O efeito do estresse osmótico em vesículas secretoras e exocitose de monitoramento

Resumo

Estresse osmótico afeta a exocitose e a quantidade de neurotransmissor liberado durante este processo. Demonstramos como combinando métodos eletroquímicos juntamente com microscopia eletrônica de transmissão pode ser usado para estudar o efeito da pressão osmótica extracelular na atividade de exocitose, vesículas quantal tamanho e a quantidade de neurotransmissor liberado durante a exocitose.

Resumo

Amperometry gravação de células submetidas a choque osmotic mostrar que as células secretoras respondem a este estresse físico, reduzindo a atividade de exocitose e a quantidade de neurotransmissor liberado de vesículas em eventos de exocitose único. Sugeriu que a redução de neurotransmissores expulso é devido a alterações nas propriedades biofísicas de membrana quando células encolhem em resposta a estresse osmótico e com as suposições feitas que secretoras vesículas no citoplasma celular não são afetadas pela pressão osmótica extracelular. Amperometry gravação de exocitose monitora o que é liberado das células no momento uma vesícula funde-se com a membrana plasmática, mas não fornece informações sobre o conteúdo da vesícula antes da fusão de vesículas é disparada. Portanto, combinando amperometry gravação com outros métodos analíticos complementares capazes de caracterizar as vesículas secretoras antes de exocitose em células é disparada oferece uma visão mais ampla para analisar como secretoras vesículas e o processo de exocitose são afetados pelo choque osmótica. Aqui descrevemos como complementar amperometry gravando com citometria eletroquímica intracelular e imagem de microscopia eletrônica (TEM) de transmissão pode ser usado para caracterizar alterações no conteúdo de tamanho e neurotransmissor de vesículas secretoras no células cromafins em relação à atividade de exocitose antes e após a exposição ao estresse osmótico. Vinculando-se as informações quantitativas adquiridas com experimentos usando todos os três métodos analíticos, conclusões foram feitas anteriormente que vesículas secretoras responderem a pressão osmótica extracelular a encolher no tamanho e reduzindo o tamanho da vesícula quantal a manter uma concentração de neurotransmissor de vesículas constante. Portanto, isto dá algum esclarecimento sobre por vesículas, em resposta a estresse osmótico, reduzem os neurotransmissores montante lançados durante lançamento de exocitose. As gravações de amperométrico aqui indicam que este é um processo reversível e essa vesícula após choque osmotic são recarregados com neurotransmissores quando colocadas células são revertidas em um ambiente de isotônico.

Introdução

Células cromafins em glândulas supra-renais são células neuroendócrinas que liberam moléculas de neurotransmissor na corrente sanguínea. Isto ocorre através de um processo celular que envolve o encaixe e a fusão de vesículas cheias de neurotransmissores, resultando em liberação de conteúdo de vesículas para o espaço extracelular em um processo chamado exocitose. Os neurotransmissores (adrenalina e noradrenalina) nas células cromafins são ativamente transportados por proteínas de membrana em vesículas grande núcleo denso (LDCVs) e armazenados em altas concentrações (~0.5-1 M)^1,2. Acúmulo de neurotransmissores dentro as LDCVs é conseguido a afinidade das moléculas de catecolaminas para a matriz de proteína intravesicular denso núcleo composta de cromogranina proteínas (~ 169 mg/mL),^{3,4,5 ,6}e uma solução de cocktail intravesicular contendo componentes-chave para armazenamento e carregamento de catecolaminas da vesícula como o ATP (125-300mm)⁷, Ca^{2 +} (50-100 µM na solução e ~ 40 mM ligado para o matriz de proteína)⁸, Mg^{2 +} (5 mM)⁹, ascorbato (10-30 mM)¹⁰e um pH de^11,de ~5.5¹². Os LDCVs mantenham uma condição de iso-osmótica com a célula citoplasma (310 mOsm/kg)¹³, mesmo que a concentração de soluto teórica dentro as vesículas soma até mais de 750 mM. A composição dos componentes intravesicular não só é essencial para o carregamento e armazenamento de catecolaminas, mas também para a agregação de solutos para a matriz de proteína de núcleo denso. Isto reduz significativamente a osmolaridade das vesículas é significativamente reduzida e pode afetar a catecolamina quantidade que é liberada durante a exocitose^5,6.

