طريقة لتصنيف النصوص في الخلايا الفردية الإشريكيّة القولونية للأسفار جزيء واحد في الموقع تجارب التهجين

Summary

ويصف هذه المخطوطة أسلوب لوصف النصوص الفردية رسول من الحمض النووي الريبي (مرناً) مع تحقيقات الحمض النووي المسمى فلوريسسينتلي، لاستخدامها في الأسفار جزيء واحد في الموقع تجارب التهجين (سمفيش) في كولاي. سمفيش هو أسلوب تصور يسمح الكشف المتزامن، والترجمة، والتقدير الكمي لواحد مرناً الجزيئات في الخلايا الفردية الثابتة.

Abstract

يتم وصف أسلوب لوصف النصوص الفردية رسول من الحمض النووي الريبي (مرناً) في البكتيريا الثابتة للاستخدام في الأسفار جزيء واحد في الموقع تجارب التهجين (سمفيش) في كولاي. يسمح سمفيش قياس التغير خلية إلى خلية في عدد النسخ مرناً للجينات للفائدة، فضلا عن موقع سوبسيلولار للنصوص. الخطوات الرئيسية التي تنطوي عليها هي تثبيت ثقافة الخلية البكتيرية، permeabilization أغشية الخلايا، والتهجين النصوص المستهدفة مع مجموعات من المسابر اليغنوكليوتيد المسمى فلوريسسينتلي القصيرة المتاحة تجارياً. يمكن أن تسمح سمفيش تصوير وقائع جينات متعددة في نفس الخلية، مع القيود التي فرضتها التداخل الطيفي بين علامات مضيئة مختلفة. وعقب انتهاء البروتوكول هو موضح أدناه، خلايا يمكن سهولة تصويرها استخدام مجهر مقترنة بكاميرا مناسبة للأسفار المنخفضة الكثافة. هذه الصور، جنبا إلى جنب مع ملامح الخلية التي تم الحصول عليها من تجزئة المرحلة التباين الإطارات، أو تلطيخ غشاء الخلية، السماح لحساب توزيع مرناً نسخة رقم عينة خلايا باستخدام برمجيات المصدر المفتوح أو كتب مخصصة. يمكن أيضا تطبيق الأسلوب وضع العلامات الموصوفة هنا لنسخ الصورة مع التعمير البصرية العشوائية مجهرية (العاصفة).

Introduction

ستوتشاستيسيتي هو أحد جوانب الأساسية والتي لا يمكن تجنبها للتعبير الجيني ويؤدي إلى الخلية الخلية التغايرية¹، سواء على مستوى النصوص والبروتينات^2،3. التحديد الكمي للتفاوت بين الخلايا تحت ظروف محددة جيدا توفر نافذة فريدة من نوعها في العمليات الأساسية التي تكمن وراء التعبير الجيني ولائحته. واحد مصدرا هاما للخلية عدم التجانس في البكتيريا تجري على المستوى النسخي. تتباين أرقام نسخة ليس فقط بسبب ستوتشاستيسيتي للنسخ، ولكن أيضا لعمليات بوستترانسكريبشونال مثل تنظيم الكشف ورناسيس صغيرة². طريقة واحدة للوصول مباشرة إلى هذا التباين بطريقة كمية علامات النصوص الفردية لجين معين فلوريسسينتلي في سمفيش. هذه المنهجية يسمح بالكشف عن والتعريب سوبسيلولار من جزيئات الحمض النووي الريبي خاصة في ثابتة، الخلايا البكتيرية الفردية⁴. يتم تهجين مرناس مع مجموعة من المسمى فلوريسسينتلي ~ 20 قاعدة طويلة النوكليوتيد التي تهدف إلى ربط بشكل انتقائي للمحاضر الحرفية للفائدة^5،6. العلامات متعددة تضمن الكشف أعلاه الخلفية الفلورية، والفرد مرناً الجزيئات تظهر كبقع حيود محدودة تحت مجهر الأسفار⁷ (انظر الشكل 1). وهناك نهج أخرى لوصف جزيئات مرناً، التي تحمل تحقيقات تكميلية oligomer haptens مترافق (مثلاً، البيوتين أو ديجوكسيجينين) التي تم الكشف عنها باستخدام تقنيات مراسل الثانوي المسمى فلوريسسينتلي⁸.

