Methode zur Kennzeichnung Transkripte in einzelnen Escherichia coli Zellen für Einzelmolekül-Fluoreszenz In Situ Hybridisierung Experimente

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt ein Verfahren zur Kennzeichnung einzelner Boten-RNA (mRNA) Abschriften mit Fluoreszent-markierten DNA-Sonden für den Einsatz in Einzelmolekül-Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (SmFISH) Experimente in E. Coli. SmFISH ist eine Visualisierungsmethode, die erlaubt die simultane Detektion, Lokalisierung und Quantifizierung der einzelnen mRNA-Moleküle in festen Einzelzellen.

Zusammenfassung

Eine Methode wird zur Kennzeichnung einzelner Boten-RNA (mRNA) Transkripte in festen Bakterien für den Einsatz in Einzelmolekül-Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (SmFISH) Experimente in E. Colibeschrieben. SmFISH ermöglicht die Messung von Zelle zu Zelle Variabilität mRNA Kopie Zahl der Gene von Interesse, sowie die subzelluläre Lage der Transkripte. Die wichtigsten Schritte sind Fixierung der Bakterienzelle Kultur, Permeabilisierung von Zellmembranen und Hybridisierung der Ziel-Abschriften mit Sätzen von im Handel erhältlichen kurzen Eindringmittel beschriftet Oligonukleotid Sonden. SmFISH können die Bildgebung der Abschriften von mehreren Genen in der gleichen Zelle mit Beschränkungen durch die spektrale Überlappung zwischen verschiedenen fluoreszierenden Marker. Nach Abschluss des Protokolls unten dargestellt können Zellen leicht unter Verwendung eines Mikroskops, gekoppelt mit einer Kamera geeignet für niedrigen Fluoreszenz abgebildet werden. Diese Bilder, zusammen mit der Zelle Konturen aus Segmentierung der Phase Kontrast Frames oder dem Zellmembran beflecken, erlauben die Berechnung der mRNA Kopie Nummer Verteilung einer Stichprobe von Zellen unter Verwendung von Open-Source oder individuell geschriebenen Software. Die hier beschriebene Kennzeichnung Methode kann auch auf Bild-Protokolle mit stochastischen optische Rekonstruktion Mikroskopie (Sturm) angewendet werden.

Einleitung

SCND ist ein grundlegender und unvermeidbare Aspekt der Genexpression und gibt Anlass zu Zellezelle Heterogenität¹, sowohl auf der Ebene der Transkripte und Proteine,^2,3. Quantifizierung der Variabilität zwischen den Zellen unter genau definierten Bedingungen bietet ein einzigartiges Fenster in die grundlegenden Prozesse, die Genexpression und seine Verordnung zugrunde liegen. Eine wichtige Quelle von Zell-Zell-Heterogenität in Bakterien erfolgt auf transkriptioneller Ebene. Transkript Zahlen variieren nicht nur durch SCND der Transkription, aber auch posttranskriptionale Prozesse wie Verordnung durch kleine RNAs und RNAases². Eine Möglichkeit der direkten Zugriff auf diese Heterogenität quantitativ ist durch das Eindringmittel markieren einzelner Protokolle eines bestimmten Gens in SmFISH. Diese Methodik ermöglicht die Erkennung und subzelluläre Lokalisierung von bestimmten RNA-Moleküle in fix, einzelne bakterielle Zellen⁴. mRNAs sind mit einer Reihe von Eindringmittel beschriftet ~ 20 Basis-lange Oligonukleotide hybridisiert, die entworfen sind, um selektiv binden, Abschriften von Interesse^5,6. Erkennung über Hintergrundfluoreszenz gewährleistet mehrere Kennzeichnung und einzelner mRNA-Moleküle erscheinen als Beugung begrenzte Flecken unter einem Fluoreszenz-Mikroskop⁷ (Siehe Abbildung 1). Es gibt weitere Ansätze für die Kennzeichnung von mRNA-Moleküle, in denen die ergänzenden Oligomer-Sonden konjugierte Haptens (z.B., Biotin oder Digoxigenin) tragen, die mit sekundären Eindringmittel beschriftet Reporter Techniken⁸erkannt werden.

