L'effetto di Stress osmotico su vescicole secretorie ed esocitosi di monitoraggio

Riepilogo

Lo stress osmotico colpisce esocitosi e la quantità di neurotrasmettitore rilasciato durante questo processo. Dimostriamo come combinando metodi elettrochimici insieme con microscopia elettronica di trasmissione può essere utilizzato per studiare l'effetto della pressione osmotica extracellulare per attività di esocitosi, vescicola quantal dimensione e la quantità di neurotrasmettitore rilasciato durante esocitosi.

Abstract

Amperometria registrazione delle cellule sottoposti a shock osmotico dimostrano che cellule secretive rispondono a questo sforzo fisico riducendo l'attività di esocitosi e la quantità di neurotrasmettitore rilasciato da vescicole in eventi di singolo esocitosi. È stato suggerito che la riduzione in neurotrasmettitori espulso è dovuto le alterazioni nella proprietà biofisiche della membrana quando cellule restringono in risposta allo stress osmotico e con presupposti che non sono interessate vescicole secretorie nel citoplasma delle cellule da extracellulare stress osmotico. Amperometria registrazione di esocitosi monitora ciò che viene rilasciato dalle cellule al momento una vescicola si fonde con la membrana plasmatica, ma non fornisce informazioni sul contenuto della vescicola prima che la fusione della vescicola è attivata. Pertanto, combinando amperometria registrazione con altri metodi analitici complementari che sono in grado di caratterizzare le vescicole secretorie prima che venga attivato l'esocitosi alle cellule offre una panoramica più ampia per l'esame come secretive vescicole e la processo di esocitosi sono interessati da shock osmotico. Qui descriviamo come complemento amperometria registrazione con intracellulare cytometry elettrochimica e formazione immagine di microscopia elettronica (TEM) di trasmissione può essere utilizzato per caratterizzare le alterazioni nei contenuti di dimensione e neurotrasmettitore di vescicole secretorie in cellule cromaffini in relazione all'attività di esocitosi prima e dopo l'esposizione a stress osmotico. Collegando le informazioni quantitative acquisite dagli esperimenti utilizzando tutti i tre metodi di analisi, conclusioni sono state fatte in precedenza che vescicole secretorie rispondano agli stress osmotico extracellulare shrinking nel formato e riducendo la dimensione quantal vescicola a mantenere una concentrazione di neurotrasmettitore costante della vescicola. Quindi, questo dà alcuni chiarimenti per quanto riguarda perché le vescicole, in risposta a stress osmotico, riducono i neurotrasmettitori di importo rilasciati durante il rilascio di esocitosi. Le registrazioni di amperometrico qui indicano che questo è un processo reversibile e quella della vescicola dopo shock osmotico sono riforniti con neurotrasmettitori quando posizionate cellule vengono ripristinate in un ambiente isotonico.

Introduzione

Le cellule cromaffini in ghiandole surrenali sono cellule neuroendocrine che rilasciano molecole di neurotrasmettitore nel flusso sanguigno. Questo avviene attraverso un processo cellulare che coinvolge l'attracco e la fusione delle vescicole piene di neurotrasmettitori, conseguente rilascio contenuto dalle vescicole allo spazio extracellulare in un processo chiamato esocitosi. I neurotrasmettitori (adrenalina e noradrenalina) nelle cellule cromaffini sono attivamente trasportati da proteine di membrana in vescicole grande nucleo denso (LDCVs) e conservati a alte concentrazioni (~0.5-1 M)^1,2. Accumulazione dei neurotrasmettitori all'interno del LDCVs, impostando l'affinità delle molecole della catecolammina alla matrice della proteina di intravesicular nucleo denso composta chromogranin proteine (~ 169 mg/mL)^{3,4,5 ,6}e una soluzione cocktail intravesicular contenente componenti chiave per il caricamento della catecolamina e deposito nella vescicola come ATP (125-300 mM)⁷, Ca^{2 +} (50-100 µM nella soluzione e ~ 40 mM associato ai matrice proteica)⁸,⁹Mg^{2 +} (5 mM), ascorbato (10-30 mM)¹⁰e un pH di ~5.5^11,12. Il LDCVs mantenere una condizione di iso-osmotico con il citoplasma delle cellule (310 mOsm/kg)¹³, anche se la concentrazione del soluto teorica all'interno delle vescicole sommare fino a più di 750 mM. La composizione dei componenti intravesicular non è solo essenziale per il caricamento e l'archiviazione delle catecolamine, ma anche per l'aggregazione di soluti di matrice della proteina di nucleo denso. Questo riduce significativamente l'osmolarità delle vescicole è significativamente ridotta e può influenzare la catecolammina importo che viene rilasciata durante l'esocitosi^5,6.