وهناك أساليب أخرى توفر معلومات كمية عن النصوص، بالإضافة إلى سمفيش. بعضها، مثل الشمالي لطخة أو PCR الكمي، التحقيق الجزء الأكبر وهكذا يمكن قياس عدد نسخ مرناً لا موقفهم في الخلايا الفردية. ولهذه الأساليب ليست مناسبة لقياس التغير خلية إلى خلية. تم تطوير تقنية المستندة إلى الصورة الأخيرة التي تسمح للتقدير الكمي لعدد نسخ الكشف داخل الخلايا، فضلا عن موقعها داخل الخلايا، ودعا متعدد الأسفار خطأ قوية في الموقع التهجين (ميرفيش). ميرفيش يستند تعيين رمز شريطي فريد يتألف من مجموعة محددة من عدد محدد من المسابر اليغنوكليوتيد المسمى فلوريسسينتلي. يتم قراءة هذه الرموز الشريطية في جولات متتابعة من القياسات سمفيش، مع فوتوبليتشينج بعد كل جولة من التهجين، وبالتالي زيادة الإنتاجية بأوامر اثنين من حجم^9،10. يتطلب هذا الأسلوب سائل الآلي التعامل مع النظام والتصميم السليم لمجموعة التحقيق.

يتيح الجمع بين عدة fluorescence تسمية النصوص الفردية، جنبا إلى جنب مع تقنيات رواية القرار عظمى مثل التعمير البصرية العشوائية مجهرية (العاصفة)¹¹، بزيادة عشرة إضعاف في القرار في سوبسيلولار ترجمة النصوص. في العاصفة، يسمح مزيج مناسب من المسابر الفلورسنت والمخزن المؤقت للتصوير لدورات متعددة من انبعاث الأسفار كل جزيء مسبار (وامض). كما يمكن استخدام العاصفة صورة الترنسكربيتوم كولاي ومراقبة منظمة الجينوم المنظومة المكانية من الجيش الملكي النيبالي، بوسم جميع وقائع الفائدة¹²في وقت واحد.

تستند كافة الأساليب وحيدة الخلية التي تم استعراضها أعلاه التصوير المحاضر في الخلايا الثابتة. ومن ثم فإنها لا توفر أية معلومات تتعلق بالخصائص الحركية للنصوص داخل الخلايا. متابعة المحاضر في الخلايا الحية¹³، يمكن أن تعتبرها مرناس انصهار الجينات التي تهم مجموعة من مواقع الربط. هذه الأخيرة هي ثم يقرها بروتين الحمض النووي الريبي ملزمة، مثل عاثية MS2 معطف البروتين، الذي هو تنصهر فيها بروتين فلوري مثل البروتينات الفلورية الخضراء (بروتينات فلورية خضراء)^10،،من¹⁴¹⁵.

هنا يصف لنا طريقة لوسم مرناس الفردية مع مجموعة من المجسات الحمض النووي المسمى فلوريسسينتلي، لاستخدامها في التجارب سمفيش، ولا سيما في كولاي. وعلاوة على ذلك، نحن تظهر أنه يمكن استخدام نفس نظام وضع العلامات للقياسات العاصفة مع تعديلات طفيفة.

Protocol

1-التحقيق في التصميم

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول المسابير اليغنوكليوتيد المتاحة تجارياً علامات تمييز بالفعل مع فلوروفوريس. المسابير تتكون من مجموعة من تسلسل معين مكملة لهدف مرناً، كل التحقيق يجري مترافق لجزيء فلوري واحد. وبدلاً من ذلك، فمن الممكن إرفاق علامات مضيئة للتحقيقات، كما هو موضح في مكان آخر^5،16.

1. تحقيقات سمفيش التصميم باستخدام خوارزمية¹⁶ "مصمم التحقيق" وضعتها راج أرجون (van أووديناردين مختبر معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا)؛ تسلسل المسابر سمفيش المستخدمة في هذه المخطوطة المذكورة في الجدول للمواد.
   ملاحظة: الحد الأدنى لعدد من تحقيقات في مجموعة لإشارة قابلة للاكتشاف هو ~ 30. قد تختلف العدد الدقيق وفقا للجين موضع الاهتمام، خاصة إذا كان يتم قياس نصوص قصيرة جداً.
2. اختر صبغة تناسب الإعداد الضوئية (انظر الجدول للمواد).
   ملاحظة: صبغة Cy3 أو صبغ ما يعادل بصريا مع قابلية منخفضة لتبييض الصورة ينصح بشدة. هو مرشح للتسمية المزدوجة Cy5 أو أي ما يعادل بصريا صبغ (انظر الجدول للمواد). الأصباغ مناسبة لتصوير العاصفة من مرناً المسمى تتميز بقدرتها على دورات متعددة من الانبعاثات الأسفار. يمكن استخدام بعض الأصباغ سمفيش لتصوير العاصفة (انظر الجدول للمواد). الصورة في النصوص اثنين (أو أكثر) المقابلة لجينات مختلفة في نفس الخلية، واحدة ينبغي اختيار المسابر اليغنوكليوتيد مترافق بالأصباغ الأطياف التي قد تداخل قليلاً أو لا.

