Metodo per l'etichettatura di trascrizioni in cellule individuali Escherichia coli per singola molecola di fluorescenza In Situ gli esperimenti di ibridazione

Riepilogo

Questo manoscritto descrive un metodo per l'etichettatura individuale RNA messaggero (mRNA) trascrizioni con sonde di DNA fluorescente etichettati, per l'uso in singola molecola fluorescenza in situ (smFISH) gli esperimenti di ibridazione in Escherichia coli. smFISH è un metodo di visualizzazione che permette la rilevazione simultanea, la localizzazione e quantificazione delle singole molecole di mRNA in singole celle fisse.

Abstract

Un metodo è descritto per l'etichettatura individuale RNA messaggero (mRNA) trascrizioni nei batteri fissi per l'utilizzo in singola molecola fluorescenza in situ (smFISH) gli esperimenti di ibridazione in Escherichia coli. smFISH permette la misura della cellula--cellula variabilità nel numero di copie di mRNA di geni di interesse, come pure la posizione subcellulare delle trascrizioni. I passi principali coinvolti sono fissazione di coltura delle cellule batteriche, la permeabilizzazione delle membrane cellulari e l'ibridazione delle trascrizioni destinazione con set di sonde del oligonucleotide fluorescente-etichetta breve disponibile in commercio. smFISH può consentire l'imaging delle trascrizioni di geni multipli nella stessa cella, con limitazioni imposte dalla sovrapposizione spettrale tra diversi marcatori fluorescenti. Dopo il completamento del protocollo illustrato di seguito, le cellule possono essere imaged prontamente usando un microscopio accoppiato con una macchina fotografica adatta a bassa intensità di fluorescenza. Queste immagini, insieme ai contorni delle cellule ottenute dalla segmentazione dei telai di contrasto di fase, o dalla colorazione della membrana cellulare, permettono il calcolo della distribuzione numerica mRNA copia di un campione di cellule utilizzando software open-source o personalizzato. Il metodo d'etichettatura descritto qui può essere applicato anche alle trascrizioni di immagine con microscopia di ricostruzione ottica stocastica (tempesta).

Introduzione

Stocasticità è un aspetto fondamentale e inevitabile dell'espressione genica e dà luogo a cellula-cellula eterogeneità¹, sia a livello di trascrizioni e proteine^2,3. Quantificare la variabilità fra le cellule in condizioni ben definite offre una finestra unica i processi di base che sottendono l'espressione genica e sua regolazione. Una fonte importante di eterogeneità cellulare nei batteri avviene al livello trascrizionale. I numeri di trascrizione variano non solo dovuto la variabilità stocastica della trascrizione, ma anche ai processi post-trascrizionali come regolamento da piccolo RNAs e RNAases². Un modo per accedere direttamente a questa eterogeneità in modo quantitativo è da fluorescente tagging trascrizioni individuale di un dato gene in smFISH. Questa metodologia consente il rilevamento e la localizzazione subcellulare di particolari molecole di RNA in fisso, singole cellule batteriche⁴. mRNAs sono ibridati con un insieme dei oligonucleotides base-lungo di ~ 20 fluorescente contrassegnati che sono progettato per legarsi selettivamente alle trascrizioni di interesse^5,6. Etichettatura più assicura la rilevazione sopra fluorescenza di fondo, e singole molecole di mRNA appaiono come macchie di diffrazione limitata sotto un microscopio di fluorescenza⁷ (vedere Figura 1). Ci sono altri approcci per l'etichettatura di molecole di mRNA, in cui le sonde complementari oligomero trasportano apteni coniugati (ad es., biotina o digossigenina) che vengono rilevati utilizzando reporter fluorescente-etichetta secondaria tecniche⁸.

Ci sono altri metodi che forniscono informazioni quantitative sulla trascrizioni, oltre a smFISH. Alcuni, come la Northern blot o PCR quantitativa, la maggior parte della sonda e quindi in grado di misurare il numero di copie di mRNA né loro posizione in singole celle. Di conseguenza questi metodi non sono adatti per quantificare la variabilità della cellula--cellula. Una recente tecnica basata su immagine che permette per la quantificazione di sia il numero di copie di RNA all'interno delle cellule, nonché la loro posizione intracellulare, chiamato multiplexed errore-robusto fluorescenza in situ di ibridazione (MERFISH) è stata sviluppata. MERFISH è basato sull'assegnazione di un codice a barre univoco composto da una combinazione definita da un numero fisso di sonde del oligonucleotide fluorescente etichettati. Questi codici a barre vengono lette in turni sequenziale delle misure smFISH, con photobleaching dopo ogni turno di ibridazione, aumentando la velocità effettiva di due ordini di grandezza^9,10. Questa tecnica richiede un fluidi automatizzato sistema e la corretta progettazione del set di sonda.

