Überwachung der Wirkung des osmotischen Druckes auf sekretorischen Vesikel und Exozytose

Zusammenfassung

Osmotischen Stress wirkt sich Exozytose und die Menge der Neurotransmitter freigesetzt während dieses Prozesses. Wir zeigen, wie Kombination elektrochemische Methoden zusammen mit Transmissions-Elektronenmikroskopie kann verwendet werden, um die Wirkung von extrazellulärer osmotischer Druck auf Exozytose Aktivität, Vesikel Quanten Größe und die Menge der Neurotransmitter freigesetzt untersuchen während der Exozytose.

Zusammenfassung

Strommesstechnik Aufnahme der Zellen ausgesetzt osmotischen Schock zeigen, dass die sekretorische Zellen auf dieser physischen Stress zu reagieren, durch die Reduzierung der Exozytose-Aktivität und die Menge der Neurotransmitter aus Vesikeln im einzigen Exozytose Veranstaltungen veröffentlicht. Es wurde vermutet, dass der Rückgang der Neurotransmitter ausgestoßen aufgrund von Änderungen in Membran Biophysikalische Eigenschaften, ist wenn Zellen als Reaktion auf osmotischen Stress schrumpfen und mit Annahmen, die sekretorischen Vesikel in das Zytoplasma der Zelle sind nicht betroffen durch extrazelluläre osmotischen Stress. Strommesstechnik Aufnahme der Exozytose überwacht, was aus den Zellen im Moment losgelassen wird, den ein Vesikels verschmilzt mit der Plasmamembran, den aber enthält keine Angaben über den Inhalt des Vesikels bevor die Fusion der Vesikel ausgelöst wird. Daher, durch die Kombination strommesstechnik Aufnahme mit anderen ergänzenden analytischen Methoden, die sind in der Lage, die Charakterisierung der sekretorischen Vesikel, bevor Exozytose an Zellen ausgelöst wird bietet einen umfassenderen Überblick für die Prüfung wie sekretorischen Vesikel und die Exozytose Prozess werden durch osmotischen Schock betroffen. Wir beschreiben hier, wie ergänzend strommesstechnik Aufnahme mit intrazellulären elektrochemische Zytometrie und Übertragung Elektronenmikroskopie (TEM) Bildgebung kann verwendet werden, um Änderungen im sekretorischen Vesikel Größe und Neurotransmitter an charakterisieren chromaffin Zellen im Zusammenhang mit Exozytose Tätigkeit vor und nach der Exposition auf osmotischen Stress. Durch die Verknüpfung der quantitative Erkenntnisse aus Experimenten mit allen drei analytische Methoden, wurden Schlussfolgerungen zuvor gemacht, dass sekretorischen Vesikel auf extrazelluläre osmotischen Stress reagieren, indem in der Größe schrumpfen und die Vesikel Quanten Größe zu reduzieren behalten Sie eine konstante Vesikel Neurotransmitter Konzentration. Daher gibt das einige Klarstellungen hinsichtlich warum Vesikel, in Reaktion auf osmotischen Stress die Menge Neurotransmitter bei Freigabe Exozytose freigesetzt reduzieren. Die konduktometrische Aufnahmen hier zeigen, dass dies ist ein reversibler Prozess und das telson, nachdem osmotischen Schock mit Neurotransmittern aufgefüllt werden, wenn die gesetzten Zellen in einer isotonischen Umgebung rückgängig gemacht werden.

Einleitung

Chromaffin Zellen in Nebennieren sind neuroendokrine Zellen, die Neurotransmitter-Moleküle in die Blutbahn abgeben. Dies geschieht durch ein zellulärer Prozess, bei dem das Andocken, und die Verschmelzung von Neurotransmitter gefüllten Vesikel, was Inhalt Auflösung von Vesikeln in den extrazellulären Raum in einem Prozess namens Exozytose. Die Neurotransmitter (Adrenalin und Noradrenalin) in chromaffin Zellen werden aktiv von Membranproteinen in großen dichten Kern Vesikel (LDCVs) transportiert und bei hohen Konzentrationen (~0.5-1 M)^1,2gespeichert. Ansammlung von Neurotransmittern im Inneren der LDCVs geschieht durch die Affinität von Katecholamin-Moleküle zu den intravesicular Rumpfkern Protein-Matrix bestehend aus Chromogranin Proteine (~ 169 mg/mL)^{3,4,5 ,6}, und ein intravesicular cocktail Lösung mit Schlüsselkomponenten für Katecholamin-Verladung und Lagerung in die Blase wie ATP (125-300 mM)⁷, Ca^{2 +} (50-100 µM in der Lösung und ~ 40 mM verpflichtet, die Protein-Matrix)⁸Mg^{2 +} (5 mM)⁹, Ascorbat (10-30 mM)¹⁰und einem pH-Wert von ~5.5^11,12. Die LDCVs pflegen einen Iso-osmotischen Zustand der Zelle Zytoplasma (310 mOsm/kg)¹³, obwohl die theoretische gelöste Konzentration in den Vesikeln Summe bis zu mehr als 750 mM. Die Zusammensetzung der einzelnen intravesicular ist nicht nur wichtig für die Verladung und Lagerung Katecholamine, sondern auch für die Aggregation von gelösten Stoffen, dichten Kern-Protein-Matrix. Dies reduziert die Osmolarität der Vesikel wird deutlich reduziert und beeinflussen die Menge Katecholamin, die während der Exozytose^5,6freigegeben wird.