Es gibt andere Methoden, die quantitative Informationen über Transkripte, neben SmFISH. Einige, wie die Northern blot oder quantitative PCR, Sonde die Masse und damit weder die Anzahl der Kopien der mRNA noch ihre Position in den einzelnen Zellen messen können. Diese Methoden eignen sich daher nicht zur Quantifizierung von Zelle zu Zelle Variabilität. Eine aktuelle Image-basierte Technik, die erlaubt die Quantifizierung der Kopienzahl des RNAs in den Zellen sowie deren intrazelluläre Ort namens gemultiplext Fehler-robuste Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (MERFISHS) wurde entwickelt. MERFISHS basiert auf der Zuordnung der einen eindeutigen Barcode, bestehend aus einer definierten Kombination aus einer festen Anzahl von Eindringmittel-markierten Oligonukleotid Sonden. Diese Barcodes werden in sequentiellen runden SmFISH Messungen ausgelesen, mit Immunofluoreszenz Runde nach jedem der Hybridisierung, dadurch Erhöhung des Durchsatzes um zwei Größenordnungen^9,10. Diese Technik erfordert eine automatisierte Fluid handling System und die richtige Gestaltung der eingestellten Sonde.

Die Kombination von mehreren Fluoreszenz Kennzeichnung der einzelnen Transkripte, zusammen mit neuartigen Höchstauflösung Techniken wie stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie (Sturm)¹¹, ermöglicht eine zehnfache Erhöhung der Auflösung in der subzelluläre Lokalisation der Transkripte. Im Sturm kann eine geeignete Kombination von fluoreszierenden Sonden und bildgebenden Puffer für mehrere Zyklen der Fluoreszenzemission pro Sondenmolekül (blinkend). Sturm kann auch verwendet werden, Bild E. Coli Transkriptoms und Genom-weite räumliche Organisation der RNA, indem Sie gleichzeitig alle Transkripte von Interesse¹²beschriften zu beobachten.

Die einzelligen Methoden überprüft oben basieren auf imaging-Transkripte in festen Zellen. Daher bieten sie keine Informationen bezüglich der kinetischen Eigenschaften der Transkripte in den Zellen. Transkripte in lebenden Zellen¹³folgen, können die mRNAs durch die Fusion des Gens von Interesse auf ein Array von Bindungsstellen beschriftet werden. Letztere werden dann durch eine RNA-bindende Protein, wie den Bakteriophagen MS2 Hüllprotein, die zu einem fluoreszierenden Protein wie das grün fluoreszierende Protein (GFP)^10,14,15verschmolzen ist erkannt.

Hier beschreiben wir eine Methode zur Kennzeichnung einzelner mRNAs mit einer Reihe von Eindringmittel-markierten DNA-Sonden für SmFISH Experimente, insbesondere in E. Coli. Darüber hinaus zeigen wir, dass die gleiche Kennzeichnung Schema für Sturm Messungen mit geringfügigen Modifikationen verwendet werden kann.

Protokoll

1. Probe Design

Hinweis: Dieses Protokoll verwendet handelsübliche Oligonukleotid Sonden bereits mit dem Stichwort Fluorophore. Die Sonden bestehen aus einer Reihe von spezifischen Sequenzen komplementär zu einem Ziel mRNA, jede Sonde, fluoreszierendes Molekül konjugiert wird. Alternativ ist es möglich, Sonden, fluoreszierenden Marker beimessen, wie an anderer Stelle beschrieben,^5,16.

1. Design SmFISH Sonden mit Hilfe der Sonde Designer¹⁶ Algorithmus entwickelt von Arjun Raj (van Oudenaarden Lab, Massachusetts Institute of Technology); Sequenzen von SmFISH Sonden verwendet in dieser Handschrift sind in der Tabelle der Materialien aufgeführt.
   Hinweis: Die minimale Anzahl von Proben in einem Satz für ein nachweisbares Signal ist ~ 30. Die genaue Anzahl variieren je nach das gen des Interesses, insbesondere dann, wenn sehr kurze Transkripte gemessen werden.
2. Wählen Sie einen Farbstoff, der der optische Aufbau passt (siehe Tabelle der Materialien).
   Hinweis: Der Cy3 Farbstoff oder ein optisch gleichwertig Farbstoff mit einer geringen Anfälligkeit für Foto-bleaching wird dringend empfohlen. Ein Kandidat für die doppelte Beschriftung ist Cy5 oder ein optisch entspricht (siehe Tabelle der Materialien) zu färben. Geeigneter Farbstoffe für Sturm Bildgebung der beschrifteten mRNA zeichnen sich durch ihre Kapazität für mehrere Zyklen der Fluoreszenzemission. Einige SmFISH Farbstoffe können verwendet werden für die Sturm-Bildgebung (siehe Tabelle der Materialien). Um zwei (oder mehr) Abschriften verschiedener Gene in der gleichen Zelle entsprechend Bild, sollte man Oligonukleotid Sonden konjugiert, Farbstoffe, deren Spektren wenig oder gar keine Überlappung haben, wählen.