Estudos sobre o efeito da pressão osmótica extracelular sobre o processo de exocitose por gravação amperométrico relataram essa alta pressão osmótica extracelular inibe a atividade de exocitose e reduz o número de neurotransmissores secretados de único vesículas compartimentos^{4,14,15,16,17,18,19}. As explicações destas observações têm especulado sobre o possível reforço do apinhamento macromolecular em eventos de fusão de vesículas inibindo o célula citoplasma e uma alteração nas propriedades biofísicas de membrana que afetam o número de neurotransmissores liberados durante a exocitose. Estes pensamentos assumiram que alto estresse osmótico extracelular não afeta o tamanho de vesículas quantal, que define o número de moléculas de neurotransmissor armazenado em um compartimento de vesículas na fase prévia de exocitose desencadeada^{14, 15 , 17 , 19 , 20 , 21}. em amperométrico medições de exocitose liberação de células únicas, um microeléctrodo de disco de fibra de carbono é colocado em contato com a superfície da célula, criando um conjunto experimental até imitando a configuração de sinapse, onde o amperométrico eletrodo serve como um detector pós-sináptico (Figura 1)^22,23. Estimulando uma célula a exocitose, pode-se induzir vesículas cheias de neurotransmissores se fundem com a membrana plasmática de célula e liberar a parte ou o conteúdo completo da vesícula para o espaço extracelular. Estas moléculas de neurotransmissor liberadas na superfície do eléctrodo podem ser detectadas eletroquimicamente se os neurotransmissores são eletroativos (por exemplo, catecolaminas) aplicando um potencial redox de 700 mV vs um eletrodo de referência Ag/AgCl . Por conseguinte, uma série de picos de corrente marca a detecção de eventos individuais exocitose. A corrente contra rastreamento de tempo em uma gravação de amperométrico, a área sob cada espiga amperométrico único representa a carga detectada por evento de exocitose e pode ser convertida para a toupeira de neurotransmissores liberados, usando a equação de Faraday. Portanto, as gravações amperométrico fornecem informações quantitativas sobre os neurotransmissores quantidade expelidos de eventos único exocitose e relatam sobre a frequência de eventos de exocitose, mas não apresentam informações quantitativas sobre as vesículas secretoras iniciou-se o conteúdo antes da fusão de vesículas e liberação de neurotransmissores.

Portanto, para obter uma melhor compreensão de como secretoras vesículas na célula citoplasma responder ao estresse osmótico extracelular antes que a célula é acionada para se submeter a exocitose, outros métodos analíticos complementares podem ser usados para enriquecer esta informação. Por exemplo, para investigar se estresse osmótico altera o volume de vesículas, microscopia eletrônica de transmissão (TEM) análise de imagem pode ser usada para medir o tamanho de vesículas de células após a fixação química. Para examinar se estresse osmótico afeta tamanho quantal vesículas, uma técnica recentemente desenvolvidos amperométrico chamada citometria eletroquímica intracelular, pode ser aplicado para a quantificação do conteúdo de neurotransmissor de vesículas em vesículas secretoras no seu estado nativo quando ainda residindo no citoplasma das células vivas,²⁶. Na técnica de citometria de eletroquímica intracelular, um eletrodo cilíndrico de fibra de carbono de nanotip é delicadamente inserido no citoplasma das células vivas e, aplicando um potencial de mV 700 para o eletrodo (eletrodo de referência vs um Ag/AgCl), o conteúdo de catecolaminas nas vesículas pode ser quantificado pela detecção de um pico de corrente redox de vesículas único colidindo, fixando e posteriormente estocàstica ruptura na superfície do eletrodo e, assim, liberando seu conteúdo contra o eletrodo superfície²⁶. Portanto, no amperométrico atual contra rastreamento de tempo, cada evento rompendo vesícula única pode resultar em uma corrente transitória e, integrando a área de cada pico atual, o tamanho quantal vesículas pode ser calculado usando a lei de Faraday´s.