Studien über die Wirkung des extrazellulären osmotischen Drucks auf die Exozytose von amperometrischen Aufnahme haben berichtet, dass hoher extrazellulärer osmotischer Druck hemmt Exozytose Aktivität und reduziert die Anzahl der Neurotransmitter abgesondert von einzelnen Vesikel Fächer^{4,14,15,16,17,18,19}. Die Erklärungen dieser Beobachtungen haben auf die mögliche Verbesserung der makromolekularen Engstand in der Zelle Zytoplasma hemmende Vesikel Fusion Events und eine Veränderung in der Membran Biophysikalische Eigenschaften beeinflussen die Anzahl der spekuliert. Neurotransmitter bei Exozytose freigesetzt. Diese Gedanken angenommen hohen extrazellulären osmotischen Stress beeinflusst nicht die Vesikel Quanten Größe, bestimmt die Anzahl der Neurotransmitter-Moleküle gespeichert in einem Vesikel-Fach in vorherige Phase der getriggerten Exozytose^{14, 15 , 17 , 19 , 20 , 21}. in konduktometrische Messungen der Exozytose Freisetzung in Einzelzellen, eine Kohlefaser-Scheibe Mikroelektrode steht in engem Kontakt mit der Zelloberfläche, erstellen eine experimentelle Einrichtung imitiert die Synapse-Konfiguration, wo der amperometrischen Elektrode dient als ein postsynaptisches Detektor (Abbildung 1)^22,23. Durch die Stimulierung einer Zelle, Exozytose, kann ein Neurotransmitter gefüllten Vesikel verschmelzen mit der Plasmamembran der Zelle und lassen teilweise oder volle Blase Inhalt in den extrazellulären Raum auslösen. Diese Neurotransmitter-Moleküle an der Oberfläche der Elektrode veröffentlicht können elektrochemisch erkannt werden, wenn die Neurotransmitter elektroaktive (z.B. Katecholamine) sind durch die Anwendung ein Redoxpotential von 700 mV Vs Ag/AgCl-Referenzelektrode . Daher eine Reihe von Stromspitzen markieren die Erkennung der einzelnen Exozytose Ereignisse. Vom aktuellen versus Zeit Spur in einer amperometrischen Aufnahme die Anbaufläche jedes einzelnen amperometrischen Spike stellt die Ladung pro Exozytose Ereignis erkannt und der Maulwurf von Neurotransmittern freigegeben, unter Verwendung der Gleichung Faraday konvertiert werden kann. Daher die konduktometrische Aufnahmen liefern quantitative Informationen über die Menge Neurotransmitter aus einzelnen Exozytose Veranstaltungen vertrieben und Berichten über die Häufigkeit der Exozytose Ereignisse, sondern präsentieren keine quantitative Informationen über die sekretorischen Vesikel Inhalte vor der Fusion der Vesikel und Neurotransmitter-Freisetzung wurde eingeleitet.