2. Reagenz Vorbereitung

Hinweis: Es ist wichtig, die RNAse-freie Proben zu halten mit RNase-freie Verbrauchsmaterialien wie gefilterte Pipettenspitzen und Röhren und jede Arbeitsumgebung sauber zu halten. Zur Vermeidung von Abbau der Ziel-Transkripte müssen alle Reagenzien nach Zelle Fixierung Nuklease-frei sein (siehe Tabelle der Materialien) oder Diethylpyrocarbonate (DEPC)-behandelt und sterilisiert.

1. Puffer für smFISH
   1. RNase-freie 1 X PBS (Phosphat gepufferte Kochsalzlösung, Lösung mit einem Phosphat-Puffer-Konzentration von 0,01 M und eine Natrium-Chlorid-Konzentration von 0,154 M, (pH-Wert 7,4)) vorzubereiten. RNase-freie 10 X PBS verdünnen (siehe Tabelle der Materialien) in Nuklease-freie Wasser (siehe Tabelle der Materialien), bei einem 01:10 V/V-Verhältnis.
      1. Alternativ bereiten DEPC-behandeltem 1 x PBS.
   2. Bereiten Sie RNase-freie 2 X SSC (Kochsalzlösung Natriumcitrat Puffer, 0,3 M NaCl in 0,03 M Natriumcitrat (pH 7,0)). Verdünnen Sie RNase-freie 20 X SSC (siehe Tabelle der Materialien) in Nuklease-freies Wasser bei einem 01:10 V/V-Verhältnis.
      1. Alternativ bereiten DEPC-behandeltem 2 X SSC.
2. Oligonukleotid-Sonde-Stammlösung.
   1. Wieder lösen sich die getrockneten Oligonukleotid Sonde Mischung in 200 µL TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) erstelle ich einen Sonde bestand von 25 µM. Mix gut durch Pipettieren rauf und runter und dann Wirbel und Zentrifuge kurz.
   2. Einfrieren und Auftauen der Stammlösung Röhre damit nicht, mehrere Aliquote der Vorratslösung, entsprechend dem Betrag voraussichtlich in einem einzigen experimentellen laufen verwendet werden. Die Stammlösung bei-20 ° C oder darunter lagern und vor Licht schützen.
      Hinweis: Eine Sonde 5 Nmol können bis zu 250 Hybridisierung Reaktionen bereitstellen.
3. Hybridisierung Puffer (nach Skinner Et al. ( ⁷ ):
   1. Eine 50 mL Polypropylen konischen Boden Tube 5 mL Nuklease-freies Wasser hinzufügen. 1 g Dextran Sulfat, das Wasser und durch kräftig aufschütteln auflösen. Mischen Sie den Inhalt in einem Orbitalschüttler, bis Bläschen verschwinden (~ 30 min).
   2. Fügen Sie zu der Lösung 3.530 µL deionisiertes Formamid, 10 mg von E. Coli tRNA, 1 mL 20 x SSC, 100 µL 200 mM Vanadyl-Ribonucleoside komplex und 40 µL von 50 mg/mL BSA. Bringen Sie dem Endvolumen bis 10 mL durch Zugabe von DEPC-behandeltem Wasser oder Nuklease-freies Wasser und Wirbel die Lösung bis sie homogen ist.
      Hinweis: Zur Vermeidung von Einfrieren und Auftauen der Lösung stellen Sie mehrere Aliquote der Vorratslösung, entsprechend dem Betrag voraussichtlich in einem einzigen experimentellen laufen verwendet werden. Speichern der Stammlösung bei-20 ° C. Achten Sie darauf, die warme Raumtemperatur Formamid lassen vor dem Öffnen der Flaschenhals. Um den Hintergrund zu reduzieren, wird empfohlen, um die optimale Formamid-Konzentration (10-40 % V/V-Verhältnis) zu kalibrieren.
