransmetteurs stockés dans un compartiment de vésicules au stade préalable d’exocytose déclenchée^{14, 15 , 17 , 19 , 20 , 21}. dans ampérométrique mesures de libération d’exocytose dans des cellules individuelles, une microélectrode de disque Fibre de carbone est placée en contact étroit avec la surface de la cellule, créant ainsi un ensemble expérimental en imitant la configuration de la synapse, où l’ampérométrique électrode sert un détecteur postsynaptique (Figure 1)^22,23. En stimulant une cellule à l’exocytose, on peut induire des vésicules remplies de neurotransmetteurs fusionnent avec la membrane plasmique et de libérer la partie ou le contenu de la vésicule complète dans l’espace extracellulaire. Ces molécules de neurotransmetteur libérés à la surface de l’électrode peuvent être détectées par voie électrochimique si les neurotransmetteurs sont des polymères électroactifs (p. ex., catécholamines) en appliquant un potentiel redox de + 700 mV vs une électrode de référence Ag/AgCl . En conséquence, une série de pointes de courants marquent la détection des événements individuels de l’exocytose. De l’approche actuelle et trace temporelle dans un enregistrement ampérométrique, la zone située sous chaque Picot ampérométrique unique représente la charge détectée par l’événement de l’exocytose et peut être convertie à la taupe des neurotransmetteurs libérés, à l’aide de l’équation de Faraday. Par conséquent, les enregistrements ampérométrique fournissent des informations quantitatives sur les neurotransmetteurs montant expulsés d’événements unique exocytose et rapport sur la fréquence des phénomènes d’exocytose, mais ne présentent pas d’informations quantitatives sur les vésicules de sécrétion contenu avant la fusion des vésicules et la libération des neurotransmetteurs a été lancé.

Par conséquent, pour obtenir une meilleure compréhension de comment sécrétoires vésicules dans la cellule cytoplasme répondre au stress osmotique extracellulaire avant que la cellule est activée pour subir une exocytose, autres méthodes analytiques complémentaires peuvent servir à enrichir ces informations. Par exemple, afin de déterminer si le stress osmotique modifie le volume de la vésicule, microscopie électronique à transmission (TEM) analyse d’imagerie peut servir à mesurer la taille de la vésicule des cellules après fixation chimique. Pour examiner si un stress osmotique affecte la vésicule taille quantique, une technique ampérométrique développée récemment appelée intracellulaire électrochimique cytométrie en flux, peut être appliqué pour la quantification du contenu de neurotransmetteur vésicule en vésicules sécrétrices dans leur état natif alors résident encore dans le cytoplasme des cellules vivantes,²⁶. Dans la technique de cytométrie électrochimique intracellulaire, une électrode cylindrique en fibre de carbone de NANOPOINTES est délicatement insérée dans le cytoplasme de cellules vivantes et, en appliquant un potentiel de mV + 700 à cette électrode (électrode de référence vs un Ag/AgCl), la la teneur en catécholamines dans les vésicules peut être quantifiée par la détection d’un dopage actuel redox des vésicules simples collision, adsorbant et par la suite stochastique une rupture à la surface de l’électrode et libérant ainsi leur contenu contre la électrode de surface²⁶. Ainsi, dans l’ampérométrique actuel contre trace temporelle, chaque événement rompre seule vésicule peut entraîner un courant transitoire et, en intégrant le domaine de chaque épi actuel, la taille quantique de la vésicule peut être calculée à l’aide de Faraday´s Loi.

Par conséquent, en liant l’information quantitative tirée des mesures de taille de vésicule TEM imagerie ainsi qu’analyse de vésicules de taille quantiques, tel qu’enregistré par cytométrie de flux électrochimique intracellulaire, concentration de neurotransmetteur vésicule peut également être déterminée. Cela permet la caractérisation de la vésicule quand les cellules sont exposées à diverses conditions osmotiques et offre une meilleure vue sur comment les vésicules peuvent répondre au stress osmotique extracellulaire au stade avant l’exocytose. Les résultats de la combinaison de ces méthodes ont montré qu’en présence d’une pression osmotique élevée extracellulaire vésicules rétrécissement et ajuster leur taille quantique et en comparant les informations quantitatives sur les variations relatives de ces mesures montre que tout en réduisant, vésicules ajuster leur contenu et les dimensions pour maintenir une concentration de neurotransmetteur constante²⁴. Ainsi, cette compréhension est précieuse en mettant avec les observations faites sur la libération des neurotransmetteurs dans les cellules exposées à un stress osmotique. Dans ces protocoles, nous décrivons l’utilisation de ces trois méthodes complémentaires permettant la caractérisation des vésicules de sécrétion comment dans leur environnement natif de répondre à l’osmolalité extracellulaire et les effets de cette réponse sur l’exocytose processus. En plus de nos observations précédentes concernant l’effet de la pression osmotique élevée sur exocytose²⁴, nous présentons des expériences supplémentaires qui décrivent des cellules après un choc osmotique et l’effet de multiples stimulations de baryum dans chromaffines cellules.