Portanto, vinculando-se as informações quantitativas adquiridas com medições de tamanho de vesículas utilizando TEM imagens juntamente com a análise de tamanho de quantal de vesículas, como registrado por citometria de eletroquímica intracelular, concentração do neurotransmissor de vesículas pode também ser determinada. Isto permite a caracterização de vesículas quando as células estão expostas a diferentes condições osmóticos e fornece uma visão melhor sobre como vesículas podem responder ao estresse osmótico extracelular na fase antes da exocitose. Os resultados da combinação desses métodos demonstraram que na presença de extracelular alta pressão osmótica, vesículas encolhem e ajustar seu tamanho quantal e mostra que, comparar as informações quantitativas sobre alterações relativas a partir dessas medições enquanto a encolher, vesículas ajuste seus conteúdos e tamanho para manter um neurotransmissor constante concentração²⁴. Assim, este entendimento é valioso em conexão com as observações feitas na liberação do neurotransmissor em células expostas ao estresse osmótico. Estes protocolos, descrevemos o uso dessas três metodologias complementares que permitem a caracterização das vesículas secretoras como em seu ambiente nativo responder a osmolalidade extracelular e os efeitos da resposta sobre a exocitose processo. Além de nossas observações anteriores sobre o efeito da alta pressão osmótica na exocitose²⁴, apresentamos experimentos adicionais que descrevem a recuperação celular após choque osmótica e o efeito de vários estímulos de bário em cromafim células.

Protocolo

1. celular cultura de bovinas células cromafins isoladas por digestão enzimática de glândulas supra-renais

1. Para isolar células cromafins coletadas de bovinos das glândulas supra-renais, esterilize células com solução de etanol 70%. Apare fora gordura e tecido conjuntivo usando um bisturi. Para remover o sangue, lave as veias adrenais usando solução de Locke (NaCl 154 mM, KCl 5.6 mM, NaHCO3 3.6 mM, hidroxietil piperazineethanesulfonic ácido (HEPES) 5,6 mM, pH 7,4) que tem sido termostatizada a 37 ° C.
2. Digerir o tecido, inflar cada glândula injetando aproximadamente 2,5 mL de filtrado estéril 0,2% colagenase P solução morna na veia adrenal, usando uma seringa e incubar o tecido por 20 min a 37 ° C. Examine as glândulas para garantir que o processo de digestão da medula é concluído. O tecido deve se sentir mole e não tensa.
3. Colete a medula digerida por cortar fora as glândulas no sentido longitudinal. Picar o tecido da medula usando um bisturi. Filtrar a suspensão de tecido sobre uma peneira de aço e diluir com solução de Locke está a aproximadamente um volume de 50 mL para reduzir a atividade da colagenase P.
4. As células em 300 g de x em uma centrífuga durante 10 minutos à temperatura de pelotas e coletar em tubos de ensaio estéreis de 50 mL. Ressuspender o pellet obtido na solução de 20 mL do Locke e filtrar a solução ao longo de uma malha de nylon 100-µm estéril para tubos.
5. Misturar a suspensão de células cromafins com Percoll estéril (1:1) e centrifugar a solução de célula a 18.600 x g por 20 min em temperatura ambiente. Recolher a camada superior do gradiente de densidade e filtrar a solução ao longo de uma malha de nylon de 100 µm para tubos.
6. Para excluir Percoll, dilua a suspensão de células com Locke solução e centrifugar 300 x g por 10 min à temperatura ambiente antes de re-suspender a pelota na solução do Locke. A densidade estimada de célula de suspensão de células isoladas é aproximadamente 4 milhões células/mL.
7. Para gravação amperométrico de exocitose e medições de citometria intracelular, células cromafins de placa no colagénio IV revestido 60 mm plásticos pratos em uma densidade de cerca de 17,5 × 10³ células/cm² e incubam a 37 ° C em um 5% CO₂ células meio ambiente. Realizar os experimentos de eletroquímicos dentro de 1-3 dias de cultura de células.
8. Para a temperatura de imagem experimentos, células cromafins do prato em frascos de cultura de células de 75 cm² em uma densidade de 7 milhões de células por balão e incubar a 37 ° C, num ambiente 5% CO₂ por 1 dia.