La combinazione di più fluorescenza etichettatura delle trascrizioni individuali, insieme alle tecniche di Super-risoluzione romanzo come stocastico ricostruzione ottica microscopia (tempesta)¹¹, permette un aumento di dieci volte nella risoluzione nella localizzazione subcellulare delle trascrizioni. In tempesta, una combinazione adatta di sonde fluorescenti e imaging buffer consente cicli multipli di emissione di fluorescenza per molecola sonda (lampeggiante). TEMPESTA può essere utilizzato anche per immagine il trascrittoma di e. coli e osservare il genoma organizzazione spaziale del RNA, etichettando contemporaneamente tutte le trascrizioni di interesse¹².

Tutti i metodi di cella singola recensione sopra si basano su trascrizioni in celle fisse di imaging. Quindi, non forniscono tutte le informazioni riguardanti le proprietà cinetiche di trascrizioni all'interno delle cellule. Per seguire le trascrizioni in cellule vive¹³, mRNAs possono essere contrassegnati tramite la fusione del gene di interesse in una matrice di siti di legame. Questi ultimi vengono poi riconosciuti da una RNA-proteina, quali il batteriofago MS2 proteina di cappotto, che si fonde ad una proteina fluorescente come ad esempio la proteina fluorescente verde (GFP)^10,14,15.

Qui descriviamo un metodo per l'etichettatura di singoli mRNA con un set di sonde di DNA fluorescente contrassegnate, per uso negli esperimenti di smFISH, in particolare in e. coli. Inoltre, mostriamo che lo stesso schema di etichettatura può essere utilizzato per misure di tempesta con modifiche minori.

Protocollo

1. Design della sonda

Nota: Questo protocollo utilizza sonde del oligonucleotide disponibili in commercio già contrassegnati con fluorofori. Le sonde sono costituiti da un insieme di specifiche sequenze complementari ad un target mRNA, ogni sonda viene coniugato ad una singola molecola fluorescente. In alternativa, è possibile allegare marcatori fluorescenti per sonde, come descritto altrove^5,16.

1. Sonde di smFISH di progettazione utilizzando l'algoritmo di¹⁶ sonda Designer sviluppato da Rosasco (van Oudenaarden Lab, Massachusetts Institute of Technology); sequenze di smFISH sonde utilizzate in questo manoscritto sono elencati nella tabella dei materiali.
   Nota: Il numero minimo di sonde in un set per un segnale rilevabile è ~ 30. Il numero esatto può variare secondo il gene di interesse, specialmente se molto breve trascrizioni sono misurate.
2. Scegliere un colorante che si adatta la configurazione ottica (Vedi tabella dei materiali).
   Nota: La tintura di Cy3 o un colorante otticamente equivalente con una bassa sensibilità alle foto-candeggio è altamente consigliato. È un candidato per l'etichettatura dual Cy5 o un otticamente equivalente tingere (Vedi tabella dei materiali). Coloranti adatti per l'imaging di tempesta di mRNA con etichetta sono caratterizzati dalla loro capacità di cicli multipli di emissione di fluorescenza. Alcuni coloranti smFISH possono essere utilizzati per l'imaging di tempesta (Vedi tabella dei materiali). Per due (o più) trascrizioni corrispondenti ai diversi geni nella stessa cella di immagine, uno dovrebbe scegliere sonde del oligonucleotide coniugati a coloranti cui spettri hanno poca o nessuna sovrapposizione.

2. preparazione del reagente

Nota: È importante per mantenere i campioni RNAsi-libera utilizzando RNAsi-libera di materiali di consumo quali tubi e puntali filtrata e per mantenere qualsiasi ambiente di lavoro pulito. Al fine di evitare il degrado delle trascrizioni destinazione, tutti i reagenti utilizzati a seguito di fissazione delle cellule devono essere privo di nucleasi (Vedi tabella materiali) o dietilpirocarbonato (DEPC)-trattati e sterilizzati.