Studi sull'effetto della pressione osmotica extracellulare sul processo di esocitosi di registrazione amperometrici sono segnalati che alta pressione osmotica extracellulare inibisce l'attività di esocitosi e riduce il numero di neurotrasmettitori secernuta dal singolo vescicola scomparti^{4,14,15,16,17,18,19}. Le spiegazioni di queste osservazioni hanno speculato sulla valorizzazione possibile di affollamento macromolecolare negli eventi di fusione cellulare citoplasma d'inibizione della vescicola e un'alterazione nella proprietà biofisiche della membrana che interessano il numero di neurotrasmettitori rilasciati durante l'esocitosi. Questi pensieri presume che stress osmotico extracellulare elevato non pregiudica la dimensione quantal della vescicola, che definisce il numero di molecole di neurotrasmettitore memorizzati in un vano della vescicola in fase preventiva di esocitosi innescata^{14, 15 , 17 , 19 , 20 , 21}. amperometrico di misura del rilascio di esocitosi in singole cellule un microelettrodo di disco di fibra di carbonio è posto a stretto contatto con la superficie delle cellule, creando un'impostazione sperimentale che imita la configurazione di sinapsi, dove l'amperometrico elettrodo funge da un rivelatore postsinaptici (Figura 1)^22,23. Stimolando una cella per esocitosi, uno può indurre vescicole piene di neurotrasmettitori per fondersi con la membrana plasmatica delle cellule e rilasciare il contenuto completo della vescicola o parte nello spazio extracellulare. Queste molecole di neurotrasmettitore rilasciate sulla superficie dell'elettrodo possono essere rilevate elettrochimicamente se i neurotrasmettitori sono elettroattivi (ad es., catecolamine) applicando un potenziale redox di + 700 mV vs un elettrodo di riferimento Ag/AgCl . Di conseguenza, una serie di picchi di corrente contrassegnare il rilevamento di eventi singoli esocitosi. Dalla corrente rispetto al tracciato temporale in una registrazione amperometrico, l'area sotto ogni singolo amperometrico spike rappresenta il costo rilevato per ogni evento di esocitosi e può essere convertito alla mole di neurotrasmettitori rilasciati, usando l'equazione di Faraday. Quindi, le registrazioni di amperometrico forniscono informazioni quantitative sui neurotrasmettitori quantità espulsi da eventi di singolo esocitosi e registrare la frequenza degli eventi di esocitosi, ma non presentano informazioni quantitative sulle vescicole secretorie contenuto prima della fusione della vescicola e del rilascio di neurotrasmettitore è stata avviata.