Daher, um ein besseres Verständnis der wie sekretorischen Vesikel in der Zelle Zytoplasma reagieren auf extrazelluläre osmotischen Stress bevor die Zelle ausgelöst wird, um zu unterziehen, Exozytose, andere ergänzende analytische Methoden verwendet werden können, um diese Informationen zu bereichern. Zum Beispiel um zu untersuchen, ob osmotischen Stress Vesikel Volumen ändert, Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) bildgebende Analyse lässt sich die Vesikelgröße der Zellen nach chemischen Fixierung zu messen. Um zu untersuchen ob osmotischen Stress Quanten Vesikelgröße betrifft, eine neu entwickelte amperometrischen Technik namens intrazellulären elektrochemische Zytometrie aufgebracht werden, für die Quantifizierung der Vesikel Neurotransmitter Inhalt an sekretorischen Vesikel in ihrer nativen Zustand noch im Zytoplasma der lebenden Zellen²⁶wohnhaft. In der intrazellulären elektrochemische Zytometrie-Technik eine Nanotip zylindrischen Kohlefaser-Elektrode sanft das Zytoplasma von lebenden Zellen und durch die Anwendung einer + 700 mV Potenzial an dieser Elektrode eingefügt (Vs Ag/AgCl Referenz Elektrode), die Katecholamin-Inhalte in Vesikeln quantifiziert werden kann, durch den Nachweis einer Redox Stromspitze aus einzelnen Bläschen kollidieren, adsorbierenden, und anschließend stochastisch Brechung an der Elektrodenoberfläche und damit deren Inhalt gegen die Freigabe der Elektrode Oberfläche²⁶. Daher in der amperometrischen aktuelle versus Zeit Spur, jedes einzelne Vesikel zerreißendes Ereignis kann dazu führen, dass eine aktuelle transiente und, durch die Integration von Bereich des jeweils aktuellen Spike, kann Quanten Vesikelgröße mit Faraday´s Gesetz berechnet werden.

Daher kann durch die Verknüpfung der quantitativen Informationen gewonnenen Vesikel Größenmessungen mit TEM Bildgebung Vesikel Quanten Größe und analysiert, wie von intrazellulären elektrochemische Zytometrie aufgezeichnet, Vesikel Neurotransmitter Konzentration auch werden Sie bestimmt. Dies ermöglicht Vesikel Charakterisierung, wenn Zellen unterschiedliche osmotische Bedingungen ausgesetzt sind und bietet eine bessere Sicht wie Bläschen auf extrazelluläre osmotischen Stress in der Phase vor der Exozytose reagieren können. Die Ergebnisse aus der Kombination dieser Methods haben gezeigt, dass im Beisein von extrazellulären hohen osmotischen Druck, Bläschen schrumpfen und passen Sie ihre Quanten Größe und Vergleich der quantitative Informationen über die relativen Veränderungen dieser Messungen, dass zeigt beim schrumpfen anzupassen Vesikel ihre Inhalt und Größe weiterhin eine konstante Neurotransmitter Konzentration²⁴. Somit ist dieses Verständnis wertvolle im Anschluss an die Bemerkungen über Neurotransmitter-Freisetzung in Zellen osmotischen Stress ausgesetzt. In diesen Protokollen beschreiben wir die Verwendung dieser drei komplementäre Methoden, mit denen die Charakterisierung der wie sekretorischen Vesikel in ihrer natürlichen Umgebung reagieren extrazellulären Osmolalität und die Auswirkungen dieser Reaktion auf die Exozytose Prozesses. Zusätzlich zu unseren bisherigen Beobachtungen über die Wirkung der hohen osmotischen Druck auf Exozytose²⁴präsentieren wir weitere Experimente, die Zelle Erholung nach osmotischen Schock und die Wirkung von mehreren Barium Stimulationen in chromaffin beschreiben Zellen.

Protokoll

(1) Zellkultur Bovine Chromaffin Zellen durch enzymatische Verdauung von Nebennieren isoliert