Protocole

1. cellule Culture de cellules chromaffines bovines isolées par Digestion enzymatique des glandes surrénales

1. Pour isoler les cellules chromaffines prélevés dans les glandes surrénales bovines, stériliser les cellules avec la solution d’éthanol à 70 %. Garniture de graisse à l’extérieur et du tissu conjonctif à l’aide d’un scalpel. Pour enlever le sang, rincer les veines surrénaliennes en utilisant une solution de Locke (NaCl 154 mM, KCl 5,6 mM, NaHCO3 3,6 mM, hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acide (HEPES) 5,6 mM à pH 7,4) qui a été thermostatée à 37 ° C.
2. Pour digérer le tissu, gonfler chaque glande en injectant environ 2,5 mL de chaud filtré stérile 0,2 % P solution de collagènase dans la veine surrénalienne à l’aide d’une seringue et incuber le tissu pendant 20 min à 37 ° C. Examiner les glandes pour s’assurer que le processus de digestion du bulbe rachidien est terminé. Le tissu doit se sentir mou et non tendue.
3. Recueillir la médulla digérée par capture hors les glandes dans le sens longitudinal. Émincer le tissu médullaire à l’aide d’un scalpel. Filtrer la suspension des tissus sur un tamis en acier et diluer avec la solution de Locke sur environ un volume de 50 mL pour réduire l’activité de la collagénase P.
4. Les cellules à 300 g dans une centrifugeuse pendant 10 min à température ambiante de granule et recueillir dans des tubes à essai 50 mL stérile. Resuspendre le culot obtenu dans une solution de 20 mL Locke et filtrer la solution sur une maille en nylon de 100 µm stérile dans des tubes.
5. La suspension de cellules chromaffines se mêlent Percoll stérile (1:1) et centrifuger la solution cellulaire à 18 600 x g pendant 20 min à température ambiante. Récupérer la couche supérieure de la gradient de densité et filtrer la solution sur une maille en nylon de 100 µm en tubes.
6. Pour exclure le Percoll, diluer la suspension cellulaire avec solution de Locke et de centrifuger à 300 x g pendant 10 min à température ambiante avant de re-suspendre le culot dans une solution de Locke. La densité cellulaire estimée de la suspension cellulaire isolé est d’environ 4 millions cellules/mL.
7. Pour l’enregistrement ampérométrique de l’exocytose et mesures intracellulaires de cytométrie en flux, cellules chromaffines plaque de collagène IV enduit 60 plats en plastique avec une densité d’environ 17,5 × 10³ cellules/cm² et incuber les cellules à 37 ° C dans un 5 % CO₂ environnement. Réaliser les expériences électrochimiques en 1-3 jours de culture cellulaire.
8. Pour le TEM d’imagerie, des expériences et des cellules chromaffines de plaque dans les flacons de culture cellulaire² 75 cm à une densité de 7 millions de cellules par flacon et incuber à 37 ° C dans un environnement de₂ CO 5 % pour 1 jour.