Pertanto, per ottenere una migliore comprensione delle vescicole secretorie come nella cella citoplasma rispondere agli stress osmotico extracellulare prima che la cella venga attivata per subire l'esocitosi, altri metodi analitici complementari possono essere utilizzati per arricchire queste informazioni. Per esempio, per studiare se lo stress osmotico altera il volume delle vescicole, microscopia elettronica a trasmissione (TEM) analisi di imaging può essere utilizzata per misurare le dimensioni delle vescicole delle cellule dopo la fissazione chimica. Per esaminare se lo stress osmotico influisce sulle dimensioni quantal della vescicola, una tecnica sviluppata di recente amperometrico chiamata intracellulare cytometry elettrochimica, può essere applicato per la quantificazione del contenuto di neurotrasmettitore vescicola alle vescicole secretorie in loro stato nativo quando ancora residente nel citoplasma delle cellule vive²⁶. Nella tecnica elettrochimica intracellulare cytometry, un elettrodo cilindrico in fibra di carbonio nanotip viene delicatamente inserito nel citoplasma di cellule vive e, applicando un potenziale di + 700 mV a questo elettrodo (elettrodo di riferimento vs un Ag/AgCl), il contenuto della catecolamina in vescicole può essere quantificata tramite la rilevazione di un picco di corrente di redox da vescicole singole collisione, adsorbente e successivamente casualmente rottura alla superficie dell'elettrodo e quindi rilasciando il loro contenuto contro il elettrodo superficiale²⁶. Quindi, nell'amperometrica corrente rispetto al tracciato temporale, ogni evento di rottura della vescicola singolo può provocare un transitorio di corrente e, integrando l'area di ogni picco di corrente, la dimensione quantal vescicola può essere calcolata usando la legge di Faraday´s.

Pertanto, collegando le informazioni quantitative acquisite misure di dimensione delle vescicole usando la formazione immagine TEM insieme con analisi della vescicola quantal dimensione, così come registrato da intracellulare cytometry elettrochimica, concentrazione del neurotrasmettitore della vescicola può anche essere determinato. Questo permette la caratterizzazione della vescicola quando le cellule sono esposte a differenti condizioni osmotiche e fornisce una vista migliore su come vescicole possono rispondere agli stress osmotico extracellulare nella fase prima dell'esocitosi. I risultati dalla combinazione di questi metodi hanno dimostrato che in presenza, ad alta pressione osmotica extracellulare vescicole strizzacervelli e regolare la loro dimensione quantali e confrontando le informazioni quantitative sui cambiamenti relativi da queste misurazioni dimostra che durante la contrazione, vescicole regolare loro contenuto e le dimensioni per mantenere una concentrazione di neurotrasmettitore costante²⁴. Così, questa comprensione è utile in collegamento per le osservazioni fatte sul rilascio di neurotrasmettitori in cellule esposte a stress osmotico. In questi protocolli, descriviamo l'uso di queste tre metodologie complementari che consentono la caratterizzazione delle vescicole secretorie come nel loro ambiente nativo rispondere alla osmolarità extracellulare e gli effetti di questa risposta su esocitosi processo. Oltre alle nostre osservazioni precedenti per quanto riguarda l'effetto dell'alta pressione osmotica su esocitosi²⁴, presentiamo gli esperimenti supplementari che descrivono il recupero delle cellule dopo shock osmotico e l'effetto di molteplici stimolazioni di bario in cromaffini cellule.

Protocollo

1. cella cultura delle cellule cromaffini Bovine isolate tramite digestione enzimatica dalle ghiandole surrenali