1. Um chromaffin Zellen gesammelt aus bovine Nebennieren zu isolieren, Sterilisieren Sie Zellen mit 70 % Ethanol-Lösung. Trim entfernt Fett- und Bindegewebe mit einem Skalpell. Um Blut zu entfernen, spülen Sie die Nebennieren Venen mit Lockes Lösung (NaCl 154 mM, KCl 5,6 mM, NaHCO3 3,6 mM, Hydroxyethyl Piperazineethanesulfonic Säure (HEPES) 5,6 mM bei pH 7,4), die handlich auf 37 ° C.
2. Um das Gewebe zu verdauen, jede Drüse durch die Injektion von etwa 2,5 mL warmen steril filtriert 0,2 % Kollagenase P Lösung durch die Nebennieren Vene mit einer Spritze aufblasen und das Gewebe für 20 min bei 37 ° c inkubieren Untersuchen Sie die Drüsen um sicherzustellen, dass die Verdauung der Medulla abgeschlossen ist. Das Gewebe sollte weich und nicht angespannt fühlen.
3. Sammeln der verdauten Medulla schnippeln aus den Drüsen in Längsrichtung. Zerkleinere die Medulla Gewebe mit einem Skalpell. Die Gewebe-Suspension über ein Stahl Sieb filtern und verdünnen mit Lockes Lösung für ca. 50 mL Volumen reduzieren die Aktivität der Kollagenbildung P.
4. Pellet-Zellen bei 300 X g in einer Zentrifuge für 10 min bei Raumtemperatur und sammeln Sie in 50 mL sterile Reagenzgläser. Wieder auszusetzen Sie das erhaltene Pellet in 20 mL Lockes Lösung und Filtern Sie die Lösung über eine sterile 100 µm-Nylon-Netzgewebe in Tuben zu.
5. Mischen Sie die chromaffin Zellsuspension mit sterilen Percoll (1:1) und Zentrifugieren Sie die Zelle Lösung bei 18.600 x g für 20 min bei Raumtemperatur. Sammeln Sie die oberste Schicht der Dichtegradient und Filtern Sie die Lösung über einen 100 µm-Nylon-Netzgewebe in Tuben.
6. Um Percoll auszuschließen, verdünnen Sie die Zellsuspension mit Lockes Lösung und Zentrifuge bei 300 X g für 10 min bei Raumtemperatur vor Aussetzung wieder das Pellet in Lockes Lösung. Die geschätzte Zelldichte der isolierten Zellsuspension ist etwa 4 Millionen Zellen/mL.
7. Für die Aufnahme der amperometrischen Exozytose und intrazellulären Zytometrie Messungen, Platte chromaffin Zellen Kollagen IV beschichtet 60 mm Plastikschalen bei einer Dichte von etwa 17,5 × 10³ Zellen/cm² und inkubieren Sie Zellen bei 37 ° C in 5 % CO₂ Umgebung. Innerhalb von 1-3 Tagen Zellkultur durchführen Sie die elektrochemische Experimente.
8. Für die TEM imaging Experimente, Platte chromaffin Zellen in 75 cm² Zellkulturflaschen bei einer Dichte von 7 Millionen Zellen pro Flasche und Inkubation bei 37 ° C in einer 5 % CO₂ Umgebung für 1 Tag.