2. única célula exocitose Amperometry experimentos²⁴

1. Para fabricar fibra de carbono microeletrodos para estas experiências, tome um vidro capilar com um diâmetro externo apropriado para o eléctrodo na fase principal que será usado nesses experimentos. Use um capilar de vidro borosilicato com diâmetro exterior de 1,2 mm de diâmetro interno de 0,69 mm.
   1. Conecte uma das extremidades da capilares para um tubo de aspiração de água. Lugar 5 µm de diâmetro fibras de carbono em algo, como um pedaço de papel branco, para melhorar a visualização.
   2. Identificar uma única fibra de carbono e segure a fibra em uma extremidade com o dedo para manter a fibra de carbono no lugar enquanto a extremidade aberta do capilar de posicionamento em proximidade com a extremidade livre da fibra da carbono. Delicadamente, Aspire a fibra de carbono para o capilar de vidro para que a fibra de carbono se destaca através de ambas as extremidades do capilar. Afaste-se da força de aspiração.
2. Colocar um extrator de micropipeta capilar com a fibra de carbono e puxar o vidro capilar em duas pontas de pipetas de vidro separado. Para desconectar a fibra de carbono que é conectada entre as pontas de dois vidros, use um par de tesouras para cortar a fibra de carbono e ganhar dois microeletrodos de fibra de carbono.
3. Sob um microscópio, coloque a fibra de carbono em cima de uma lâmina de microscópio mais grossa que permite o corte manual da fibra carbono na borda de onde a fibra é alargar a partir do revestimento capilar de vidro, usando um bisturi.
4. Depois de cortar a fibra de carbono, deixando uma ponta de vidro revestido de fibra de carbono, inserir alguns mm da ponta do eletrodo em uma solução de epóxi para 10 min puxar para cima da cola epoxy e selar qualquer possível espaço aberto entre a fibra de carbono e o vidro ao redor. Levante os eléctrodos lentamente fora a solução de epóxi para evitar que gotas de cola volumosos formando na ponta do eletrodo.
5. Coloque os eléctrodos sobre um suporte (por exemplo, uma vara de madeira plana) com dois lados pegajosa fita resistente ao calor para que os eletrodos podem ser anexados. Asse os eléctrodos de epóxi tratada durante a noite em estufa a 100 ° C. O eletrodo dicas facilmente quebram se entram em contacto com uma superfície, para garantir os eléctrodos sempre são armazenados com segurança usando um suporte onde os eletrodos são fixados no lugar e dicas não o risco de ser tocado.
6. Para obter uma superfície de eletrodo de disco liso, coloque o eletrodo no suporte de um microgrinder e bisel cada eletrodo de fibra de carbono em um anjo de 45°. Depois de chanfradura, marca o capilar na sua superfície usando um marcador permanente para depois saber como localizar a superfície do eletrodo de disco em um ângulo de 45°, quando da colocação do eletrodo perto de células para a medição de exocitose.
   Nota: Este passo é importante como estas experiências, o eletrodo de disco oval deve ser colocada horizontalmente em cima de células com sua superfície e paralelo à superfície da caixa de Petri. Também, chanfrando eletrodos são feitos no mesmo dia como experimentos para assegurar uma superfície de eletrodo fresco e limpo.
7. Antes de usar, coloca cada microeletrodos de fibra de carbono em uma solução de teste (por exemplo, dopamina de 0,1 mM em tampão PBS (pH 7,4)) para monitorar o estado estacionário atual utilizando voltametria cíclica. Para uma verificação de voltametria cíclica, aplicar uma forma de onda potencial do triângulo de-0.2 V para mais 0,8 V vs um eletrodo de referência Ag/AgCl a 100 mV/s para garantir boa reação cinética dados obtidos que estão de acordo com valores teoricamente calculados para um disco de 5 µm de diâmetro fibra de carbono microeletrodos²⁵.