      Vorsicht: WARNUNG! Formamid ist hochgiftig und bekannten Teratogen. Vermeiden Sie den Kontakt mit Augen oder Haut, Einatmen oder Verschlucken. Behandeln Sie es unter einem Abzug während des Tragens ein Laborkittel und Schutzhandschuhe.
   3. Sterilisieren Sie die Lösung, indem man es durch einen 0,22-µm-Filter. Halten Sie in Aliquote und bei-20 ° C bis zu einem Jahr speichern.
4. Fixierung-Puffer (4,6 % Formaldehyd in 1 X PBS) durch Zugabe von Formaldehyd 37 % (V/V), 1 X PBS vorzubereiten (siehe 2.1.1) zu einem 1:8 V/V-Verhältnis und Wirbel.
   ACHTUNG: WARNUNG! Formaldehyd ist hochgiftig und ein bekanntes Karzinogen. Behandeln Sie es unter einem Abzug während des Tragens ein Laborkittel und Schutzhandschuhe.
5. SmFISH Waschpuffer vorbereiten (20 % Formamid in 2 X SSC) durch Zugabe von entionisiertem Formamid, 2 X SSC (siehe 2.1.2) eine 1:4 V/V-Verhältnis und Wirbel.
6. SmFISH imaging Puffer vorbereiten, durch Zugabe von 5 mM Cysteamin und Sauerstoff Radikalfänger (7 µM Glukose-Oxidase, 56 nM Katalase und 10 % Glukose (w/V)) Puffer zu waschen (20 % Formamid in 2 X SSC)
7. Puffer für Sturm
   1. Bereiten Sie Puffer A Nuklease-freies Wasser 50 mM Tris-HCl und 10 mM NaCl hinzufügen.
      Hinweis: Shop bei RT seit Jahren.
   2. Bereiten Sie Puffer B durch Zugabe von 50 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl und 10 % w/V Glukose Nuklease-freies Wasser.
      Hinweis: Shop bei 4 ° C bis zu einem Jahr.
   3. Bereiten Sie MEA-Puffer durch Auflösen von Cysteamin 77 mg in 1 mL Puffer A (macht eine 1 M Lösung vor).
      Hinweis: Es kann bei 4 ° C für 1 Monat gespeichert werden.
   4. Gloxy Puffer durch Zugabe von 8.440 AU (willkürliche Einheiten) Glukose-Oxidase vorzubereiten und 70.200 AU Katalase zu 1 mL Puffer A.
      Hinweis: Macht 50 x-Stammlösung, es kann 1 Monat bei 4 ° C gelagert werden.
   5. Bereiten Sie imaging Puffer für Sturm durch Zugabe von 50 mM von MEA Puffer und 1 x Gloxy Puffer an Puffer B.
      Hinweis: Der bildgebende Puffer für Sturm besteht aus 5 mM Cysteamin Sauerstofffänger (7 µM-Glukose-Oxidase und 56 nM Katalase) in 50 mM Tris mit 10 mM NaCl und Glukose 10 % bei pH 8,0. Bereiten Sie kurz vor Bildgebung, gespeichert und für ca. 2 h bei RT verwendet werden können.

3. Probe Fixierung

1. Wachsen Sie (z.B. E. Bakterienzellen

coli MG1655) im Wachstumsmedium der Wahl (z.B. LB-Medium) über Nacht Inan Orbitalschüttler 260 u/min und 37 ° C.
Hinweis: Um den Hintergrund aufgrund der unspezifischen Bindung der Sonden zu bestimmen, sollten Messungen in einem Stamm, in dem das gen des Interesses gelöscht wurde, durchgeführt werden nach den gleichen Verfahren (siehe ΔGalk in Abbildung 1 und ΔSodB in, ( Abbildung 2).