2. seule cellule exocytose ampérométrie expériences²⁴

1. Pour fabriquer des microélectrodes de fibre de carbone pour ces expériences, prendre un verre capillaire avec un diamètre extérieur approprié pour le porte-électrode au stade tête qui est utilisé lors de ces expériences. Utilisez un capillaire en verre borosilicate avec un diamètre extérieur de 1,2 mm et un diamètre intérieur de 0,69 mm.
   1. Branchez une des extrémités capillaires dans un tube d’aspiration de l’eau. Placer les fibres de carbone de 5 µm de diamètre sur quelque chose, comme un morceau de papier blanc, afin d’améliorer la visualisation.
   2. Identifier une seule fibre de carbone et maintenez la fibre sur une extrémité avec un doigt pour maintenir la fibre de carbone en place tout en positionnant l’extrémité ouverte du capillaire à proximité de l’extrémité libre de la fibre de carbone. Aspirer doucement la fibre de carbone dans le capillaire de verre pour que la fibre de carbone colle dehors à travers les deux extrémités du capillaire. Éloignez la force d’aspiration.
2. Placez le tube capillaire avec la fibre de carbone dans un micropipettes et tirer le verre capillaire en deux pointes de pipette de verre distinctes. Pour déconnecter la fibre de carbone qui est branchée entre les pointes de deux lentilles en verre, utilisez une paire de ciseaux pour couper la fibre de carbone et gagner deux microélectrodes de fibre de carbone.
3. Sous un microscope, placer la fibre de carbone sur une lame de microscope plus épaisse qui permet la découpe manuelle de la fibre de carbone à la pointe d’où la fibre est s’étendant de l’enduit de capillaire de verre à l’aide d’un scalpel.
4. Après avoir coupé la fibre de carbone, laisser un pourboire de fibre de carbone revêtu de verre, insérez quelques mm de l’extrémité de l’électrode dans une solution de revêtement époxy pendant 10 min tirer vers le haut époxy et sceller toute possible espace ouvert entre la fibre de carbone et le verre environnant. Soulevez les électrodes lentement hors de la solution de revêtement époxy afin d’éviter les gouttes de colle encombrant de se former à l’extrémité de l’électrode.
5. Placez les électrodes sur un support (par exemple, un bâton en bois plat) avec deux côtés résistant à la chaleur adhésif auquel les électrodes peuvent être attachés. Faire cuire les électrodes époxy traitée du jour au lendemain dans une étuve à 100 ° C. L’électrode conseils facilement se cassent si elles entrent en contact avec une surface, afin d’assurer les électrodes toujours sont stockés en toute sécurité en utilisant un support où les électrodes sont fixées en place et conseils ne risquent pas d’être touché.
6. Pour obtenir une surface d’une électrode disque plat, placer l’électrode dans le support d’un micromoteur et biseau de chaque électrode de fibre de carbone à un ange de 45°. Après le biseautage, marquer le capillaire sur sa partie supérieure à l’aide d’un marqueur permanent par la suite savoir comment localiser la surface de l’électrode de disque à un angle de 45° en plaçant l’électrode près des cellules pour la mesure de l’exocytose.
   Remarque : Cette étape est importante dans ces expériences, l’électrode à disque ovale doit être placé à plat sur le dessus de cellules avec sa surface parallèle à la surface de la boîte de Pétri. En outre, électrodes taillante sont font le même jour que les expériences visant à assurer une surface de l’électrode fraîche et propre.
7. Avant utilisation, placer chaque microélectrode de fibre de carbone dans une solution d’essai (p. ex., dopamine 0,1 mM dans le tampon PBS (pH 7,4)) pour surveiller l’état d’équilibre actuel à l’aide de voltampérométrie cyclique. Pour un balayage de voltampérométrie cyclique, appliquer une forme d’onde potentiels de triangle de -0,2 V à + 0,8 V vs une électrode de référence Ag/AgCl à 100 mV/s pour les données de cinétique de bonne réaction sont obtenus qui sont en accord avec les valeurs calculées pour un disque de diamètre de 5 µm fibre de carbone avec des microélectrodes²⁵.