(2) einzelne Zelle Exozytose strommesstechnik Experimente²⁴

1. Um Kohlefaser Mikroelektroden für diese Experimente zu fabrizieren, nehmen Sie ein Glas Kapillare mit einem äußeren Durchmesser geeignet für den Elektrodenhalter Stadium der Kopf, der in diesen Experimenten verwendet wird. Verwenden Sie eine Borosilikat-Glas-Kapillare mit einem äußeren Durchmesser von 1,2 mm und einem Innendurchmesser von 0,69 mm.
   1. Schließen Sie eines der Kapillaren enden an ein Wasserrohr streben. Platz 5 µm Durchmesser Carbonfasern auf so etwas wie ein weißes Blatt Papier, um die Visualisierung zu verbessern.
   2. Identifizieren einer einzigen Carbon-Faser und die Faser an einem Ende mit einem Finger die Carbonfaser in Position zu halten, während das offene Ende der Kapillare in der Nähe das freie Ende der Carbon-Faser Positionierung gedrückt halten. Sanft Aspirieren der Carbon-Faser in der Kapillare Glas so, dass die Carbonfaser durch beide Enden der Kapillare herausragt. Die Aspiration Kraft wegziehen.
2. Legen Sie die Kapillare mit der Carbon-Faser in einer Mikropipette Puller und ziehen Sie das Glas in zwei separaten Glas Pipettenspitzen Kapillare. Um die Carbonfaser zu trennen, die zwischen den beiden Spitzen verbunden ist, verwenden Sie eine Schere schneiden die Carbonfaser und zwei Kohlefaser Mikroelektroden gewinnen.
3. Legen Sie unter dem Mikroskop die Carbonfaser auf einen dickeren Objektträger, der ermöglicht manuelles Schneiden von Carbon-Fasern am Rand wo die Faser aus der Kapillare Glasbeschichtung mit einem Skalpell auszudehnen ist.
4. Nach dem Schneiden der Carbon-Faser, ein Trinkgeld Glas beschichtete Kohlefaser, stecken Sie ein paar mm der Elektrodenspitze eine Epoxy-Lösung für 10 min Epoxy hochziehen und jede möglich Freifläche zwischen der Kohlefaser und dem umliegenden Glas zu versiegeln. Heben Sie die Elektroden langsam aus der Epoxy-Lösung zu verhindern, dass sperrige Leim Tropfen an der Spitze der Elektrode bildet.
5. Platzieren Sie die Elektroden auf einem Halter (z.B. eine flache Holzstab) mit zweiseitigen hitzebeständiges Klebeband an die Elektroden angeschlossen werden können. Backen Sie die Epoxy behandelt Elektroden über Nacht im Ofen bei 100 ° C. Die Elektrode Spitzen leicht brechen, wenn sie mit einer Oberfläche in Kontakt kommen so sichern die Elektroden werden immer sicher aufbewahrt, mit einem Halter, wo die Elektroden sind fixiert und Tipps riskieren nicht berührt wird.
6. Um eine flache Scheibe Elektrodenoberfläche zu erhalten, stellen Sie die Elektrode in die Halterung von einem Microgrinder und jeder Kohlefaser-Elektrode ein Winkel von 45° abgeschrägt. Markieren Sie nach abschrägen die Kapillare auf seiner Oberseite mit einem Permanentmarker später wissen, wie man der Elektrodenoberfläche Disk in einem 45 °-Winkel zu lokalisieren, wenn die Elektrode in der Nähe von Zellen für die Exozytose Messung zu platzieren.
   Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig, wie diese Experimente, die ovale Scheibe Elektrode muss flach auf Zellen mit seiner Oberfläche Parallel zur Oberfläche der Petrischale gelegt werden. Darüber hinaus erfolgen abschrägen Elektroden am selben Tag als Experimente um einen frischen und sauberen Elektrodenoberfläche zu gewährleisten.
7. Vor dem Gebrauch legen Sie jedes Kohlefaser Mikroelektrode in eine Testlösung (z.B. 0,1 mM Dopamin in PBS-Puffer (pH 7,4)) zur Überwachung der aktuellen mit zyklischer Voltammetrie Steady-State. Ein zyklischer Voltammetrie Scan beantragen eine mögliche Dreieck-Wellenform von -0,2 V bis 0,8 V Vs Ag/AgCl-Referenzelektrode auf 100 mV/s, um sicherzustellen, dass gute Reaktionskinetik Daten stammen, sind im Einvernehmen mit theoretisch berechneten Werte für eine 5 µm Durchmesser Scheibe Kohlefaser-Mikroelektrode²⁵.
8. Strommesstechnik Aufnahme der Exozytose, legen Sie die Petrischale mit kultivierten chromaffin Zellen auf einem inversen Mikroskop. Es ist wichtig, das Mikroskop eingerichtet mit einem Faraday-Käfig, elektronisches Rauschen bei der Aufnahme durch die sehr kleine Ströme zu messenden strommesstechnik zu beseitigen zu schützen. Verwenden Sie Mikroskop Heizung Bühne eine Temperatur von 37 ° C in der Zellexperimente weiterhin.
9. Ein geräuscharmer Patch Clamp Instrument zu verwenden, um eine konstante Potential von 700 anzuwenden mV an der Arbeitselektrode im Vergleich zu einer Ag/AgCl-Referenzelektrode, die auch in der Petrischale abseits der Arbeitselektrode platziert wird. Digitalisieren Sie für Aufnahme Exozytose von chromaffin Zellen das Signal bei 10 kHz zu und wenden Sie einen internen Tiefpass Bessel-Filter bei 2kHz, das aufgezeichnete Signal zu filtern.
10. Konduktometrische Aufnahme bei einzelnen Zellen ausführen, montieren Sie die frisch abgeschrägte und erprobten Kohlefaser Scheibe Mikroelektrode in den Elektrodenhalter der Kopf Bühne, die mit dem Potentiostaten verwendet wird.
    1. Sanft legen Sie die Elektrode mit der flachen ovalen Scheibe Form Elektrode Oberfläche nach unten in Richtung die apikale Oberfläche der Zelle und die Elektrode in Kontakt mit der Zellmembran mit einem Mikromanipulator.
    2. Stellen Sie den Abstand von der Elektrode in die Zelle durch die Überwachung der Zelle Verformung durch die Elektrode nach der Platzierung auf der Zellmembran und dann vorsichtig Einfahren der Elektrode zu einer Entfernung, wo die Zelle eine Form in der Nähe von seiner ursprünglichen Zellform gewinnt . Ideal für kinetische und quantitative Erfassung ist ein dünner Flüssigkeitsfilm von hundert Nanometern, die Elektrode und Zelle Oberfläche zu trennen erstellen, die ähnliche Bedingungen für postsynaptischen Detektion von chemischen Freigabe in einer Synapse.
11. Um die Zellen zu Exozytose anzuregen, positionieren Sie ein Glas Mikropipette mit eine Größe von 2-3 µm Durchmesser, gefüllt mit 5 mM BaCl₂ Lösung in einem Abstand von mindestens 20 µm von der Zelle, um zu verhindern, dass jede Lösung Austritt aus der Pipettenspitze Einfluss auf die experimentieren und anwenden einer 5 s Injektion Puls 5 mm BaCl₂ Lösung an der Zelloberfläche, die Zelle Exozytose zu stimulieren.
12. Um die reversiblen Auswirkungen des osmotischen Drucks auf die Exozytose Prozess untersuchen, bereiten eine isotonische Pufferlösung (150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM MgCl2, 5 mM Glucose, 10 mM HEPES, pH 7.4) mit 310 mOsm/kg Iso-osmotischen Druck und einer hypertonen Puffer gemacht durch die Anpassung der NaCl-Konzentration der isotonische Pufferlösung mit einer Osmolalität 730 mOsm/kg entspricht.
13. Legen Sie die Zellen in der isotonischen Puffer und stimulieren Sie die Zelle Exozytose durch die Anwendung eines Barium-Injektion-Puls während der Aufnahme der amperometrischen aktuelle Transienten während der eingeleiteten Exozytose Tätigkeit für ca. 3 min zu.
    1. Um die Exozytose Antworten in isotonischen Bedingungen auf Hypertone Bedingungen vergleichen, brüten Sie die Zellen für 10 min in hypertonen Pufferlösung und danach gelten Sie Barium Injektion Impuls zur Stimulierung Exozytose und 3 min amperometrischen Aufnahme durchführen.
    2. Für die reversible Reaktion der Zellen, Zellen wieder für 10 min. in isotonische Pufferlösung brüten und stimulieren die Zellen durch die Anwendung eines 5 s Barium Injektion Puls und 3 min zur Aufzeichnung der Antwort Exozytose aus der Zelle führen.
14. Wie Experimente, die Wirkung auf die Exozytose Aktivität durch mehrere Barium Stimulationen durchführen eine amperometrischen Aufnahme der Exozytose Release von drei aufeinander folgenden BaCl₂ Stimulationen auf der gleichen Zelle platziert in isotonischen Puffer und verwenden die gleiche Zeit-Protokoll für die aufeinander folgenden Zelle Inkubation Experimente mit verschiedenen Osmolarität.