2-كاشف إعداد

ملاحظة: من المهم الاحتفاظ بعينات مجانية رناسي باستخدام خالية رناسي المواد الاستهلاكية مثل نصائح ماصة المصفاة وأنابيب، والحفاظ على أي بيئة عمل نظيفة. لتفادي تدهور النصوص المستهدفة، يجب أن تكون جميع الكواشف المستخدمة بعد تثبيت الخلية خالية من نوكلاس (انظر الجدول للمواد) أو ديثيلبيروكاربوناتي (ديبك)-معاملة وتعقيمها.

1. المخازن المؤقتة سمفيش
   1. تعد خالية من رناسي 1 x برنامج تلفزيوني (الفوسفات مخزنة المالحة، الحل مع تركيز 0.01 متر عازلة فوسفات وتركيز كلوريد الصوديوم 0.154 م، (الرقم الهيدروجيني 7.4)). تمييع خالية رناسي 10 x برنامج تلفزيوني (انظر الجدول للمواد) في خالية من نوكلياسي والمياه (انظر الجدول للمواد) في 01:10 نسبة v/v.
      1. بدلاً من ذلك إعداد معاملة ديبك 1 × برنامج تلفزيوني.
   2. تعد خالية من رناسي 2 x SSC (سترات الصوديوم المالحة المخزن المؤقت، وكلوريد الصوديوم م 0.3 في 0.03 م سترات الصوديوم، (pH 7.0)). تمييع خالية رناسي 20 x SSC (انظر الجدول للمواد) في المياه خالية من نوكلياسي في 01:10 نسبة v/v.
      1. بدلاً من ذلك، إعداد 2 تعامل ديبك x SSC.
2. اليغنوكليوتيد المسبار حل الأسهم.
   1. إعادة حل الخليط مسبار اليغنوكليوتيد المجففة في 200 ميليلتر من المخزن المؤقت الشركة المصرية للاتصالات (10 مم تريس-HCl، 1 مم يدتا، pH 8.0) لإنشاء مخزون مسبار من 25 ميكرومتر. مزيج جيد من قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً، وثم دوامة وأجهزة الطرد المركزي بإيجاز.
   2. لتجنب تجميد وذوبان الأنبوب الحل الأسهم، جعل مختبرين عدة الحل الأسهم، المقابلة للمبلغ المتوقع لاستخدامه في تشغيل تجريبي واحد. تخزين في حل الأسهم في-20 درجة مئوية أو أقل وحماية من الضوء.
      ملاحظة: يمكن أن توفر مجموعة مسبار نمول 5 ردود فعل التهجين يصل إلى 250.
3. المخزن المؤقت التهجين (عقب سكينر et al. ⁷ ):
   1. إضافة 5 مل نوكلاس خالية من الماء إلى أنبوب 50 مل البوليبروبيلين مخروطية الشكل السفلي. أضف 1 غرام كبريتات ديكستران للماء وحله قبل فورتيكسينج قوية. خلط المحتويات في شاكر مداري حتى تختفي فقاعات (~ 30 دقيقة).
   2. إضافة إلى ميليلتر الحل 3,530 من منزوع ميثلامين، 10 ملغ من كولاي الحمض الريبي النووي النقال، 1 مل 20 × التعاون بين بلدان الجنوب، 100 ميليلتر من مجمع ريبونوكليوسيدي فاناديل 200 ملم وميليلتر 40 50 ملغم/مل جيش صرب البوسنة. يصل الحجم النهائي إلى 10 مل بإضافة ديبك معاملة المياه أو المياه خالية من نوكلياسي، ودوامه الحل حتى أنها متجانسة.
      ملاحظة: لتجنب التجميد والذوبان من الحل، جعل مختبرين عدة الحل الأسهم، المقابلة للمبلغ المتوقع لاستخدامه في تشغيل تجريبي واحد. مخزن الحل الأسهم عند-20 درجة مئوية. تأكد من السماح ميثلامين الحارة إلى درجة حرارة الغرفة قبل فتح الزجاجة. للحد من الخلفية، ويقترح لمعايرة تركيز ميثلامين الأمثل (نسبة 10-40% v/v).
      تنبيه: تحذير! ميثلامين شديدة السمية وتناسليا معروفة. تجنب ملامسة العينين أو الجلد أو الاستنشاق أو الابتلاع. التعامل مع ذلك تحت غطاء دخان أثناء ارتداء معطف مختبر وقفازات واقية.
   3. تعقيم الحل بتمريره من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. تبقى في مختبرين وتخزينها في-20 درجة مئوية إلى سنة واحدة.
4. إعداد التثبيت المخزن المؤقت (4.6% فورمالدهايد في برنامج تلفزيوني 1 x) عن طريق إضافة 37% فورمالدهيد (v/v) إلى برنامج تلفزيوني 1 x (انظر 2.1.1) v/v نسبة 1:8 ودوامه.
   تنبيه: تحذير! الفورمالديهايد شديدة السمية ومسرطنة معروفة. التعامل مع ذلك تحت غطاء دخان أثناء ارتداء معطف مختبر وقفازات واقية.
5. إعداد المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي سمفيش (ميثلامين 20% في 2 x SSC) عن طريق إضافة ميثلامين منزوع إلى 2 x SSC (انظر 2.1.2) v/v نسبة 1:4 ودوامه.
6. إعداد المخزن المؤقت للتصوير سمفيش بإضافة 5 مم سيستيميني والأكسجين الزبالين (7 ميكرومتر الجلوكوز أوكسيديز، 56 نانومتر الكاتالاز، والجلوكوز 10% (w/v)) لغسل المخزن المؤقت (ميثلامين 20% في 2 x SSC)
7. المخازن المؤقتة للعاصفة
   1. إعداد المخزن المؤقت A عن طريق إضافة HCl تريس 50 و 10 ملم كلوريد الصوديوم إلى المياه خالية من نوكلاس.
      ملاحظة: مخزن في RT لسنوات.
   2. إعداد "المخزن المؤقت ب" بإضافة 50 مم تريس-HCl، 10 مم كلوريد الصوديوم، و 10% w/v الجلوكوز للمياه خالية من نوكلاس.
      ملاحظة: مخزن في 4 درجات مئوية لتصل إلى سنة.
   3. إعداد المخزن المؤقت لاتفاق بيئي متعدد الأطراف بحل سيستيميني 77 mg في 1 مل من المخزن المؤقت A (يجعل حل م 1).
      ملاحظة: يمكن تخزينه في 4 درجات مئوية لمدة شهر واحد.
   4. إعداد المخزن المؤقت جلوكسي بإضافة (وحدات التعسفي) الاتحاد الأفريقي 8,440 الجلوكوز أوكسيديز والمخزن المؤقت 70,200 كاتالاز الاتحاد الأفريقي لمل 1 ألف
      ملاحظة: يجعل 50 س الحل الأسهم، يمكن تخزينه في 4 درجات مئوية لمدة شهر واحد.
   5. إعداد المخزن المؤقت للتصوير للعاصفة بإضافة 50 مم من المخزن المؤقت لشركة طيران الشرق الأوسط و 1 × جلوكسي المخزن المؤقت إلى المخزن المؤقت ب
      ملاحظة: المخزن المؤقت تصوير للعاصفة تتكون من 5 مم سيستيميني والأكسجين الزبالين (أوكسيديز الجلوكوز ميكرومتر 7 و 56 نانومتر كتالاز) في 50 ملم تريس مع 10 ملم كلوريد الصوديوم والجلوكوز 10 ٪ على درجة الحموضة 8.0. التحضير قبل التصوير، ويمكن تخزينها والمستخدمة في RT لحوالي 2 ح.