Verdünnen Sie die Nacht Kultur 1: 100 in frisches Medium und messen die optische Dichte (OD₆₀₀) in einem Spektrophotometer jeweils ~ 1 h bis zu einem Wert von 0,2 - 0,4; 4 mL Kultur sollte ausreichend sein.
Hinweis: Wenn die gewählte Mikroskop keine Phasenkontrast oder differential Interferenz Kontrast Fähigkeiten aufweist, E. Coli äußeren Membranen können beschriftet werden mit 2 μM lipophilen fluoreszierenden Marker (siehe Tabelle der Materialien), die sollte hinzugefügt werden, um die Bakteriensuspension 20 min vor der Fixierung¹⁷. Fixierung und weitere Behandlung erfolgt wie unten beschrieben. Darauf muss geachtet werden, wählen einen fluoreszierenden Marker haben eine unterschiedliche Emissionsspektrum der spektrale Überlappung mit dem Satz mit der Bezeichnung Sonde zu minimieren.

Pellet-Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 4.500 g bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand aus allen Rohren.

Jedes Rohr 1 mL 1 X PBS hinzu und aufzuwirbeln Sie das Pellet zur Minimierung von Zelle zu Zelle Aggregation. Dann fügen Sie 4 mL Fixierung Puffer und Wirbel sanft.

Inkubieren Sie Proben in einem Orbitalschüttler bei 260 u/min für 30 min bei 24 ° C.

Pellet-Zellen durch Zentrifugation für 10 min, 1.000 g, 4 ° C. Entfernen Sie überstand. Fügen Sie 1 mL 1 X PBS.

Übertragen Sie Suspensionen auf 1,8 µL konischen Boden Mikro-Zentrifuge Rohre (siehe Tabelle der Materialien), und wiederholen Sie Schritt 3.6 zweimal.

4. Probe Permeabilisierung

1. Entfernen Sie überstand vorsichtig. Verwenden Sie kleinvolumige Pipetten, falls erforderlich, um die Flüssigkeit außerhalb der Pellets zu entfernen.
2. In 300 µL DEPC-behandeltem Wasser oder Nuklease-freies Wasser Aufschwemmen. Fügen Sie 350 µL hochwertige absoluten Ethanol (99 %) und durch invertieren das Rohr mischen Sie vorsichtig. Fügen Sie eine weitere 350 µL Ethanol und Mischung wieder, um eine endgültige Ethanolkonzentration von 70 % (V/V-Verhältnis) zu erreichen.
   ACHTUNG: WARNUNG! Ethanol ist leicht entflammbar.
3. Drehen Sie die Probe mit einem Rohr-Rotator bei 20 u/min für 1 h bei Raumtemperatur (RT), oder über Nacht bei 4 ° C. Proben können bis zu einer Woche bei 4 ° C gelagert werden.

(5) Hybridisierung

1. Pellet-Zellen durch Zentrifugation für 750 X g, 7 min, 4 ° C. Entfernen Sie überstand.
2. Fügen Sie 1 mL 20 % Puffer, um die Proben zu waschen und lassen stehen für mehrere Minuten oder Pipette das Pellet vollständig auflösen.
3. Pellet-Zellen durch Zentrifugation für 7 min. 750 X g, 4 ° C.
4. Entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren sehr vorsichtig. Verwenden Sie kleinvolumigen Pipetten, wenn notwendig, die Flüssigkeit außerhalb der Pellets zu entfernen.
5. Fügen Sie die Oligonukleotid-Sonde Stammlösung auf die Hybridisierung Puffer aliquoten so einstellen, dass die endgültige Oligonukleotid-Konzentration 250 beträgt nM; Vortex kräftig.
   Hinweis: Man kann zwei oder mehr unterschiedliche Zielgruppen mRNAs gleichzeitig in derselben Zelle beschriften. Die Hybridisierung Puffer Sonde Sätze der beiden Ziele hinzufügen. Vorsicht ist geboten, Farbstoffe mit unterschiedlichen Emissionsspektren zur Minimierung der spektralen Überlappung (z.B., Cy3 und Cy5) zu wählen. Stellen Sie sicher, dass Proben für den Sturm Bildgebung mit ein set für Sturm (z.B.in Tabelle Materialien) mit einem geeigneten Farbstoff konjugierte Oligonukleotid-Sonde hybridisiert sind.
6. Aussetzen Sie Proben (siehe Punkt 5.4) in 50 µL-Hybridisierung-Puffer, enthält die Oligonukleotid Sonden unter Vermeidung der Generation Blasen (die Lösung ist ziemlich viskos).
7. Lassen Sie Proben über Nacht auf einem heißen Block bei 30 ° C im Dunkeln.
   Hinweis: Im Anschluss daran können Proben für bis zu 6 Monate bei 4 ° c gelagert werden