8. Para a gravação de amperometry de exocitose, coloque a placa de Petri com culturas de células cromafins em um microscópio invertido. É importante proteger o microscópio configurar com uma gaiola de Faraday, para eliminar o ruído eletrônico durante a gravação, devido as correntes muito pequenas sendo medidas amperometry. Use um microscópio de fase de aquecimento para manter uma temperatura de 37 ° C durante os experimentos de célula.
9. Usar um instrumento de braçadeira do remendo de baixo ruído para aplicar um potencial constante de 700 mV para o eletrodo de trabalho contra um eletrodo de referência Ag/AgCl que também é colocado a placa de Petri longe o eletrodo de trabalho. Gravação de exocitose de células cromafins, digitalizar o sinal de 10 kHz e aplicar uma interna passa-baixa filtro de Bessel de 2 kHz para filtrar o sinal gravado.
10. Para executar amperométrico gravação em células individuais, monte o microeléctrodo de disco recentemente testado e chanfrada da fibra do carbono no porta eletrodo do palco principal que é usado com o potentiostat.
    1. Cuidadosamente coloque o eletrodo com o disco oval plana forma eletrodo superfície virado para baixo em direção à superfície apical da célula e o eletrodo em contato com a membrana da célula, usando um micromanipulador.
    2. Ajustar a distância entre o eletrodo para a célula, monitorando a deformação da célula causada pelo eletrodo após colocação em cima da membrana celular e em seguida, retraia cuidadosamente o eletrodo para uma distância onde a célula recupera uma forma perto de sua forma original de célula . O ideal para gravação de cinética e quantitativa é criar uma fina película de líquido de 100 nanômetros para separar a superfície do eletrodo e células, que são de condições semelhantes para a deteção pós-sináptica de liberação química de uma sinapse.
11. Para estimular as células a exocitose, posicionar uma micropipeta de vidro com um tamanho de bico de 2-3 µm de diâmetro, preenchido com solução de BaCl₂ de 5mm a uma distância de pelo menos 20 µm longe da célula, para evitar qualquer solução vazando de ponta da pipeta para influenciar o experimentar e aplicar um pulso de injeção 5 s de 5 mM BaCl₂ solução na superfície da célula para estimular a célula a exocitose.
12. Para estudar os efeitos reversíveis da pressão osmótica no processo de exocitose, preparar uma solução-tampão isotônica (150 mM de NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM MgCl2, glicose de 5 mM, 10 mM HEPES, pH 7,4) com 310 mOsm/kg de pressão iso-osmótica e um buffer hipertónica feita ajustando o NaCl de concentração da solução-tampão isotônica com uma osmolalidade correspondente a 730 mOsm/kg.
13. Coloque as pilhas no buffer isotônico e estimular a célula para exocitose aplicando um pulso de injeção de bário enquanto gravava as transientes de corrente amperométrico durante a atividade de exocitose iniciados por aproximadamente 3 min.
    1. Para comparar as respostas de exocitose em condições isotónicas às condições hipertónica, Incube as celulas por 10 min em solução tampão hipertônica e posteriormente aplicar um pulso de injeção de bário para estimular a exocitose e executar 3 min de gravação amperométrico.
    2. Para a resposta reversível das células, incubar as células novamente por 10 min em solução tampão isotônica e estimular células aplicando um 5s injeção de bário do pulso e executar 3 min de gravação a resposta de exocitose da célula.
14. Como experimentos de controle para determinar o efeito sobre a atividade de exocitose por vários estímulos de bário, realizar uma gravação amperométrico de exocitose lançamento de três consecutivos BaCl₂ estímulos na mesma célula colocados em tampão isotônico e usando o mesmo protocolo de tempo para os experimentos de incubação de células consecutivas com osmolaridade diferente.