8. Pour l’enregistrement ampérométrie d’exocytose, placez la boîte de Pétri avec les cellules chromaffines cultivées sur un microscope inversé. Il est important de protéger le microscope doté d’une cage de Faraday pour éliminer les bruits électroniques pendant l’ampérométrie d’enregistrement, en raison des très faibles courants à mesurer. Utiliser un microscope étape de chauffage pour maintenir une température de 37 ° C au cours des expériences de la cellule.
9. Utiliser un instrument de serrage faible bruit patch à appliquer à un potentiel constant de + 700 mV à l’électrode de travail par rapport à une électrode de référence Ag/AgCl qui est également placée dans la boîte de Pétri de l’électrode de travail. Pour enregistrement exocytose des cellules chromaffines, numériser le signal à 10 kHz et appliquez un interne passe-bas filtre de Bessel à 2 kHz pour filtrer le signal enregistré.
10. Pour exécuter ampérométrique enregistrement à monocellules, monter la microélectrode de disque Fibre de carbone fraîchement biseauté et testés dans le porte-électrode de la scène de tête qui est utilisé avec le potentiostat.
    1. Doucement, placer l’électrode avec le disque plat ovale forme électrode surface vers le bas vers la surface apicale de la cellule et placer l’électrode en contact avec la membrane de la cellule à l’aide d’un micromanipulateur.
    2. Ajuster la distance entre l’électrode et la cellule de surveillance de la déformation de la cellule provoquée par l’électrode sur la mise en place sur le dessus de la membrane cellulaire et ensuite soigneusement rétracter l’électrode à une distance où la cellule regagne une forme proche de sa forme originale de la cellule . L’idéal pour l’enregistrement cinétique et quantitative consiste à créer un mince film de liquid de cent nanomètres pour séparer la surface de l’électrode et de la cellule, qui sont des conditions similaires pour détection postsynaptique des rejets chimiques dans une synapse.
11. Pour stimuler les cellules à l’exocytose, positionner une micropipette de verre avec une taille de pointe de 2 à 3 µm de diamètre, rempli d’une solution 5 mM BaCl₂ à une distance d’au moins 20 µm de la cellule, pour éviter toute solution qui fuit de l’embout de la pipette d’influencer le expérimenter et appliquer une impulsion d’injection s 5 5 mm BaCl₂ solution à la surface cellulaire pour stimuler la cellule à l’exocytose.
12. Afin d’étudier les effets réversibles de la pression osmotique dans le processus d’exocytose, préparer une solution de tampon isotonique (150 mM NaCl, KCl, MgCl2, glucose 5 mM, 1,2 mM 10 mM HEPES, 5 mM, pH 7,4) avec 310 mOsm/kg pression iso-osmotique et un tampon hypertonique effectués en ajustant la Concentration en NaCl de la solution tampon isotonique avec une osmolalité correspond à 730 mOsm/kg.
13. Placer les cellules dans le tampon isotonique et stimuler la cellule à l’exocytose en appliquant une impulsion de baryum injection tout en enregistrant les transitoires de courant ampérométrique durant l’activité de l’exocytose initiés pendant environ 3 min.
    1. Pour comparer les réponses de l’exocytose dans des conditions isotoniques aux conditions hypertoniques, incuber les cellules pendant 10 min dans une solution hypertonique tampon et ensuite appliquer une impulsion d’injection de baryum pour stimuler l’exocytose et effectuer 3 min d’enregistrement ampérométrique.
    2. Pour la réaction réversible des cellules, incuber les cellules à nouveau pendant 10 min dans une solution tampon isotonique et stimulent les cellules en appliquant un 5 s injection de baryum d’impulsion et d’effectuer 3 min d’enregistrer la réponse de l’exocytose de la cellule.
14. Alors que des expériences de contrôle pour déterminer l’effet sur l’activité de l’exocytose de multiples stimulations de baryum, effectuez un enregistrement ampérométrique de libération de l’exocytose de trois consécutives BaCl₂ stimulations sur la même cellule mis en tampon isotonique et utilisant le même protocole de temps pour les expériences d’incubation cellules consécutives avec osmolarité différente.