6. Waschen

1. Verwenden Sie eine neue Microcentrifuge Schlauch für jede Probe Bild. Fügen Sie 1 mL Waschpuffer.
2. Die neue Röhre, die Waschpuffer und Mix/Wirbel enthält, fügen Sie 10-15 µL aus der hybridisierten Proben hinzu.
3. Pellet-Zellen durch Zentrifugation für 7 min., 750 X g bei 4 ° C. Entfernen Sie überstand.
   Hinweis: Um Hintergrund zu verringern, Inkubation für 1 h bei 30 ° C.
4. Waschen zweimal mehr (in 1 mL Waschpuffer aufzuwirbeln, Zentrifugieren und Pellet zu entfernen).
5. In 25 µL Waschpuffer aufzuwirbeln.
   Hinweis: Um Foto-bleichen reduzieren kann die Waschpuffer einen Sauerstoff Aufräumvorgang System (2.6) zur Verbesserung der Stabilität der Farbstoff in Einzelmolekül-Fluoreszenz Experimente⁶hinzufügen.

7. Vorbereitung der Proben für die Bildgebung

Hinweis: Zellen müssen immobilisiert werden, um angemessene Bildgebung unter dem Fluoreszenz und Phasenkontrast-Mikroskop zu ermöglichen. Die folgenden Methoden können Proben vorzubereiten, in denen verschiedene Gesichtsfelder bei verschiedenen fokalen Ebenen abgebildet werden können.

1. Agarose-Gel-Vorbereitung
   1. 10 mL 2 X SSC Puffer 150 mg Agarose hinzufügen. Fügen Sie 2 X SSC, Agarose, oder aber es wird nicht richtig auflösen.
   2. Mikrowelle für 10-15 s jedes Mal bis zum großen Luftblasen zu bilden beginnen. Beiseite stellen und für ein paar Minuten abkühlen lassen.
   3. Platzieren Sie einen trennenden Silikon-Rahmen auf der Folie, so dass das Dia Center ausgesetzt bleibt.
   4. Platzieren Sie eine 10 mm Breite (1-2 mm dick) starren Ring in der Mitte der Folie und hinterlegen Sie eine kleine Menge des Gels, zur Abdichtung zu. Warten Sie ein paar Minuten aushärten lassen.
   5. Fügen Sie mehr Gel, bis eine hohe Kuppel-Form gebildet wird. Warten Sie 10 Minuten dafür zu verhärten, und entfernen Sie den Ring (mit feinen Pinzette oder einer anderen Methode).
   6. Hinterlegen Sie ~ 10 μL der gewaschenen Bakterienzellen (siehe 6.5) auf das Gel und die Dichtung mit einer #0 Deckglas Folie.
2. Kammer-Probenvorbereitung für die smFISH
   1. Alternativ (zum Schritt 7.1) Proben für die Bildgebung durch Immobilisierung der gewaschenen Bakterienzellen (siehe 6.5) auf Poly-D-Lysin-beschichtete Glas unten Einweg Kunststoff Petrischalen vorbereiten.
   2. Inkubieren Sie die Proben im Dunkeln bei Raumtemperatur über Nacht vor Visualisierung Adhäsion der Zellen an der Oberfläche zu ermöglichen. Vor Visualisierung einmal waschen mit Waschpuffer (. 5); halten Sie die Probe nass mit buffer(2.5) oder Bildgebung Waschpuffer für SmFISH (2.6).
3. Kammer-Probenvorbereitung für Sturm
   1. Proben für die Bildgebung auf Poly-D-Lysin-beschichtete Glas unten Einweg Kunststoff Petrischalen für Sturm vorbereiten.
   2. Inkubieren Sie die Proben in der Dunkelheit, bei RT, über Nacht. Vor dem Visualisierung Waschen einmal mit Waschpuffer für SmFISH (2,5); und bildgebenden Puffer für Sturm (2.7.5) hinzufügen.