1. Buffer per smFISH
   1. Preparare la RNAsi-libera 1X PBS (tamponato fosfato salino, soluzione con una concentrazione di tampone fosfato 0,01 m e una concentrazione di cloruro di sodio di 0,154 M, (pH 7.4)). Diluire la RNAsi-libera 10X PBS (Vedi tabella materiali) nucleasi-free acqua (Vedi tabella materiali) presso un 01:10 rapporto di v/v.
      1. In alternativa preparare trattata DEPC 1 x PBS.
   2. Preparare la RNAsi-libera 2 x SSC (buffer di salino-sodio citrato, 0,3 M di NaCl in citrato di sodio 0,03 M, (pH 7.0)). Diluire la RNAsi-libera 20 x SSC (Vedi tabella materiali) in acqua privo di nucleasi a un 01:10 rapporto di v/v.
      1. In alternativa, preparare 2 DEPC-trattati x SSC.
2. Soluzione madre di oligonucleotide sonda.
   1. Ri-sciogliere la miscela di sonda oligonucleotide essiccate in 200 µ l di buffer di TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) per creare uno stock di sonda di 25 µM. Mix bene di pipettaggio su e giù e poi vortex e centrifugare brevemente.
   2. Per evitare il congelamento e scongelamento del tubo soluzione di riserva, fare diverse aliquote della soluzione stock, corrispondente all'importo previsto per essere utilizzato in un singolo sperimentale eseguito. Conservare la soluzione di riserva a-20 ° C o inferiore e proteggerlo dalla luce.
      Nota: Un set di sonda di nmol 5 può fornire fino a 250 reazioni di ibridazione.
3. Tampone di ibridazione (a seguito di Skinner et al. ⁷ ):
   1. Aggiungere 5 mL di acqua privo di nucleasi a una provetta fondo conico in polipropilene da 50 mL. Aggiungere 1 g di solfato di destrano all'acqua e scioglierla nel Vortex vigorosa. Mescolare il contenuto in un agitatore orbitale fino a quando le bolle scompaiono (~ 30 min).
   2. Aggiungere la soluzione 3.530 µ l di formamide deionizzata, 10 mg di tRNA e. coli , 1 mL di 20x SSC, 100 µ l del complesso di vanadyl-ribonucleoside 200 mM e 40 µ l di 50 mg/mL BSA. Portare il volume finale di 10 mL con aggiunta di acqua trattata con DEPC o acqua priva di nucleasi e vortex la soluzione fino a quando è omogenea.
      Nota: Per evitare di congelare e scongelare della soluzione, fare diverse aliquote della soluzione stock, corrispondente all'importo previsto per essere utilizzato in un singolo sperimentale eseguito. Conservare la soluzione di riserva a-20 ° C. Assicuratevi di lasciare la formammide calda a temperatura ambiente prima di aprire la bottiglia. Per ridurre lo sfondo, è suggerito per calibrare la concentrazione ottimale formammide (rapporto di 10-40% v/v).
      Attenzione: ATTENZIONE! Formammide è altamente tossica e un noto teratogeno. Evitare il contatto con occhi o pelle, inalazione o ingestione. Gestirlo sotto cappa aspirante mentre indossa un camice da laboratorio e guanti protettivi.
   3. Sterilizzare la soluzione facendolo passare attraverso un filtro da 0,22 µm. Tenere in aliquote e conservare a-20 ° C ad un anno.
4. Preparare il tampone di fissazione (4,6% formaldeide in PBS 1X) con l'aggiunta di formaldeide al 37% (v/v) di PBS 1X (Vedi 2.1.1) a un rapporto v/v di 1:8 e vortexare.
   ATTENZIONE: AVVISO! La formaldeide è altamente tossica e un noto cancerogeno. Gestirlo sotto cappa aspirante mentre indossa un camice da laboratorio e guanti protettivi.
5. Preparare il tampone di lavaggio per smFISH (20% formammide in 2 x SSC) aggiungendo formammide deionizzata a 2 x SSC (Vedi 2.1.2) per un rapporto v/v di 1:4 e vortice.
6. Preparare il tampone di imaging per smFISH con l'aggiunta di 5 mM cisteamina e ossigeno spazzini (7 µM glucosio ossidasi, catalasi nM 56 e glucosio 10% (p/v)) per tampone di lavaggio (20% formammide in 2 x SSC)
7. Buffer per la tempesta
   1. Preparare il tampone A aggiungendo 50 mM Tris-HCl e 10 millimetri di NaCl all'acqua priva di nucleasi.
      Nota: Conservare a RT per anni.
   2. Preparare tampone B aggiungendo 50 mM Tris-HCl 10 mM NaCl e 10% p/v al glucosio di acqua priva di nucleasi.
      Nota: Conservare a 4 ° C per fino a un anno.
   3. Preparare il tampone di MEA sciogliendo cisteamina 77 mg in 1 mL di tampone A (rende una soluzione 1 M).
      Nota: Esso può essere conservato a 4 ° C per 1 mese.
   4. Preparare il tampone di Gloxy aggiungendo 8.440 ossidasi di glucosio (unità arbitrarie) AU e 70.200 catalasi AU a 1 mL tampone A.
      Nota: Rende 50 x soluzione di riserva, esso può essere conservato a 4 ° C per 1 mese.
   5. Preparare il tampone di imaging per la tempesta con l'aggiunta di 50 mM di buffer di MEA e 1x Gloxy buffer a tampone B.
      Nota: Il buffer di imaging per la tempesta è composto da 5 mM cisteamina, organismi saprofagi dell'ossigeno (56 nM della catalasi e ossidasi di glucosio 7 µM) in 50 mM Tris con 10 millimetri di NaCl e del glucosio 10% pH 8.0. Preparare appena prima di formazione immagine, possono essere archiviato ed utilizzato a temperatura ambiente per circa 2 h.