3. intracellulaire Cytometry électrochimique^24,26

1. Pour fabriquer des électrodes pour les mesures de taille quantiques de vésicule, utiliser les mêmes matériaux et commencer à préparer un 5 µm dans l’électrode de fibre de carbone de diamètre selon les descriptions indiquées dans les sections 2.1 et 2.2 de la fabrication de la microélectrode pour l’exocytose ampérométrique mesures.
2. Sous un microscope, utiliser un scalpel pour couper la fibre de carbone s’étendant de la pointe de verre afin qu’une fibre de carbone d’une longueur allant de 30 à 100 µm est laissée qui sort de l’extrémité du verre.
3. Pour préparer une pointe gravé de flamme de l’électrode de fibre de carbone, utilisez une flamme de butane. Pour réaliser un uniformément gravé, électrode en forme cylindrique, tenir l’électrode de forme cylindrique en fibre de carbone tout en tournant et placer la fibre de carbone s’étendant de la vitre dans le bord bleu de la flamme butane jusqu'à ce que la pointe du carbone développe un rouge Couleur. Cela prend souvent moins de 2 s. En cas de succès, il en résulte une taille de pointe d’électrode gravé de 50 à 100 nm de diamètre (une image SEM de cette pointe est indiquée à la Figure 5B). Après la flamme gravure à l’eau-forte, placer l’électrode sous microscope pour évaluer la pointe de l’électrode.
4. Insérer la microélectrode cylindrique NANOPOINTES en solution époxy pendant 3 min, suivie d’une 15 s immersion de la pointe de l’électrode dans une solution d’acétone. Cela permet d’époxy sceller l’espace écart potentiel entre la fibre de carbone et de l’isolant mur capillaire de verre, tandis que l’acétone efface l’époxy au large de la surface de l’électrode gravé en fibre de carbone. Pour remédier à l’époxy, faire cuire les électrodes dans une étuve pendant la nuit à 100 ° C.
5. Avant utilisation, testez le courant de l’état d’équilibre de chaque microélectrode de fibre de carbone, comme l’a expliqué à la section 2.7 à l’aide de voltampérométrie cyclique. Pour des expériences, utilisez uniquement des électrodes qui affichent un plateau actuel autour de 1,5 à 2,5 nA²⁷.
6. Pour les mesures de l’ampérométrie intercellulaires, placer les cellules au microscope, comme décrit dans 2.8 et utilisent les mêmes paramètres expérimentaux de la potentiostat comme décrit dans 2,9.
7. Pour effectuer la mesure ampérométrique intracellulaire et pour éviter des dommages physiques importants à la cellule, insérez la microélectrode cylindrique NANOPOINTES dans la cellule en ajoutant un doux de force mécanique, juste assez pour pousser l’électrode à travers le plasma cellulaire membrane et dans le cytoplasme de la cellule à l’aide d’un micromanipulateur.
8. Après la pose et avec la membrane cellulaire, scellé autour de l’électrode cylindrique, lancer l’enregistrement d’ampérométrique in situ dans les cellules vivantes. À l’oxydation potentielle qui est appliqué à l’électrode, vésicules vont être adsorbés à la surface de l’électrode et stochastique se rompre.  Par conséquent, il n’est pas nécessaire pour tout type de stimulus pour amorcer ce processus.
9. Pour déterminer l’effet osmotique sur la vésicule taille quantique, recueillir les mesures cytometry intracellulaire d’un groupe de cellules qui ont été incubées dans isotonique et hypertonique tampon en utilisant la condition expérimentale comme décrit dans la section 2.13.

4. analyse d’enregistrements ampérométrie

1. Pour analyser les données enregistrées ampérométrie d’exocytose et analyse quantique des vésicules intracellulaires, utilisez un logiciel qui permet d’analyser des transitoires de courants dans le courant enregistré contre trace temporelle alors que cinétique paramètres de crête et la charge totale intégrée pour les pics de courants individuels peut être déterminée. Pour l’analyse des données, nous avons utilisé un logiciel développé dans le laboratoire de Sulzer qui a été écrit pour le programme d’analyse de données Igor²⁸.
2. Lorsque analysant l’ampérométrique spikes, sélectionnez une limite de seuil pour les sommets de trois fois la racine moyenne carrée (RMS) écart-type du bruit pour chaque enregistrement.
3. Recueillir les pointes ampérométrique de chaque enregistrement de cellule manuellement pour éviter les pointes de fausses qui ne pas suivre la forme gaussienne, double pointes qui peuvent être le résultat d’événements exocytose fusionnée et n’acceptent que des pointes de forme gaussiennes avec un seuil de trois fois plus élevé que le bruit de RMS.
4. Recueillir les données pour total frais par ampérométrique unique de pointe et utiliser le droit de Faradays (N = QnF) pour calculer le montant molaire des neurotransmetteurs catécholamines détecté par exocytose ou événements de rupture intracellulaire vésicules unique, où N est les moles de neurotransmetteurs en passant par une réaction d’oxydo-réduction à la surface de l’électrode, Q = la charge totale détectée sous chaque Picot, n = nombre d’électrons transférés dans la réaction d’oxydo-réduction (n = 2 pour les catécholamines) et la Faraday´s constante F = 96485 C/mol.
5. Effectuer une analyse statistique des données recueillies par le premier calcul de la redevance moyenne détectée par événement pour chaque cellule. Ensuite pour la variance entre les cellules, calculer la charge moyenne entre les cellules et utilisez un test de student t-entre les cellules, en supposant que la variance inégale. Cette étude a utilisé le programme MATLAB pour l’analyse statistique.