1. Per isolare le cellule cromaffini raccolte dalle ghiandole surrenali bovini, sterilizzare le cellule con una soluzione di etanolo 70%. Tagliare via grasso e tessuto connettivo usando un bisturi. Per rimuovere sangue, sciacquare le vene surrenali utilizzando soluzione di Locke (154mm NaCl, KCl 5.6 mM, NaHCO3 3.6 mM, idrossietil piperazineethanesulfonic acido (HEPES) 5,6 mM a pH 7.4) che è stato termostatato a 37 ° C.
2. Per digerire il tessuto, gonfiare ogni ghiandola iniettando circa 2,5 mL di soluzione collagenasi P 0,2% del filtrato sterile caldo attraverso la vena surrenale usando una siringa e incubare il tessuto per 20 min a 37 ° C. Esaminare le ghiandole per garantire che il processo di digestione del midollo è completato. Il tessuto dovrebbe sentire morbido e non teso.
3. Raccogliere il midollo digerito di cattura fuori le ghiandole in direzione longitudinale. Tritare il tessuto di midollo usando un bisturi. Filtrare la sospensione di tessuto sopra un setaccio in acciaio e diluire con soluzione di Locke a circa un volume di 50 mL per ridurre l'attività della collagenasi P.
4. Agglomerare le cellule a 300 x g in una centrifuga per 10 min a temperatura ambiente e raccogliere in 50 mL provette sterili. Risospendere il pellet ottenuto in soluzione di 20ml Locke e filtrare la soluzione sopra una maglia di nylon sterile 100 µm nelle provette.
5. Mescolare la sospensione di cellule cromaffini con Percoll sterile (1:1) e centrifugare la soluzione di cella a 18.600 x g per 20 min a temperatura ambiente. Lo strato superiore del gradiente di densità di raccogliere e filtrare la soluzione sopra una maglia di nylon di 100 µm nelle provette.
6. Per escludere Percoll, diluire la sospensione cellulare con soluzione di Locke e centrifugare a 300 x g per 10 min a temperatura ambiente prima di ri-sospendere il pellet in soluzione di Locke. La densità delle cellule stimato della sospensione delle cellule isolato è di circa 4 milioni cellule/mL.
7. Per la registrazione di amperometrico di esocitosi e intracellulare cytometry misurazioni, le cellule cromaffini piastra in collagene IV rivestito 60 mm plastica piatti ad una densità di circa 17,5 × 10³ cellule/cm² e incubare le cellule a 37 ° C in un 5% di CO₂ ambiente. Eseguire gli esperimenti di elettrochimici entro 1-3 giorni di coltura cellulare.
8. Per il TEM di imaging esperimenti, le cellule cromaffini piastra in matracci di cultura di 75cm² cella ad una densità di 7 milioni di cellule per boccetta e incubare a 37 ° C in un ambiente di 5% CO₂ per 1 giorni.