3. intracelular Cytometry eletroquímica^24,26

1. Para fabricar eletrodos para medições de tamanho quantal vesículas, usar os mesmos materiais e começar a preparar um 5 µm em eletrodo de fibra de carbono de diâmetro de acordo com as descrições nas seções 2.1 e 2.2 da fabricação de microeletrodos para exocitose amperométrico medições.
2. Sob um microscópio, use um bisturi para cortar a fibra de carbono estendendo fora a ponta do vidro para que uma fibra de carbono com um comprimento que varia de 30 a 100 µm é deixada de fora da ponta de vidro.
3. Para preparar uma flama gravado ponta do eletrodo de fibra de carbono, use uma chama de butano. Para conseguir um uniformemente gravado, ponta de eletrodo em forma cilíndrica, segure o eletrodo cilíndrico em forma de fibra de carbono enquanto rodá-la e colocar a fibra de carbono estendendo-se desde o vidro na borda azul da chama do butano até a ponta do carbono desenvolve um vermelho Cor. Isso geralmente leva menos de 2 s. Se for bem sucedida, isso resulta em um tamanho de ponta de eletrodo gravado de 50 a 100 nm de diâmetro (uma imagem SEM de tal dica é mostrada na Figura 5B). Depois chama decapagem, coloque o eléctrodo sob um microscópio para avaliar a ponta do eletrodo.
4. Inserir o microeléctrodo cilíndrico nanotip em solução de epóxi para 3 min, seguido por um 15 s mergulhando de ponta do eletrodo em uma solução de acetona. Isso permite que o epóxi selar o espaço potencial da lacuna entre a fibra de carbono e a parede capilar de vidro isolante, enquanto a acetona limpa o epóxi fora da superfície do eletrodo gravado da fibra do carbono. Para curar o epóxi, asse os eléctrodos em estufa durante a noite a 100 ° C.
5. Antes de usar, testar a corrente de estado estacionário de microeletrodos cada fibra de carbono, conforme explicado na seção 2.7 utilizando voltametria cíclica. Para experiências, apenas usar eléctrodos que exibem um platô atual em torno de 1.5-2.5 at²⁷.
6. Para as medições amperometry intercelular, colocar as células em microscópio, conforme descrito em 2.8 e usar as mesmas configurações experimentais do potentiostat, conforme descrito em 2.9.
7. Para executar a medição amperométrico intracelular e para evitar danos físicos significativos para a célula, insira o microeléctrodo cilíndrica de nanotip a célula adicionando um mecânico suave forçar, apenas o suficiente para empurrar o elétrodo através do plasma celular membrana e para o citoplasma da célula usando um micromanipulador.
8. Após a inserção e com a membrana da célula, selado em torno do eletrodo cilíndrico, inicie a gravação de amperométrico in situ na célula viva. Na oxidação potencial que é aplicada ao eletrodo, vesículas irão adsorver na superfície do eletrodo e estocàstica romper.  Portanto, não há nenhuma necessidade para qualquer tipo de estímulo para iniciar este processo.
9. Para determinar o efeito osmótico no tamanho quantal vesículas, colete as medições de citometria intracelular de um grupo de células que têm sido incubados em isotônica e hipertônica buffer usando a condição experimental, conforme descrito na seção 2.13.

4. dados análise de gravações Amperometry

1. Para analisar os dados de amperometry gravado de exocitose e vesículas intracelulares tamanho quantal análise, use um programa de software que permite a análise de transientes atuais no atual gravado contra rastreamento de tempo assim tão cinético parâmetros de pico e a carga total integrada para picos de corrente individuais pode ser determinada. Para análise de dados, usamos software desenvolvido no laboratório de Sulzer, o que foi escrito para o programa de análise de dados Igor²⁸.
2. Quando analisar o amperométrico picos, selecione um limite para picos de três vezes o raiz da média quadrado (RMS) desvio-padrão do ruído para cada gravação.
3. Coletar os picos amperométrico de cada gravação de célula manualmente para evitar picos de falsos que não siga a forma gaussiana, o dobro de pontos que podem ser o resultado de eventos exocitose mesclado e só aceita Gaussian em forma de picos com um limite de três vezes maior do que o ruído de RMS.
4. Recolher os dados para o custo total por amperométrico único pico e usar a lei de Faraday (N = QnF) para calcular a quantidade molar de neurotransmissor de catecolamina detectado por exocitose ou evento de ruptura de vesícula única intracelular, onde N é os moles de neurotransmissores, passando por uma reação redox na superfície do elétrodo, Q = carga total detectada sob cada spike, n = número de elétrons transferidos na reação redox (n = 2 para catecolaminas) e o Faraday´s constante F = 96485 C/mol.
5. Realizar análise estatística dos dados coletados pelo primeiro calcular a carga média detectada por evento para cada célula. Então para a variação entre as células, calcular a carga média entre as células e usar um de t-Student entre células assumindo Variância desigual. Este estudo utilizou o programa MATLAB para análise estatística.