3. il campione fissazione

1. Crescere le cellule batteriche (ad es., E.

coli MG1655) in crescita media di agitatore orbitale di inan notturno di scelta (ad es., LB medium) a 260 giri e 37 ° C.
Nota: Per determinare la priorità bassa a causa del legame non specifico delle sonde, misurazioni in un ceppo in cui è stato eliminato il gene di interesse dovrebbero essere condotta, seguendo le stesse procedure (Vedi Δgalk in Figura 1 e ΔsodB in Figura 2).

Diluire il pernottamento cultura 1: 100 in mezzo fresco e misurare la densità ottica (OD₆₀₀) in uno spettrofotometro ogni ~ 1 h, fino ad un valore di 0,2 - 0,4; una cultura di 4 mL dovrebbe essere sufficiente.
Nota: Se il microscopio selezionato non dispone di contrasto di fase o capacità di contrasto differenziale di interferenza, membrane esterne di e. coli possono essere etichettate con marcatore fluorescente lipofilico di 2 μM (Vedi tabella dei materiali), che deve essere aggiunto il sospensione batterica 20 min prima fissazione¹⁷. Fissazione e ulteriore trattamento vengono eseguite come descritto di seguito. Deve prestare attenzione a scegliere un marcatore fluorescente avendo un diverso spettro di emissione, per ridurre al minimo la sovrapposizione spettrale con il set di sonda marcata con.

Pellet di cellule mediante centrifugazione per 5 min a 4.500 g a 4 ° C. Rimuovere il surnatante da tutte le provette.

Aggiungere 1 mL di 1X PBS a ciascuna provetta e risospendere il pellet per ridurre al minimo l'aggregazione di cellula--cellula. Quindi aggiungere 4 mL di buffer di fissazione e vortex delicatamente.

Incubare i campioni in un agitatore orbitale a 260 giri/min per 30 min a 24 ° C.

Pellet di cellule mediante centrifugazione per 10 min, 1.000 g, 4 ° C. Rimuovere il surnatante. Aggiungere 1 mL di PBS 1X.

Trasferire sospensioni 1,8 µ l fondo conico micro-centrifuga provette (Vedi tabella dei materiali) e ripetere il punto 3.6 due volte.

4. campione permeabilizzazione

1. Rimuovere il surnatante con molta attenzione. Utilizzo di pipette di piccolo volume, se necessario, rimuovere tutto il liquido fuori il pellet.
2. Risospendere in 300 µ l acqua trattata DEPC o nucleasi-free. Aggiungere 350 µ l alto grado etanolo assoluto (99%) e mescolare delicatamente capovolgendo la provetta. Aggiungere un altro 350 µ l di etanolo e mescolare ancora una volta, per raggiungere una concentrazione di etanolo finale del 70% (v/v rapporto).
   ATTENZIONE: AVVISO! L'etanolo è infiammabile.
3. Ruotare il campione con un rotatore tubo 20 giri/min per 1 h a temperatura ambiente (TA), o a 4 ° C durante la notte. Campioni possono essere conservati a 4 ° C fino a una settimana.