2. singola cella esocitosi amperometria esperimenti²⁴

1. Per fabbricare microelettrodi in fibra di carbonio per questi esperimenti, prendete un bicchiere capillare con un diametro esterno adatto per il portaelettrodo nella fase testa che saranno utilizzati in questi esperimenti. Utilizzare un capillare di vetro borosilicato con un diametro esterno di 1.2 mm e un diametro interno di 0,69 mm.
   1. Collegare una delle estremità del capillare ad un tubo di aspirazione di acqua. Posto 5 µm diametro fibre di carbonio su qualcosa, come un pezzo di carta bianco, per migliorare la visualizzazione.
   2. Identificare una singola fibra di carbonio e la fibra tenendo premuto su un'estremità con un dito per mantenere la fibra di carbonio in posizione mentre l'estremità aperta del capillare non posizionare in prossimità all'estremità libera della fibra di carbonio. Aspirare delicatamente la fibra di carbonio in vetro capillare affinché la fibra di carbonio sporge attraverso entrambe le estremità del capillare. Allontanare la forza di aspirazione.
2. Posizionare il capillare con la fibra di carbonio in un estrattore micropipetta e tirare il vetro capillare in due punte di pipetta di vetro separato. Per disconnettere la fibra di carbonio che è collegata tra le punte di due vetro, utilizzare un paio di forbici per tagliare la fibra di carbonio e guadagnare due microelettrodi di fibra di carbonio.
3. Sotto un microscopio, posizionare la fibra di carbonio sulla cima di un vetrino da microscopio più spessa che permette il taglio manuale della fibra di carbonio al bordo del dove la fibra si estende dal rivestimento capillare di vetro usando un bisturi.
4. Dopo aver tagliato la fibra di carbonio, lasciando una punta di vetro rivestito in fibra di carbonio, inserire pochi mm della punta dell'elettrodo in una soluzione di resina epossidica per 10 min a tirare fino a resina epossidica e sigillare ogni possibile spazio aperto tra la fibra di carbonio e il vetro circostante. Sollevare gli elettrodi lentamente dalla soluzione di resina epossidica per evitare che gocce di colla ingombranti formino sulla punta dell'elettrodo.
5. Posizionare gli elettrodi su un supporto (ad es., un bastone di legno piano) con due lati nastro resistente al calore appiccicoso a cui gli elettrodi possono essere attaccati. Cuocere gli elettrodi epossidica trattata durante la notte in un forno a 100 ° C. L'elettrodo suggerimenti facilmente rompono se entrano in contatto con una superficie, in modo da garantire gli elettrodi sempre sono memorizzati in modo sicuro utilizzando un supporto dove gli elettrodi sono fissati in posto e suggerimenti non rischiare di essere toccato.
6. Per ottenere una superficie di elettrodo disco piatto, posizionare l'elettrodo nel supporto di un microgrinder e smussare ogni elettrodo in fibra di carbonio ad un angelo di 45°. Dopo la smussatura, contrassegnare il capillare sulla sua parte superiore utilizzando un pennarello indelebile per poi saper individuare la superficie dell'elettrodo di disco ad un angolo di 45° quando si posiziona l'elettrodo vicino a celle per la misura di esocitosi.
   Nota: Questo passaggio è importante come in questi esperimenti, l'elettrodo a disco ovale deve essere disposto piatta sulla parte superiore le cellule con la sua superficie parallela alla superficie del piatto Petri. Inoltre, smussatura elettrodi sono fatta lo stesso giorno di esperimenti per garantire una superficie dell'elettrodo di fresco e pulito.
7. Prima dell'utilizzo, collocare ciascun microelettrodo di fibra di carbonio in una soluzione di test (ad es., dopamina di 0,1 mM in tampone PBS (pH 7,4)) per monitorare lo stato di costante corrente mediante voltammetria ciclica. Per una scansione di voltammetria ciclica, applicare una forma d'onda potenziale triangolo da -0,2 V a + 0.8 V vs un elettrodo di riferimento Ag/AgCl a 100 mV/s per garantire la buona reazione cinetica dei dati che si ottengono sono d'accordo con i valori teoricamente calcolati per un disco di diametro di 5 µm fibra di carbonio microelettrodo²⁵.
8. Per registrazione amperometria dell'esocitosi, posizionare la capsula di Petri con le cellule cromaffini coltivate su un microscopio invertito. È importante proteggere il microscopio impostato con una gabbia di Faraday per eliminare il rumore elettronico durante l'amperometria registrazione, a causa delle correnti molto piccole da misurare. Utilizzare un microscopio riscaldante per mantenere una temperatura di 37 ° C durante gli esperimenti di cella.
9. Utilizzare uno strumento di basso rumore patch clamp per applicare un potenziale costante di + 700 mV all'elettrodo di lavoro contro un elettrodo di riferimento Ag/AgCl che verrà inserito anche di Petri lontano l'elettrodo di lavoro. Per registrazione esocitosi di cellule cromaffini, digitalizzare il segnale a 10 kHz e applicare un interno passa-basso filtro di Bessel a 2 kHz per filtrare il segnale registrato.
10. Per eseguire amperometrico registrazione alle singole cellule, montare il microelettrodo di disco in fibra di carbonio appena smussato e testato nel portaelettrodo della fase testa che viene utilizzato con il potenziostato.
    1. Delicatamente posto l'elettrodo con il disco ovale piatta forma elettrodo superficie rivolta in basso verso la superficie apicale della cellula e posizionare l'elettrodo a contatto con la membrana cellulare utilizzando un micromanipolatore.
    2. Regolare la distanza tra l'elettrodo e la cella monitorando la deformazione delle cellule causata dall'elettrodo sopra la disposizione sulla parte superiore della membrana cellulare e quindi attentamente ritrarre l'elettrodo ad una distanza dove la cella riacquista una forma vicino alla sua originale forma di cella . L'ideale per la registrazione di cinetica e quantitativa è quello di creare una sottile pellicola liquida di cento nanometri per separare la superficie degli elettrodi e delle cellule, che sono condizioni simili per rilevamento postsinaptico del rilascio chimico in una sinapsi.
11. Per stimolare le cellule per esocitosi, posizionare una micropipetta di vetro con una dimensione di punta di 2-3 µm di diametro, riempito con soluzione di 5mm BaCl₂ ad una distanza di almeno 20 µm dalla cella, per evitare qualsiasi soluzione che fuoriesce dalla punta della pipetta per influenzare la sperimentare e applicare un impulso di iniezione di s 5 5 mm BaCl₂ soluzione alla superficie delle cellule per stimolare la cellula di esocitosi.
12. Per studiare gli effetti reversibili della pressione osmotica, il processo di esocitosi, preparare una soluzione isotonica tampone (150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM MgCl2, glucosio di 5 mM, 10 mM HEPES, pH 7.4) con 310 mOsm/kg iso-osmotica e un buffer ipertonico effettuata regolando la Concentrazione di NaCl della soluzione tampone isotonica con un'osmolalità corrispondenti a 730 mOsm/kg.
13. Posizionare le cellule nel buffer isotonico e stimolare la cellula per esocitosi applicando un impulso di iniezione di bario durante la registrazione i transitori di corrente amperometrico durante l'attività di esocitosi iniziati per circa 3 min.
    1. Per confrontare le risposte di esocitosi in condizioni isotoniche per condizioni ipertoniche, incubare le cellule per 10 minuti in una soluzione ipertonica tampone e successivamente applicare un impulso di iniezione di bario per stimolare l'esocitosi ed eseguire 3 min di registrazione amperometrico.
    2. Per la risposta reversibile delle cellule, incubare le cellule ancora per 10 minuti in una soluzione tampone isotonica e stimolano le cellule applicando un 5s iniezione di bario di impulso ed eseguire 3 min di registrazione della risposta di esocitosi dalla cellula.
14. Come gli esperimenti di controllo per determinare l'effetto su attività di esocitosi dalle molteplici stimolazioni di bario, eseguire una registrazione amperometrico di esocitosi rilascio da tre consecutivi BaCl₂ stimolazioni sulla stessa cella inseriti nel buffer isotonico e usando lo stesso protocollo di tempo per gli esperimenti di incubazione delle cellule consecutivi con diversa osmolarità.