3-نموذج التثبيت

1. تنمو الخلايا البكتيرية (مثلاً، هاء

القولونية MG1655) في وسائط النمو خيار (مثلاً، المتوسطة رطل) بين عشية وضحاها عنان شاكر المداري في 260 لفة في الدقيقة و 37 درجة مئوية.
ملاحظة: لتحديد الخلفية بسبب الربط غير محددة التحقيقات، القياسات في سلالة تم حذف الجينات للاهتمام الذي ينبغي أن تجري، اتباع نفس الإجراءات (انظر Δجالك في الشكل 1 و Δسودب في الشكل 2).

تمييع 1: 100 الثقافة بين عشية وضحاها في متوسطة جديدة وقياس كثافته الضوئية (OD₆₀₀) في جهاز المطياف الضوئي كل ح ~ 1، ما يصل إلى قيمة 0.2-0.4؛ ثقافة مل 4 ينبغي أن يكون كافياً.
ملاحظة: إذا لم يكن لديه المجهر المختارة التباين المرحلة أو قدرات التدخل التفاضلية على النقيض، يمكن المسمى كولاي الأغشية الخارجي مع 2 ميكرومتر محبتين علامة نيون (انظر الجدول للمواد)، التي ينبغي أن تضاف إلى تعليق 20 دقيقة قبل التثبيت¹⁷من البكتيريا. إنجاز التثبيت وتلقى المزيد من العلاج كما هو موضح أدناه. ويجب الحرص على اختيار علامة نيون وجود طيف انبعاث مختلفة، للتقليل من التداخل الطيفي مع مجموعة مسبار المسمى.