5. l'ibridazione

1. Pellet di cellule mediante centrifugazione per 7 min, 750 x g, 4 ° C. Rimuovere il surnatante.
2. Aggiungere 1 mL 20% tampone ai campioni di lavaggio e lasciare riposare per alcuni minuti, o pipetta per sciogliere completamente il pellet.
3. Pellet di cellule mediante centrifugazione per 7 min, a 750 x g, 4 ° C.
4. Rimuovere il surnatante molto dolcemente pipettando. Utilizzo di pipette di piccolo volume se necessario rimuovere tutto il liquido fuori il pellet.
5. Aggiungere la sonda oligonucleotide impostata soluzione di riserva per l'aliquota di tampone di ibridazione in modo che la concentrazione finale del oligonucleotide è 250 nM; vortice vigorosamente.
   Nota: Uno può etichettare due o più diversi target mRNAs contemporaneamente nella stessa cella. Aggiungere insiemi di sonda di entrambi gli obiettivi per il tampone di ibridazione. Deve prestare attenzione a scegliere tinture avendo diversi spettri di emissione per minimizzare la sovrapposizione spettrale (ad es., Cy3 e Cy5). Assicurarsi che i campioni destinati a formazione immagine tempesta sono ibridati con una sonda oligonucleotide impostata coniugata con un colorante adatto per STORM (ad esempio, nella tabella dei materiali).
6. Sospendere i campioni (Vedi punto 5.4) in 50 µ l di tampone di ibridazione contenente le sonde del oligonucleotide, evitando la generazione di bolle (la soluzione è abbastanza viscosa).
7. Lasciare i campioni durante la notte su un blocco di caldo a 30 ° C in buio.
   Nota: In seguito, campioni possono essere conservati fino a 6 mesi a 4 ° C.

6. lavaggio

1. Utilizzare un tubo del microcentrifuge nuovo per ogni campione di immagine. Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio.
2. Aggiungere 10-15 µ l dai campioni ibridati per il nuovo tubo contenente il tampone di lavaggio e mix/vortex.
3. Pellet di cellule di centrifugazione per 7 min, 750 x g a 4 ° C. Rimuovere il surnatante.
   Nota: Per ridurre la priorità bassa, incubare per 1 h a 30 ° C.
4. Lavare due volte più (risospendere in 1 mL di tampone di lavaggio, centrifuga e rimuovere pellet).
5. Risospendere in 25 µ l di tampone di lavaggio.
   Nota: Al fine di ridurre una foto-candeggio può aggiungere per il tampone di lavaggio un ossigeno lo scavenging sistema (2.6) per migliorare la stabilità del colorante in fluorescenza di singola molecola esperimenti⁶.

7. preparazione dei campioni per l'Imaging

Nota: Le cellule hanno bisogno per essere immobilizzato al fine di consentire la corretta formazione immagine al microscopio di fluorescenza e contrasto di fase. I seguenti metodi possono essere utilizzati per preparare campioni in cui diversi campi di vista può essere imaged in diversi piani focali.

1. Preparazione del gel dell'agarosi
   1. Aggiungere 150 mg agarosio al buffer di x SSC 10 mL 2. Non aggiungere 2 x SSC di agarosio, altrimenti non si dissolvono correttamente.
   2. Forno a microonde per 10-15 s ogni volta fino a grandi bolle iniziano a formarsi. Lasciate raffreddare per qualche minuto.
   3. Posizionare una separazione cornice in silicone sulla diapositiva in modo che centro della diapositiva rimane esposta.
   4. Posizionare un anello rigido di 10 mm wide (1-2 mm di spessore) al centro della diapositiva e depositare una piccola quantità di gel in esso, per la sigillatura. Attendere qualche minuto per esso per indurire.
   5. Aggiungere più gel fino a formare una forma a cupola alta. Aspettare 10 min per esso ad indurirsi e rimuovere l'anello (con una pinzetta bene o qualsiasi altro metodo).
   6. Cassetta di ~ 10 μL di cellule batteriche lavate (vedere 6.5) sul gel e la guarnizione con un vetrino coprioggetto #0.
2. Preparazione del campione di camera per smFISH
   1. In alternativa (al punto 7.1) preparare i campioni per l'imaging di immobilizzare le cellule batteriche lavate (vedere 6.5) su vetro rivestiti con poli-D-lisina fondo plastica petri piatti usa e getta.
   2. Incubare i campioni al buio, a temperatura ambiente, una notte prima di visualizzazione per consentire l'adesione delle cellule alla superficie. Prima visualizzazione lavare una volta con tampone di lavaggio (. 5); mantenere il campione bagnato con tampone di lavaggio di imaging o buffer(2.5) per smFISH (2,6).
3. Sezione preparazione del campione per la tempesta
   1. Preparare i campioni per tempesta per imaging su vetro rivestiti con poli-D-lisina fondo plastica petri piatti usa e getta.
   2. Incubare i campioni al buio, a RT, durante la notte. Prima del lavaggio di visualizzazione in una volta con tampone di lavaggio per smFISH (2.5); e aggiungere buffer di imaging per la tempesta (2.7.5).