3. intracellulare Cytometry elettrochimico^24,26

1. Per realizzare elettrodi per misure quantal della vescicola, utilizzare gli stessi materiali e iniziare a preparare un 5 µm in elettrodo di fibra di carbonio di diametro secondo le descrizioni nelle sezioni 2.1 e 2.2 di fabbricazione microelettrodo per esocitosi amperometrico misurazioni.
2. Sotto un microscopio, è necessario utilizzare un bisturi per tagliare la fibra di carbonio si estende dalla punta vetro affinché una fibra di carbonio con una lunghezza che varia da 30 a 100 µm è lasciata sporge dalla punta vetro.
3. Per preparare una fiamma e acidato punta dell'elettrodo in fibra di carbonio, utilizzare una fiamma butano. Per ottenere un uniformemente acidato, punta dell'elettrodo di forma cilindrica, tenere l'elettrodo in fibra di carbonio a forma cilindrica, ruotandola e mettere la fibra di carbonio che si estendono dal vetro bordo blu della fiamma butano fino a quando la punta del carbonio si sviluppa un colore rosso Colore. Questo spesso richiede meno di 2 s. In caso di successo, questo genera una dimensione di punta dell'elettrodo acidato di 50-100 nm di diametro (un'immagine di SEM di tale suggerimento è illustrata nella Figura 5B). Dopo fiamma acquaforte, posizionare l'elettrodo al microscopio per valutare la punta dell'elettrodo.
4. Inserire il microelettrodo cilindrico nanotip in soluzione di resina epossidica per 3 min seguita da un 15 s immersione della punta dell'elettrodo in una soluzione di acetone. Questo consente a resina epossidica sigillare lo spazio potenziale divario tra la fibra di carbonio e la parete capillare di vetro isolante, mentre l'acetone Cancella la resina epossidica fuori dalla superficie dell'elettrodo acidato in fibra di carbonio. Per curare la resina epossidica, cuocere gli elettrodi in un forno durante la notte a 100 ° C.
5. Prima dell'uso, verificare la corrente allo stato stazionario di ciascun microelettrodo di fibra di carbonio, come spiegato nella sezione 2.7 mediante voltammetria ciclica. Per esperimenti, utilizzare solo elettrodi che visualizzano un altopiano attuale intorno 1.5-2.5 nA²⁷.
6. Per misurazioni intercellulare amperometria, posizionare le cellule al microscopio, come descritto in 2.8 e utilizzare le stesse impostazioni sperimentali del potenziostato come descritto in 2.9.
7. Per eseguire la misurazione amperometrica intracellulare e per evitare danni fisici significativi alla cella, inserire il microelettrodo cilindrico nanotip nella cella aggiungendo una meccanica delicata forza, quanto basta per spingere l'elettrodo attraverso il plasma delle cellule membrana e nel citoplasma delle cellule utilizzando un micromanipolatore.
8. Dopo l'inserimento e con la membrana cellulare sigillato intorno all'elettrodo cilindrico, avviare la registrazione di amperometrico in loco presso le cellule vive. Presso l'ossidazione potenziale che viene applicata all'elettrodo, vescicole saranno adsorbire alla superficie dell'elettrodo e casualmente rottura.  Quindi, non esiste nessuna necessità per qualsiasi tipo di stimolo ad avviare questo processo.
9. Per determinare l'effetto osmotico sulla dimensione quantal della vescicola, raccogliere le misurazioni intracellulare cytometry da un gruppo di cellule che sono state incubate in isotonica e ipertonica buffer utilizzando la condizione sperimentale come descritto nella sezione 2.13.