خلايا بيليه بالطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 4,500 ز في 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية من جميع الأنابيب.

أضف 1 مل من 1 x برنامج تلفزيوني لكل أنبوبة وريسوسبيند بيليه للتقليل من خلية إلى التجميع. قم بإضافة 4 مل من المخزن المؤقت للتثبيت ودوامه بلطف.

احتضان عينات في شاكر مداري 260 لفة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في 24 درجة مئوية.

خلايا بيليه بالطرد المركزي ل 10 دقيقة، 1,000 ز، 4 درجة مئوية. إزالة المادة طافية. إضافة مل 1 1 x برنامج تلفزيوني.

نقل تعليق إلى أنابيب صغيرة-أجهزة الطرد المركزي 1.8 مخروطية الشكل السفلي ميليلتر (انظر الجدول للمواد) وكرر الخطوة 3، 6 مرتين.

4-نموذج بيرميبيليزيشن

1. إزالة المادة طافية بعناية فائقة. استخدام الماصات صغيرة الحجم، إذا لزم الأمر، لإزالة جميع السائل خارج بيليه.
2. ريسوسبيند في 300 ميليلتر ديبك معاملة المياه أو المياه خالية من نوكلاس. إضافة درجة عالية ميليلتر 350 الإيثانول المطلق (99 ٪) وتخلط بلطف بعكس الأنبوب. إضافة آخر ميليلتر 350 الإيثانول والمزيج مرة أخرى، للوصول إلى تركيز إيثانول نهائي من 70% (نسبة v/v).
   تنبيه: تحذير! الإيثانول قابل للاشتعال.
3. تدوير العينة مع المدورة أنبوبة 20 لفة في الدقيقة ح 1 في درجة حرارة الغرفة (RT)، أو عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. قد يتم تخزين العينات عند 4 درجة مئوية إلى أسبوع واحد.

5-التهجين

1. خلايا بيليه بالطرد المركزي لدقيقة 7، 750 س ز، 4 درجة مئوية. إزالة المادة طافية.
2. أضف 1 مل 20% يغسل المخزن المؤقت للعينات وترك مكانة لعدة دقائق، أو ماصة لإذابة بيليه تماما.
3. خلايا بيليه بالطرد المركزي لمدة دقيقة 7، في س 750 ز، 4 درجة مئوية.
4. إزالة المادة طافية بلطف جداً من بيبيتينج. استخدام الماصات صغيرة الحجم إذا لزم الأمر لإزالة جميع السائل خارج بيليه.
5. إضافة تعيين المسبار اليغنوكليوتيد حل الأسهم إلى قاسمة المخزن المؤقت التهجين حيث يكون تركيز اليغنوكليوتيد النهائي 250 نانومتر؛ الدوامة بقوة.
   ملاحظة: واحد تسمية مرناس مستهدفة مختلفة اثنين أو أكثر في وقت واحد في نفس الخلية. إضافة مجموعات التحقيق من كلا الهدفين إلى المخزن المؤقت التهجين. ويجب الحرص على اختيار الأصباغ بعد مختلف أطياف الانبعاث للتقليل من التداخل الطيفي (مثلاً، Cy3 و Cy5). تأكد من أن العينات المقصود لتصوير العاصفة هي تهجين مع مسبار اليغنوكليوتيد تعيين مترافق مع صبغة مناسبة للعاصفة (مثلاً، في الجدول للمواد).
6. تعليق عينات (راجع الخطوة 5، 4) في 50 المخزن المؤقت التهجين ميليلتر يحتوي على مجسات اليغنوكليوتيد، مع تجنب توليد فقاعات (الحل لزج تماما).
7. ترك عينات بين عشية وضحاها في كتلة ساخنة في 30 درجة مئوية في الظلام.
   ملاحظة: بعد هذا، عينات قد تكون مخزنة لمدة تصل إلى 6 أشهر في 4 درجات مئوية.

6-الغسل

1. استخدام أنبوب ميكروسينتريفوجي جديد واحد لكل عينة للصورة. أضف 1 مل أغسل المخزن المؤقت.
2. إضافة 10-15 ميليلتر من العينات المهجن إلى الأنبوب الجديد الذي يحتوي على المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي، ومزيج/دوامة.
3. خلايا بيليه بالطرد المركزي لمدة 7 دقائق، 750 غ س في 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية.
   ملاحظة: للحد من الخلفية، احتضانها ح 1 في 30 درجة مئوية.
4. تغسل مرتين أكثر (ريسوسبيند في 1 مل أغسل المخزن المؤقت والطرد المركزي وإزالة بيليه).
5. ريسوسبيند في 25 ميليلتر يغسل العازلة.
   ملاحظة: بغية الحد من تبييض الصورة واحد إضافة إلى المخزن المؤقت يغسل أكسجين مسح النظام (2.6) لتحسين الاستقرار صبغ في صف واحد-جزيء تجارب⁶.