8.Transkript-Visualisierung

1. Bild-Zellen mit einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop mit einer motorisierten Bühne ausgestattet (siehe Tabelle der Materialien).
   Hinweis: Verwenden Sie für Sturm Modifikation, Zellen mit einem Farbstoff in der Lage, mehrere Zyklen der Fluoreszenzemission beschriftet. Bild der Probe mittels 3D Super-Resolution imaging-System (z.B., siehe Tabelle der Materialien).
2. Einsatz (empfohlen) ein 60-100 x N.A > 1.3 Öl eintauchen Phase Kontrast Objektiv mit einer starken Lichtquelle, z. B. Quecksilber oder Metalldampflampen Lampe; LED-basierte Lichtquellen sind ebenfalls empfehlenswert.
3. Verwendung eine Norm CCD-Kamera, ideal für Low-Light Level Bildgebung statt Geschwindigkeit gekühlte (wir verwenden eine Kamera mit 16 µm Pixelgröße) optimiert (siehe Tabelle der Materialien).
   Hinweis: Die Verwendung von einem gekühlten EMCCD (Elektron Multiplikation Ladegerät gekoppelt) Kamera CCD Kamera ist notwendig, thermisches Rauschen zu reduzieren, die Erkennung, insbesondere von einzelnen Molekülen verhindert.
4. Filter verwenden setzt für die Fluorophore gewählt.
5. Um Zellengrenzen richtig zu bestimmen, Abrufen von Bildern von verschiedenen Gesichtsfelder in jeder Probe mit Phase Kontrast-Optik oder durch Kennzeichnung Eindringmittel der äußeren Zellmembran. Abrufen von Bildern zu verschiedenen fokalen Ebenen (Z-Stack) für alle Kanäle (in der Regel 13 Scheiben getrennt von 250 nm stammen).
   Hinweis: Sollte der motorisierte Teil das Mikroskop und die Filtersätze von kommerziellen gesteuert werden (siehe Tabelle der Materialien) oder interne Software, die einen Stapel Bilder nacheinander erfasst werden kann.

9. die Datenanalyse

1. Konvertieren Sie die Bild-Stacks in ein geeignetes Format für die Datenanalyse.
2. Schätzen Sie die Kopienzahl des Ziels mRNA aus die Gesamtintensität der fluoreszierenden Brennpunkte in der Zelle und nicht aus diskrete "Flecken" wie in anderen derzeit verfügbaren Protokolle zu zählen.
3. Bildanalyse mit Open-Source-Software¹⁸ oder mit einem maßgeschneiderten Programm durchführen. Zur Datensicherung und Analyse siehe Skinner Et al. ⁷

Ergebnisse

Wir durchgeführt, SmFISH Messungen der GalK und SodB Transkripte in E. Coli Zellen. Die Transkripte wurden mit einer Reihe von spezifischen Sequenzen ergänzen die Zielsequenz, jede Sonde wird konjugiert, fluoreszierendes Molekül hybridisiert (siehe Tabelle der Materialien). Fluoreszenz und Phase Kontrast Bilder von Wildtyp-MG1655 E. Coli -Stamm (WT) oder eine JW0740 (Keio Sammlung)¹⁹ GalK gelöscht Belastung (ΔGalK) ausgesetzt waren, ...

Diskussion

Wir haben in unserem Labor die Abschrift Anzahl verschiedener Gene in E. Coli Zellen mittels der SmFISH Methode²gemessen. Kurz gesagt, dieses Verfahren besteht aus den folgenden Schritten: Zelle Fixierung, Permeabilisierung der Membranen für Sonde eindringen ermöglichen Sonde Hybridisierung und Bildgebung mit einem standard Fluoreszenzmikroskop zu probieren. Dieses Verfahren beruht auf früher veröffentlichte, mit einigen Modifikationen^6,