4. analisi dei dati delle registrazioni amperometria

1. Per analizzare i dati registrati amperometria da esocitosi e analisi della dimensione quantal vescicola intracellulare, utilizzare un programma software che permette l'analisi di transitori di corrente in corrente registrata rispetto al tracciato temporale così che cinetica parametri di picco e la carica totale integrato per singoli picchi di corrente può essere determinato. Per l'analisi dei dati, abbiamo usato il software sviluppato in laboratorio Sulzer che è stato scritto per il programma di analisi di dati Igor²⁸.
2. Quando analizzando l'amperometrica spikes, selezionare un limite di soglia per i picchi di tre volte la root-mean square (RMS) deviazione standard del rumore per ogni registrazione.
3. Raccogliere le punte amperometrico da ogni registrazione cellulare manualmente per evitare falsi picchi che non seguono la forma gaussiana, doppie punte che possono essere il risultato di eventi Unite esocitosi e accettano solo picchi di forma gaussiane con una soglia di tre volte superiore rispetto al rumore di RMS.
4. Raccogliere i dati a totale costo per singola amperometrico di picco e utilizzare Faradays legge (N = QnF) per calcolare la quantità molare di neurotrasmettitore catecolamina rilevato per esocitosi o intracellulare della vescicola singola rottura evento, dove N è i moli di neurotrasmettitori, passando attraverso una reazione redox alla superficie dell'elettrodo, Q = la carica totale rilevata sotto ogni spike, n = numero di elettroni trasferiti nella reazione redox (n = 2 per le catecolamine) e il Faraday´s costante F = 96485 C/mol.
5. Effettuare analisi statistiche dei dati raccolti calcolando prima la Tariffa media rilevata per ogni evento per ogni cella. Quindi per la varianza tra le cellule, calcolare la Tariffa media tra cellule e utilizzare un test di student t-tra cellule assumendo varianza disuguale. Questo studio ha usato il programma MATLAB per l'analisi statistica.