7-إعداد العينات للتصوير

ملاحظة: الخلايا بحاجة إلى أن تكون معطلة من أجل السماح بتصوير السليم تحت مجهر الأسفار وعلى النقيض للمرحلة. يمكن استخدام الأساليب التالية لإعداد العينات التي يمكن تصويرها عرض لحقول مختلفة في مختلف الطائرات المحورية.

1. إعداد [اغروس] هلام
   1. إضافة 150 ملغ [اغروس] إلى 10 مل 2 x SSC المخزن المؤقت. لا تقم بإضافة 2 x SSC على [اغروس]، وأﻻ فإنها سوف لا تذوب بشكل صحيح.
   2. الموجات الدقيقة عن 10-15 ثانية كل مرة حتى تبدأ فقاعات كبيرة في النموذج. جانبا لتبرد لبضع دقائق.
   3. ضع إطار سيليكون فصل على الشريحة حتى يظل مركز الشريحة المكشوفة.
   4. ضع حلقة جامدة على مستوى (1-2 مم) 10 ملم في وسط الشريحة وإيداع كمية صغيرة من هلام، للختم. انتظر لبضع دقائق لأنها تتصلب.
   5. إضافة هلام أكثر حتى يتم تشكيل شكل قبة عالية. انتظر 10 دقائق لذلك تصلب، وإزالة الطوق (باستخدام الملقط غرامة أو أي طريقة أخرى).
   6. إيداع ~ 10 ميكروليتر من غسلها الخلايا البكتيرية (انظر 6.5) على جل وختم مع شريحة ساترة #0.
2. إعداد نموذج الدائرة سمفيش
   1. وبدلاً من ذلك (في الخطوة 7، 1) إعداد العينات للتصوير بشل حركة الخلايا البكتيرية غسلها (انظر 6.5) على الزجاج بولي-د-يسين-المغلفة أسفل المتاح أطباق بيتري البلاستيك.
   2. احتضان هذه العينات في الظلام، في درجة حرارة الغرفة، بين عشية وضحاها قبل التصور للسماح لالتصاق الخلايا إلى السطح. قبل التصور يغسل مرة واحدة مع المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي (-5)؛ الاحتفاظ بالعينة رطبة مع الغسيل buffer(2.5) أو تصوير المخزن المؤقت لسمفيش (2.6).
3. إعداد نموذج الدائرة للعاصفة
   1. إعداد العينات للعاصفة للتصوير على الزجاج بولي-د-يسين-المغلفة أسفل المتاح أطباق بيتري البلاستيك.
   2. احتضان هذه العينات في الظلام، في الرايت، بين عشية وضحاها. قبل التصور يغسل مرة واحدة مع المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي سمفيش (2.5)؛ وإضافة المخزن المؤقت للتصوير للعاصفة (2.7.5).

8.التصور نسخة

1. صورة الخلايا مع مجهر الأسفار واسع المجال مجهزة بمرحلة إليه (انظر الجدول للمواد).
   ملاحظة: لتعديل العاصفة، واستخدام الخلايا المسماة مع صبغة قادرة على دورات متعددة من الانبعاثات الأسفار. صورة العينة باستخدام نظام التصوير 3D القرار العظمى (مثلاً، انظر الجدول للمواد).
2. استخدام (مستحسن) 60-100 × N.A > النفط 1.3 الغمر مرحلة التباين الهدف العدسة مع مصدر ضوء قوي، مثل الزئبق أو مصباح هاليد معدني؛ ويوصي أيضا مصادر الضوء على أساس الصمام.
3. استخدام معيار تبريد كاميرا CCD، الأمثل من الناحية المثالية للتصوير الإضاءة المنخفضة المستوى بدلاً من السرعة (نستخدم كاميرا بحجم بكسل ميكرومتر 16) (انظر الجدول للمواد).
   ملاحظة: الاستخدام من امككد تبريد (إلكترون ضرب الجهاز المسؤول إلى جانب) كاميرا CCD كاميرا ضروري للحد من الضوضاء الحرارية الذي يمنع كشفها، لا سيما من جزيئات مفردة.
4. استخدام عامل تصفية مجموعات مناسبة فلوروفوريس اختياره.
5. لتحديد بشكل صحيح حدود الخلية, الحصول على صور عرض لحقول مختلفة في كل عينة مع مرحلة التباين البصريات، أو بوصفها فلوريسسينتلي غشاء الخلية الخارجي. الحصول على الصور في مختلف الطائرات المحورية (z-المكدس) لجميع القنوات (عادة ما تكون مفصولة شرائح 13 250 نانومتر وتؤخذ).
   ملاحظة: ينبغي أن تسيطر مرحلة يجهز المجهر ومجموعات التصفية عليها التجارية (انظر الجدول للمواد) أو البرامج الداخلية التي يمكن التقاط كومة من الصور في تسلسل.