5. TEM imagerie pour l’analyse granulométrique vésicule

1. Pour effectuer l’imagerie TEM des cellules dans les conditions osmotiques différentes, tout d’abord Incuber les cellules dans un tampon isotonique ou hypertonique pendant 10 min à 37 ° C dans un environnement de₂ CO 5 % avant la fixation chimique des cellules.
2. Effectuer la fixation cellulaire à l’aide de la méthode fixateur de Karnovsky²⁹. En utilisant cette méthode, incuber les cellules avec une solution contenant de l’azoture de sodium 0,01 %, 1 % de formaldéhyde et glutaraldéhyde à 1,25 % dans lequel l’échantillon peut être conservée à 4 ° C.
3. Après fixation, laver les cellules avec du tampon de cacodylate de sodium 0.15 M.
4. Pour colorer la cellule échantillons post fixation et en prévision de TEM imaging, incuber les cellules avec une solution de 1 % le tétroxyde d’osmium pendant 2 h à 4 ° C, suivie de 1 h d’incubation dans une solution d’acétate d’uranyle de 0,5 % dans l’obscurité à température ambiante.
5. Lors d’une étape de fixation définitive, déshydrater les cellules tout d’abord en rinçant les cellules dans l’éthanol à 100 % et puis rincer avec de l’acétone, les cellules.
6. Incorporer les échantillons cellulaires en résine époxy, puis effectuer la centrifugation à 4 000 x g pendant 30-40 min et laisser l’échantillon de cellules à polymériser à 40 ° C pendant 15 h, suivie d’une incubation de 48 h à 60 ° C.
7. En préparation pour l’imagerie, section l’échantillon cellulaire intégrée en résine 100 Agar en tranches avec une épaisseur de 60 nm à l’aide d’un ultramicrotome.
8. Soumettre les cellules à une solution d’éthanol acetate/25% uranyle 4 % pendant 4 min, suivie de 20 s de rinçage avec de l’eau. Laver les cellules avec citrate de plomb Reynolds pendant 3 min, suivie de 20 s de rinçage avec de l’eau.
9. Effectuer l’imagerie de microscopie électronique de transmission des échantillons cellulaires. Dans nos expériences, nous avons utilisé un microscope électronique à transmission qui a été opéré à 120 kV.
10. De chaque image enregistrée d’une partie de cellule illustrant l’ultrastructure de la cellule qui affiche une population des vésicules dans le cytoplasme de la cellule, tout d’abord calibrer le taille de pixel de l’image en rattachant les pixels de la barre d’échelle enregistrées dans chaque image TEM. Logiciel d’imagerie permet de déterminer la taille des vésicules à chaque image des cellules exposées à des conditions isotoniques ou hypertoniques. Dans nos expériences, nous avons utilisé le logiciel ImageJ pour l’analyse de l’image. Il est à noter que pour l’analyse de l’image de l’ultrastructure cellulaire des images TEM de cellules, réglage de la taille de ces mesures basées sur l’épaisseur des sections de la cellule doit être pris en compte et ont été décrits précédemment par Almers´s lab³⁰.

Résultats

Nous décrivons ici le protocole car comment combinant l’imagerie TEM ainsi que deux méthodes électrochimiques, ampérométrie en fibre de carbone et intracellulaire cytometry électrochimique, peut fournir des informations qui acquiert une vision plus large, faisant allusion à l’effet de pression osmotique extracellulaire sur les vésicules de sécrétion et le processus d’exocytose. En comparant les enregistrements ampérométrie représentatif de relâchement de l’exocytose à cellules chromaffines simples ...

Discussion

Nous présentons ici un protocole et les avantages de la combinaison de trois méthodes d’analyse complémentaires visant à analyser les vésicules sécrétrices et le processus d’exocytose à mieux comprendre comment une force physique comme la pression osmotique peut affecter des vésicules sécrétrices et le processus d’exocytose dans les cellules sécrétrices. Ces méthodes incluent la fibre de carbone avec des microélectrodes ampérométrie, qui est une méthode établie pour l’enregistrement de l’acti...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma Aldrich	S7653
KCl	Sigma Aldrich	P9333
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma Aldrich	M-2670
Glucose	Sigma Aldrich	G8270
Collagenase P	Roche, Sweden	11 213 857 001
100-µM Nylon mesh	Fisher Sientific	08-771-19
Percoll	Sigma Aldrich	P1677
Collagen IV coated 60 mm plastic dish	VWR	354416
Centrifuge	Avanti J-20XP
Borosilicate glass capillary	Sutter instrument Co., Novato, CA
Micropipette puller	Narishing Inc., Japan	PE-21
Epoxy solutions (A and B)	Epoxy technology, Billerica, MA
Beveller	Narishing Inc.	EG-400
Inverted Microscope	Olympus	IX81
Patch clamp Instrument	Molecular Devices, Sunnyvale, CA	Axopatch 200B
Micromanipulator	Burleigh Instrument Inc., USA	PCS-5000
Butane Flame	Multiflame AB, Hässelholm, Sweden
Transmission electron microscopy	Omega	Leo 912 AB