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextran sulfate sodium salt	Sigma-Aldrich	D8906
Pure Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute	Mallinckrodt Baker - Avantor	8025.25
Diethylpyrocarbonate (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758
RNase-free 20X SSC	Life Technologies/Ambion	AM9763
RNase-free 10X PBS	Life Technologies/Ambion	AM9625
TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) BioUltra, for molecular biology	Sigma-Aldrich	93283
nuclease-free water	Thermo Fisher Scientific	10977035
Formaldehyde solution for molecular biology, 36.5-38% in water	Sigma-Aldrich	F8775
Deionized formamide, nuclease free	Thermo Fisher Scientific/Ambion	AM9342
E. coli tRNA (ribonucleic acid, transfer type xx from escherichia)	Sigma-Aldrich	R1753-500UN
UltraPure BSA (50mg/ml)	Thermo Fisher Scientific/Ambion	AM2616
Vanadyl-ribonucleoside complex,VRC, 200 mM	New England Biolab	S1402S
Poly-L-Lysine	Sigma	P4707
Cysteamine and oxygen	Sigma-Aldrich	30070
Glucose Oxidase from Aspergillus niger, Type VII, 50KU	Sigma-Aldrich	G2133
Catalase	Sigma-Aldrich	C40
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270
D-fucose	Sigma-Aldrich	F8150
Vybrant DiO Cell-Labeling Solution	Life Technologies	V2286
Agarose,low melting reagent	Sigma-Aldrich	A9414
Adhesive silicone isolator 24-2mm Dia. X 1.8 mm depth JTR24R-A2-2.0	Grace Bio-Labs	JTR24R-A2-2.0 666208
poly-D-lysine-coated glass bottom Glass Bottom Culture Dishes	MatTek Corporation	P35GC-1.5-14-C
Super life nitrile powder free examination gloves	Supermax	TC-N-9889
Brand sterilization incubator tape	Sigma-Aldrich	BR61750
Microcentrifuge tubes (1.8 ml)	Axygen - Corning Life Sciences	MCT-175C
Falcon round-bottom polypropylene tubes (14 ml)	BD Biosciences	352059
Conical-bottom centrifuge polypropylene tubes (50 ml)	Corning	430828
Serological pipettes (Corning 5 ml)	Corning Life Sciences	4051
Serological pipettes (Corning 10 ml)	Corning Life Sciences	4488
Serological pipettes (Corning 25 ml)	Corning Life Sciences	4251
Spectrophotometer cuvettes	Sarstedt	67.742
RNase-free pipette tips 0.2 - 20 μl	FroggaBio	FT20
RNase-free pipette tips 10 - 200 μl	Axigene/corning	TF-200
RNase-free pipette tips 100 - 1000 μl	FroggaBio	FT1000
RNase-free pipette tips 100 - 1000 μl	Sorenson	14200
Syringe disposile 10 mL needle G-21	Becton Dickinson, Biosciences	BD-309643
Minisart 0.2 um Syringe Filter	Sartorius	16534 K
Nikon instruments microscope type A immersion oil A, 8cc	Nikon	MXA20233
Microscope slides 76 x26, 3"x1"x1mm	Thermo Fisher Scientific	421-004ET
#0 coverslip slide 24x60	Thermo Fisher Scientific/Menzel	BNBB024060A0
Orbital shaker	M.R.C	TOU-50
Hot block	M.R.C
Vortex	Fried Electric Company	G-560-E
Microcentrifuge	Eppendorf	5427R
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Portable Pipet-Aid XP2, Pipette Controller	Drummond Scientific Company	4-000-501-I
OD600 Spectrophotometer for Bacterial Growth Rates DiluPhotometer	Midsci	OD600-10
iXon X3 EMCCD camera	Andor	DU-897E-CS0-#BV
Eclipse Ti microscope	Nikon	MEA53100
CFI plan apochromat DM 100X oil objective lambda PH-3 N.A 1.45 WD 0.13	Nikon	MRD31905
Filter set (TRITC/CY3): EX - ET545/30X; EM - ET620/60M; BS - T570LP	Nikon	49005
Filter set (CY5): EX - ET640/30X; EM - ET690/50M; BS - T660P	Nikon	49009
Nis-elements AR auto reaserch software	Nikon	MQS31000
STORM microscope	Vutara	SR-200
NA 1.2 water immersion objective	Olympus
SRX image acquisition and analysis software	Vutara
Evolve 512 EMCCD camera	Photometrics
Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with CAL Fluor® Red 590 Dye	Biosearch Technologies Inc	SMF-1083-5
Probe Sequence for galK mRNA:
gtgttttttctttcagactc
tagccaaatgcgttggcaaa
ctgaatggtgtgagtggcag
caccaatcaaattcacgcgg
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gtctctttaatacctgtttt
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Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with Quaser Fluor® Red 670 Dye	Biosearch Technologies Inc	SMF-1083-5
Probe Sequence for sodB mRNA:
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