9-بيانات التحليل

1. تحويل رصات الصور بشكل ملائم لتحليل البيانات.
2. تقدير عدد نسخ الهدف مرناً من مجموع شدة الفلورسنت البؤر في الخلية بدلاً من عد منفصلة 'البقع' كما هو الحال في غيرها من البروتوكولات المتوفرة حاليا.
3. القيام بتحليل الصور مع برمجيات المصدر المفتوح¹⁸ أو مع برنامج المواصفات. للاطلاع على تفاصيل تصوير البيانات والتحليل انظر سكينر et al. ⁷

النتائج

قمنا بتنفيذ قياسات سمفيش النصوص جالك وسودب في الخلايا كولاي . تم تهجين النصوص مع مجموعة من تسلسل معين مكملة لتسلسل المستهدفة، كل التحقيق يجري مترافق لجزيء فلوري واحد (انظر الجدول للمواد). الأسفار والمرحلة على النقيض من الصور من MG1655 البرية من نوع سلالة كولاي (WT) أ?...

Discussion

وقد قمنا بقياس في المختبر عدد نسخة من جينات مختلفة في الخلايا كولاي باستخدام الأسلوب سمفيش². باختصار، هذا الإجراء يتكون من الخطوات التالية: تثبيت الخلية، permeabilization الأغشية للسماح لاختراق التحقيق، التحقيق في التهجين، وعينه التصوير باستخدام مجهر الأسفار قياسية. ويستند هذ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextran sulfate sodium salt	Sigma-Aldrich	D8906
Pure Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute	Mallinckrodt Baker - Avantor	8025.25
Diethylpyrocarbonate (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758
RNase-free 20X SSC	Life Technologies/Ambion	AM9763
RNase-free 10X PBS	Life Technologies/Ambion	AM9625
TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) BioUltra, for molecular biology	Sigma-Aldrich	93283
nuclease-free water	Thermo Fisher Scientific	10977035
Formaldehyde solution for molecular biology, 36.5-38% in water	Sigma-Aldrich	F8775
Deionized formamide, nuclease free	Thermo Fisher Scientific/Ambion	AM9342
E. coli tRNA (ribonucleic acid, transfer type xx from escherichia)	Sigma-Aldrich	R1753-500UN
UltraPure BSA (50mg/ml)	Thermo Fisher Scientific/Ambion	AM2616
Vanadyl-ribonucleoside complex,VRC, 200 mM	New England Biolab	S1402S
Poly-L-Lysine	Sigma	P4707
Cysteamine and oxygen	Sigma-Aldrich	30070
Glucose Oxidase from Aspergillus niger, Type VII, 50KU	Sigma-Aldrich	G2133
Catalase	Sigma-Aldrich	C40
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270
D-fucose	Sigma-Aldrich	F8150
Vybrant DiO Cell-Labeling Solution	Life Technologies	V2286
Agarose,low melting reagent	Sigma-Aldrich	A9414
Adhesive silicone isolator 24-2mm Dia. X 1.8 mm depth JTR24R-A2-2.0	Grace Bio-Labs	JTR24R-A2-2.0 666208
poly-D-lysine-coated glass bottom Glass Bottom Culture Dishes	MatTek Corporation	P35GC-1.5-14-C
Super life nitrile powder free examination gloves	Supermax	TC-N-9889
Brand sterilization incubator tape	Sigma-Aldrich	BR61750
Microcentrifuge tubes (1.8 ml)	Axygen - Corning Life Sciences	MCT-175C
Falcon round-bottom polypropylene tubes (14 ml)	BD Biosciences	352059
Conical-bottom centrifuge polypropylene tubes (50 ml)	Corning	430828
Serological pipettes (Corning 5 ml)	Corning Life Sciences	4051
Serological pipettes (Corning 10 ml)	Corning Life Sciences	4488
Serological pipettes (Corning 25 ml)	Corning Life Sciences	4251
Spectrophotometer cuvettes	Sarstedt	67.742
RNase-free pipette tips 0.2 - 20 μl	FroggaBio	FT20
RNase-free pipette tips 10 - 200 μl	Axigene/corning	TF-200
RNase-free pipette tips 100 - 1000 μl	FroggaBio	FT1000
RNase-free pipette tips 100 - 1000 μl	Sorenson	14200