5. TEM Imaging per l'analisi della dimensione della vescicola

1. Per eseguire la formazione immagine TEM delle cellule alle diverse condizioni di osmotiche, in primo luogo Incubare le cellule nel buffer isotonica o ipertonica per 10 min a 37 ° C in un 5% CO₂ ambiente prima della fissazione chimica delle cellule.
2. Eseguire la fissazione delle cellule usando il metodo fissativo di Karnofsky²⁹. Utilizzando questo metodo, incubare le cellule con una soluzione contenente sodio azide allo 0,01%, 1% di formaldeide e 1,25% glutaraldeide in cui il campione può essere conservato a 4 ° C.
3. Dopo la fissazione, lavare le cellule con tampone di cacodilato di sodio 0,15 M.
4. A macchiare la cella campioni post fissazione e in preparazione per TEM imaging, incubare le cellule con una soluzione di tetrossido di osmio 1% per 2 ore a 4 ° C, seguita da incubazione 1h in soluzione di acetato di uranile 0,5% a temperatura ambiente al buio.
5. In un passaggio finale di fissazione, disidratare le cellule in primo luogo risciacquando le cellule in etanolo al 100% e poi risciacquare le cellule con acetone.
6. Incorporare i campioni delle cellule in epossidico e successivamente eseguire la centrifugazione a 4.000 x g per 30-40 min e consentire il campione di cellule polimerizzare a 40 ° C per 15 h seguita da 48 ore di incubazione a 60 ° C.
7. In preparazione per l'imaging, sezione campione cellulare incorporato in Agar 100 resina a fette con spessore di 60 nm utilizzando un ultramicrotomo.
8. Sottoporre le cellule ad una soluzione di etanolo 4% uranile acetate/25% per 4 min seguita da 20 s di risciacquo con acqua. Lavare le cellule con citrato di piombo di Reynolds per 3 min., seguita da 20 s di risciacquo con acqua.
9. Eseguire la formazione immagine di microscopia elettronica di trasmissione di campioni di cellule. Nei nostri esperimenti, abbiamo usato un microscopio elettronico a trasmissione che è stato operato a 120 kV.
10. Da ogni immagine registrata di una sezione di cella che illustrano l'ultrastruttura delle cellule che visualizza una popolazione delle vescicole nel citoplasma delle cellule, prima di calibrare la dimensione in pixel immagine mettendo in relazione i pixel con la barra della scala registrata in ogni immagine TEM. Utilizzare software di imaging per determinare le dimensioni delle vescicole a ogni immagine delle cellule esposte a condizioni isotoniche o ipertoniche. Nei nostri esperimenti, abbiamo usato il software ImageJ per analisi di immagine. Vale la pena notare che per analisi di immagine di ultrastruttura cellulare da immagini TEM delle cellule, regolazione della dimensione di queste misurazioni in base allo spessore delle sezioni delle cellule deve essere considerato e precedentemente sono stati descritti da Almers´s lab³⁰.

Risultati

Descriviamo qui il protocollo per come formazione immagine TEM insieme due metodologie elettrochimiche, fibra di carbonio amperometria e intracellulare cytometry elettrochimica, la combinazione può fornire informazioni che guadagna una visione più ampia, alludendo all'effetto di pressione osmotica extracellulare su vescicole secretorie e il processo di esocitosi. Confrontando il rappresentante amperometrico registrazioni di esocitosi rilascio alle singole cellule cromaffini utilizzando lo sperimentale istituito (mostra...

Discussione

Qui presentiamo un protocollo e i vantaggi della combinazione di tre metodi analitici complementari per analizzare le vescicole secretorie e il processo di esocitosi di acquisire una migliore comprensione di come una forza fisica come la pressione osmotica può influenzare le vescicole secretorie e il processo di esocitosi in cellule secretive. Questi metodi includono amperometria microelettrodo di fibra di carbonio, che è un metodo consolidato per la registrazione di attività di esocitosi, intracellulare cytometry ele...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma Aldrich	S7653
KCl	Sigma Aldrich	P9333
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma Aldrich	M-2670
Glucose	Sigma Aldrich	G8270
Collagenase P	Roche, Sweden	11 213 857 001
100-µM Nylon mesh	Fisher Sientific	08-771-19
Percoll	Sigma Aldrich	P1677
Collagen IV coated 60 mm plastic dish	VWR	354416
Centrifuge	Avanti J-20XP
Borosilicate glass capillary	Sutter instrument Co., Novato, CA
Micropipette puller	Narishing Inc., Japan	PE-21
Epoxy solutions (A and B)	Epoxy technology, Billerica, MA
Beveller	Narishing Inc.	EG-400
Inverted Microscope	Olympus	IX81
Patch clamp Instrument	Molecular Devices, Sunnyvale, CA	Axopatch 200B
Micromanipulator	Burleigh Instrument Inc., USA	PCS-5000
Butane Flame	Multiflame AB, Hässelholm, Sweden
Transmission electron microscopy	Omega	Leo 912 AB