5. TEM imagens para análise de tamanho de vesículas

1. Para executar a imagem TEM de células em diferentes condições osmóticos, primeiro Incube as celulas em tampão isotônica ou hipertônica por 10 min a 37 ° C em 5% CO₂ ambiente antes fixação química das células.
2. Realize a fixação de células usando o método fixador de Karnovsky²⁹. Usando esse método, incubar as células com uma solução contendo 0,01% de azida de sódio, 1% de formaldeído e glutaraldeído de 1,25%, em que a amostra pode ser armazenada a 4 ° C.
3. Após a fixação, lavam-se as células com tampão de cacodylate de sódio 0,15 M.
4. Manchar a célula amostras post fixação e em preparação para TEM imagem, incubam as células com uma solução de tetróxido de ósmio 1% para 2 h a 4 ° C, seguido de incubação de 1 h em solução de acetato de uranilo 0,5% à temperatura ambiente no escuro.
5. Em uma etapa final da fixação, desidrata as células primeiro enxaguando as células em etanol 100% e depois enxaguar células com acetona.
6. Incorporar as amostras de células em epoxyresin e posteriormente realizar a centrifugação a 4.000 x g por 30-40 min e permitir que a amostra de células polimerizar a 40 ° C por 15 h seguido de incubação de 48 h a 60 ° C.
7. Em preparação para a imagem latente, seção amostra celular incorporado em ágar 100 resina em fatias com espessura de 60 nm, utilizando um ultramicrotome.
8. Submeter as células a uma solução de etanol acetate/25% de uranilo 4% durante 4 min, seguido por 20 s de lavagem com água. Lavar as células com citrato de chumbo de Reynolds por 3 min, seguido por 20 s de lavagem com água.
9. Imagem de microscopia eletrônica de transmissão de amostras de células de executar. Em nossos experimentos, nós usamos um microscópio eletrônico de transmissão que foi operado em 120 kV.
10. De cada imagem gravada de uma seção de célula ilustrando a ultraestrutura celular que exibe uma população das vesículas no citoplasma celular, primeiro calibre o tamanho de pixel da imagem, relacionando os pixels para a barra de escala gravada em cada imagem TEM. Use o software de imagem para determinar os tamanhos de vesículas em cada imagem de células expostas a condições isotônicas ou hipertônica. Em nossos experimentos, utilizamos o software ImageJ para análise de imagem. É interessante notar que para análise de imagens de ultraestrutura celular de imagens TEM de células, ajuste do tamanho dessas medições com base na espessura das seções de célula precisa ser considerado e têm sido descritas anteriormente por Almers´s laboratório³⁰.

Resultados

Aqui descrevemos o protocolo para como combinar imagens TEM juntamente com duas metodologias eletroquímicas, fibra de carbono amperometry e intracelular citometria de eletroquímica, pode fornecer informações que ganha uma visão mais ampla, aludindo ao efeito de pressão osmótica extracelular em vesículas secretoras e o processo de exocitose. Comparando o representante amperométrico gravações de liberação de exocitose no única células cromafins usando o experimental Setup (mostrado na Fi...

Discussão

Aqui apresentamos um protocolo e as vantagens da combinação de três métodos analíticos complementares para análise de vesículas secretoras e o processo de exocitose para ganhar uma melhor compreensão de como uma força física, tais como a pressão osmótica pode afetar vesículas secretoras e o processo de exocitose em células secretoras. Estes métodos incluem amperometry de microeletrodos de fibra de carbono, que é um método estabelecido para gravar a atividade de exocitose, citometria eletroquímica intrac...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma Aldrich	S7653
KCl	Sigma Aldrich	P9333
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma Aldrich	M-2670
Glucose	Sigma Aldrich	G8270
Collagenase P	Roche, Sweden	11 213 857 001
100-µM Nylon mesh	Fisher Sientific	08-771-19
Percoll	Sigma Aldrich	P1677
Collagen IV coated 60 mm plastic dish	VWR	354416
Centrifuge	Avanti J-20XP
Borosilicate glass capillary	Sutter instrument Co., Novato, CA
Micropipette puller	Narishing Inc., Japan	PE-21
Epoxy solutions (A and B)	Epoxy technology, Billerica, MA
Beveller	Narishing Inc.	EG-400
Inverted Microscope	Olympus	IX81
Patch clamp Instrument	Molecular Devices, Sunnyvale, CA	Axopatch 200B
Micromanipulator	Burleigh Instrument Inc., USA	PCS-5000
Butane Flame	Multiflame AB, Hässelholm, Sweden
Transmission electron microscopy	Omega	Leo 912 AB