Syringe disposile 10 mL needle G-21	Becton Dickinson, Biosciences	BD-309643
Minisart 0.2 um Syringe Filter	Sartorius	16534 K
Nikon instruments microscope type A immersion oil A, 8cc	Nikon	MXA20233
Microscope slides 76 x26, 3"x1"x1mm	Thermo Fisher Scientific	421-004ET
#0 coverslip slide 24x60	Thermo Fisher Scientific/Menzel	BNBB024060A0
Orbital shaker	M.R.C	TOU-50
Hot block	M.R.C
Vortex	Fried Electric Company	G-560-E
Microcentrifuge	Eppendorf	5427R
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Portable Pipet-Aid XP2, Pipette Controller	Drummond Scientific Company	4-000-501-I
OD600 Spectrophotometer for Bacterial Growth Rates DiluPhotometer	Midsci	OD600-10
iXon X3 EMCCD camera	Andor	DU-897E-CS0-#BV
Eclipse Ti microscope	Nikon	MEA53100
CFI plan apochromat DM 100X oil objective lambda PH-3 N.A 1.45 WD 0.13	Nikon	MRD31905
Filter set (TRITC/CY3): EX - ET545/30X; EM - ET620/60M; BS - T570LP	Nikon	49005
Filter set (CY5): EX - ET640/30X; EM - ET690/50M; BS - T660P	Nikon	49009
Nis-elements AR auto reaserch software	Nikon	MQS31000
STORM microscope	Vutara	SR-200
NA 1.2 water immersion objective	Olympus
SRX image acquisition and analysis software	Vutara
Evolve 512 EMCCD camera	Photometrics
Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with CAL Fluor® Red 590 Dye	Biosearch Technologies Inc	SMF-1083-5
Probe Sequence for galK mRNA:
gtgttttttctttcagactc
tagccaaatgcgttggcaaa
ctgaatggtgtgagtggcag
caccaatcaaattcacgcgg
acgaaaccgtcgttgtagtc
tgataatcaatcgcgcaggg
gtggtgcacaactgatcacg
acgcgaactttacggtcatc
gctgattttcataatcggct
gcatcgagggaaaactcgtc
gttttcatgtgcgacaatgg
cacgccacgaacgtagttag
ttacgcagttgcagatgttt
tccagtgaagcggaagaact
tgctgcaatacggttccgac
gtccagcggcagatgataaa
tgaccgttaagcgcgatttg
agcctacaaactggttttct
gcggaaattagctgatccat
aaggcatgatctttcttgcc
cagtgagcggcaatcgatca
tgggcatggaaactgctttg
gatgatgacgacagccacac
gggtacgtttgaagttactg
gtgttgtattcgctgccaac
ggtttcgcactgttcacgac
tggctgctggaagaaacgcg
ttcaatggtgacatcacgca
catgcgcaacagcgttgaac
ggcgttttcagtcagtatat
atacgtttcaggtcgccttg
tgagactccgccatcaactc
gaaatcatcgcgcatagagg
caatttgcggcacggtgatt
ttgacgatttctaccagagt
acctttgtcgccaatcacag
ggatcagcgcgacgatacag
atattgttcagcgacagctt
gtctctttaatacctgtttt
ctccttgtgatggtttacaa
Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with Quaser Fluor® Red 670 Dye	Biosearch Technologies Inc	SMF-1083-5
Probe Sequence for sodB mRNA:
gtgttttttctttcagactc
tagccaaatgcgttggcaaa
ctgaatggtgtgagtggcag
caccaatcaaattcacgcgg
acgaaaccgtcgttgtagtc
tgataatcaatcgcgcaggg
gtggtgcacaactgatcacg
acgcgaactttacggtcatc
gctgattttcataatcggct
gcatcgagggaaaactcgtc
gttttcatgtgcgacaatgg
cacgccacgaacgtagttag
ttacgcagttgcagatgttt
tccagtgaagcggaagaact
tgctgcaatacggttccgac
gtccagcggcagatgataaa
tgaccgttaagcgcgatttg
agcctacaaactggttttct
gcggaaattagctgatccat
aaggcatgatctttcttgcc
cagtgagcggcaatcgatca
tgggcatggaaactgctttg
gatgatgacgacagccacac
gggtacgtttgaagttactg
gtgttgtattcgctgccaac
ggtttcgcactgttcacgac
tggctgctggaagaaacgcg
ttcaatggtgacatcacgca
catgcgcaacagcgttgaac
ggcgttttcagtcagtatat
atacgtttcaggtcgccttg
tgagactccgccatcaactc
gaaatcatcgcgcatagagg
caatttgcggcacggtgatt
ttgacgatttctaccagagt
acctttgtcgccaatcacag
ggatcagcgcgacgatacag
atattgttcagcgacagctt
gtctctttaatacctgtttt
ctccttgtgatggtttacaa