(3) intrazellulären elektrochemische Zytometrie^24,26

1. Um die Elektroden für die Vesikel Quanten Größenmessungen fabrizieren, verwenden Sie die gleichen Materialien und bereiten Sie eine 5 µm im Durchmesser Kohlefaser-Elektrode entsprechend den Beschreibungen in den Abschnitten 2.1 und 2.2 der Mikroelektrode Fabrikation für amperometrischen Exozytose Messungen.
2. Verwenden Sie unter dem Mikroskop ein Skalpell zum Schneiden der Kohlefaser erweitern aus der Glas-Spitze, so dass eine Carbon-Faser mit einer Länge von 30 bis 100 µm heben sich aus der Glas-Tipp.
3. Verwenden Sie zur Vorbereitung eines Flamme geätzten Tipp der Kohlefaser-Elektrode eine Butan-Flamme. Um eine gleichmäßig geätzt zu erreichen, zylindrisch geformten Elektrodenspitze, halten die zylindrisch geformten Kohlefaser-Elektrode beim drehen es und legen Sie die Kohlefaser-Verlängerung aus dem Glas in den blauen Rand der Flamme Butan bis die Spitze des Kohlenstoffs ein rotes entwickelt Farbe. Dies dauert oft weniger als 2 s. Wenn dies gelingt, führt dies zu einer geätzten Elektrode Tipp Größe von 50-100 nm im Durchmesser (REM-Aufnahme von solchen Tipp zeigt Abbildung 5B). Legen Sie nach Flamme Ätzen die Elektrode unter dem Mikroskop, die Elektrodenspitze zu bewerten.
4. Einsetzen Sie die zylindrischen Nanotip Mikroelektrode in Epoxy-Lösung für 3 min, gefolgt von einer 15 s Eintauchen der Elektrodenspitze in einer Aceton-Lösung. Dies ermöglicht Epoxy versiegeln den potenzielle Lücke Raum zwischen der Carbon-Faser und die isolierende Kapillare Glaswand, während das Aceton das Epoxidharz aus der geätzten Kohlefaser Elektrodenoberfläche löscht. Um das Epoxidharz zu heilen, Backen Sie die Elektroden im Ofen über Nacht bei 100 ° C.
5. Vor Gebrauch testen die Steady-State Strom von jedem Kohlefaser Mikroelektrode, wie in Abschnitt 2.7 erläutert mit zyklischer Voltammetrie. Für Experimente, verwenden Sie Elektroden, die ein Plateau rund um aktuelle Anzeigen nur 1,5-2,5 nA²⁷.
6. Legen Sie für interzelluläre strommesstechnik Messungen die Zellen unter dem Mikroskop, wie in 2.8 beschrieben und verwenden Sie die gleichen experimentellen Einstellungen Potentiostaten wie in 2,9 beschrieben.
7. Intrazelluläre amperometrischen Messung durchführen, und setzen um erheblichen Sachbeschädigungen an der Zelle zu verhindern die Nanotip zylindrischen Mikroelektrode in die Zelle durch Zugabe von eine sanften mechanischen erzwingen, gerade genug, um die Elektrode durch das Zellplasma zu schieben Membran und in der Zelle Zytoplasma mit einem Mikromanipulator.
8. Nach dem Einlegen und mit der Zellmembran versiegelt um die zylindrische Elektrode starten Sie die amperometrischen Aufnahme an Ort und Stelle bei live Cell. Bei der Oxidation potenzielle gilt, für die Elektrode, Vesikel werden an der Elektrodenoberfläche adsorbieren und stochastisch Bruch.  Daher gibt es keine Notwendigkeit für jede Art von Anregung, diesen Prozess zu initiieren.
9. Um die osmotische Wirkung auf Quanten Vesikelgröße ermitteln, sammeln Sie die intrazelluläre Zytometrie Messungen aus einer Gruppe von Zellen, die in isotonischen und hypertonen Puffer über die Versuchsbedingung wie beschrieben im Abschnitt 2.13 inkubiert worden.

(4) Datenanalyse strommesstechnik Aufnahmen

1. Um die aufgezeichneten strommesstechnik Daten aus Exozytose und intrazellulären Vesikel Quanten Größe Analyse analysieren, nutzen Sie eine Software, die Analyse der aktuellen Transienten in der aufgenommene Strom versus Zeit Spur also das kinetische ermöglicht Peak-Parameter und die integrierte Gesamtladung für individuelle Stromspitzen kann bestimmt werden. Für die Datenanalyse haben wir in der Sulzer-Labor, das für die Daten-Analyse-Programm, Igor^{28 geschrieben wurde}entwickelte Software eingesetzt.
2. Bei der Analyse der amperometrischen Spitzen, wählen Sie einen Grenzwert für die Gipfel der drei Mal Root-Mean Square (RMS) Standardabweichung des Rauschens für jede Aufnahme.
3. Sammle die konduktometrische Spikes von jeder Zelle-Aufzeichnung manuell, um zu verhindern, dass falsche Stacheln, die nicht die Gaußsche Form folgen, Spitzen, die das Ergebnis der zusammengeführten Exozytose Ereignisse, und akzeptieren nur "glockenförmig" geformte Spitzen mit einem Schwellenwert von drei Mal zu verdoppeln höher als die RMS-Lärm.
4. Sammeln die Daten für die gesamte Ladung pro einzelne amperometrischen peak und Faradays Gesetz (N = QnF) zur Berechnung der molaren Menge an Katecholamin Neurotransmitter pro Exozytose oder intrazellulären einzelne Vesikel Bruch Veranstaltung, wo N die Maulwürfe von ist erkannt Neurotransmitter, die durch eine Redoxreaktion an der Elektrodenoberfläche, Q = die gesamte Ladung erkannt unter jede Spitze, n = Anzahl der Elektronen in der Redoxreaktion übertragen (n = 2 für Katecholamine), und die Faraday´s-konstante F = 96485 C/Mol.
5. Führen Sie statistische Auswertung der erhobenen Daten durch die erste Berechnung der durchschnittlichen Gebühren pro Ereignis für jede Zelle erkannt. Anschließend Varianz zwischen den Zellen, berechnen Sie die durchschnittliche Gebühr zwischen Zellen und verwenden Sie ein Student t-Test zwischen Zellen vorausgesetzt, ungleiche Varianz. Diese Studie verwendete das MATLAB-Programm zur statistischen Auswertung.

(5) TEM Bildgebung für die Vesikel Größe Analyse

1. Um TEM Bildgebung der Zellen an die unterschiedlichen osmotischen Bedingungen durchzuführen, zunächst inkubieren Sie Zellen in isotonische oder Hypertone Puffer für 10 min bei 37 ° C in einer 5 % CO₂ Umgebung vor chemischen Fixierung der Zellen.
2. Führen Sie Zelle Fixierung mit Karnovsky Fixativ Methode²⁹. Mit dieser Methode inkubieren Sie die Zellen mit einer Lösung mit 0,01 % Natriumazid, 1 % Formaldehyd und 1,25 % Glutaraldehyd, in denen die Probe bei 4 ° c gelagert werden können
3. Waschen Sie nach der Fixierung die Zellen mit 0,15 M Natrium Cacodylate Puffer.
4. Zu die Zelle färben Proben post Fixierung und in Vorbereitung auf TEM imaging, die Zellen mit einer 1 % Osmium ausgefällt Lösung für 2 h bei 4 ° C, gefolgt von 1 h Inkubation in 0,5 %-Uranyl-Acetat-Lösung bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
5. In einem abschließenden Fixierung Schritt Entwässern Sie die Zellen zunächst durch die Zellen in 100 % igem Ethanol spülen und dann spülen Sie Zellen mit Aceton ab.
6. Betten Sie die Zellproben in Epoxyharz ein und danach durchführen Sie Zentrifugation bei 4.000 x g für 30-40 min und erlauben Sie die Zellprobe polymerisieren bei 40 ° C für 15 h, gefolgt von 48 h Inkubation bei 60 ° C.
7. In Vorbereitung für die Bildgebung, Abschnitt die Zellprobe eingebettet in Agar 100 Harz in Scheiben mit einer Dicke von 60 nm mit einer regungsloses.
8. Vorbehaltlich der Zellen zu einer 4 % Uranyl acetate/25% Ethanol Lösung für 4 min, gefolgt von 20 s der Spülung mit Wasser. Waschen Sie die Zellen mit Reynolds Blei Citrat für 3 min, gefolgt von 20 s der Spülung mit Wasser.
9. Durchführen Sie Getriebe-Elektronenmikroskopie-Bildgebung von Zellproben. In unseren Experimenten habe wir eine Transmissions-Elektronenmikroskop in Betrieb war bei 120 kV.
10. Aus jedem aufgenommenen Bild einer Zelle Abschnitt illustriert die Zelle Ultrastruktur, die eine Bevölkerung der Vesikel in die Zelle Zytoplasma zeigt zuerst kalibrieren Pixel Bildgröße von im Zusammenhang mit der aufgezeichneten Maßstabsbalken in jedem TEM Bild Pixel. Verwenden Sie imaging-Software, um die Vesikel Größen bei jedem Bild der Zellen isotonische oder Hypertone Bedingungen ausgesetzt zu bestimmen. In unseren Experimenten verwendeten wir die Software ImageJ zur Bildanalyse. Es ist erwähnenswert, dass für Bildanalyse von zellulären Ultrastruktur von TEM-Aufnahmen von Zellen, Größenanpassung dieser Messungen anhand der Dicke der Zellteile muss berücksichtigt werden und wurden zuvor von Almers´s Lab³⁰beschrieben.

Ergebnisse

Wir beschreiben hier das Protokoll, für wie kombinieren TEM Bildgebung zusammen mit zwei elektrochemische Methoden, Kohlefaser-strommesstechnik und intrazellulären elektrochemische Zytometrie, Auskunft geben kann, die eine breitere Sicht in Anspielung auf die Wirkung der gewinnt extrazelluläre osmotischen Druck auf die sekretorischen Vesikel und Exozytose Prozess. Vergleicht man repräsentative amperometrischen Aufnahmen der Exozytose Release auf einzelne chromaffin Zellen mit der experimentellen eingerichtet (in

Diskussion

Wir stellen Ihnen hier ein Protokoll und die Vorteile der Kombination von drei ergänzende analytische Methoden zur Analyse von sekretorischen Vesikel und die Exozytose Prozess besser zu verstehen wie eine physische Kraft wie osmotischen Druck sekretorischen Vesikel auswirken können und der Exozytose Prozess in sekretorischen Zellen. Diese Methoden umfassen die Kohlefaser-Mikroelektrode strommesstechnik, das ist eine etablierte Methode zur Erfassung von Exozytose Aktivität, intrazelluläre elektrochemische Zytometrie, ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma Aldrich	S7653
KCl	Sigma Aldrich	P9333
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma Aldrich	M-2670
Glucose	Sigma Aldrich	G8270
Collagenase P	Roche, Sweden	11 213 857 001
100-µM Nylon mesh	Fisher Sientific	08-771-19
Percoll	Sigma Aldrich	P1677
Collagen IV coated 60 mm plastic dish	VWR	354416
Centrifuge	Avanti J-20XP
Borosilicate glass capillary	Sutter instrument Co., Novato, CA
Micropipette puller	Narishing Inc., Japan	PE-21
Epoxy solutions (A and B)	Epoxy technology, Billerica, MA
Beveller	Narishing Inc.	EG-400
Inverted Microscope	Olympus	IX81
Patch clamp Instrument	Molecular Devices, Sunnyvale, CA	Axopatch 200B
Micromanipulator	Burleigh Instrument Inc., USA	PCS-5000
Butane Flame	Multiflame AB, Hässelholm, Sweden
Transmission electron microscopy	Omega	Leo 912 AB