8.Visualizzazione di trascrizione

1. L'immagine di cellule con un microscopio a fluorescenza largo campo attrezzato con un tavolino motorizzato (Vedi tabella dei materiali).
   Nota: Per la modifica di tempesta, utilizzare cellule marcate con un colorante capace di cicli multipli di emissione di fluorescenza. L'esempio utilizzando il sistema di imaging 3D Super-risoluzione di immagine (ad esempio, vedere la tabella dei materiali).
2. Uso (consigliato) un 60-100x Nardi > 1,3 olio immersione fase contrasto obiettivo con una forte sorgente luminosa, ad esempio un mercurio o lampada di alogenuro di metallo; Fonti di luce LED-based sono anche raccomandati.
3. Uso standard raffreddato telecamera CCD, idealmente ottimizzata per formazione immagine di livello basso-luce piuttosto che velocità (usiamo una macchina fotografica con dimensione dei pixel 16 µm) (Vedi tabella dei materiali).
   Nota: L'uso di un EMCCD raffreddata (elettrone moltiplicando dispositivo a carica accoppiata) telecamera CCD telecamera è necessario ridurre il rumore termico che impedisce il rilevamento, in particolare di singole molecole.
4. Usa filtro imposta appropriato per i fluorophores scelto.
5. Per determinare correttamente i bordi della cella, acquisire immagini di diversi campi di vista in ogni campione con ottica di contrasto di fase, o di etichettatura fluorescente membrana cellulare esterna. Acquisire immagini a diversi piani focali (z-stack) per tutti i canali (solitamente 13 fette separate da 250 nm sono presi).
   Nota: La fase motorizzata del microscopio e il set di filtri dovrebbe essere controllata da commerciali (Vedi tabella materiali) o software in-House che può catturare una pila di immagini in sequenza.

9. analisi dei dati

1. Convertire le serie di immagini in un formato adatto per l'analisi dei dati.
2. Stimare il numero di copie del target mRNA dall'intensità totale dei fuochi fluorescenti nella cella, piuttosto che dal conteggio discreti 'punti' come in altri protocolli attualmente disponibili.
3. Effettuare analisi di immagine con software open-source¹⁸ o con un programma personalizzato. Per informazioni dettagliate dei dati di imaging e l'analisi vedere Skinner et al. ⁷

Risultati

Abbiamo effettuato misurazioni smFISH delle trascrizioni galK e sodB in cellule di Escherichia coli . Le trascrizioni sono state ibridate con un set di specifiche sequenze complementari alla sequenza di destinazione, ogni sonda viene coniugato ad una singola molecola fluorescente (Vedi tabella dei materiali). Fluorescenza e fase contrasto immagini di selvaggio-tipo MG1655 ceppo di e. coli (WT) o di un ceppo di galK-eliminato JW0740 (raccolta di Keio)^19<...

Discussione

Nel nostro laboratorio abbiamo misurato il numero di trascrizione di diversi geni in cellule di Escherichia coli usando il smFISH metodo². In breve, questa procedura prevede i passaggi seguenti: fissazione delle cellule, permeabilizzazione delle membrane per consentire la penetrazione della sonda, l'ibridazione della sonda e utilizzando un microscopio a fluorescenza standard di formazione immagine di esempio. Questa procedura si basa su quelli precedentemente pubblicati con alcune modific...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextran sulfate sodium salt	Sigma-Aldrich	D8906
Pure Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute	Mallinckrodt Baker - Avantor	8025.25
Diethylpyrocarbonate (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758
RNase-free 20X SSC	Life Technologies/Ambion	AM9763
RNase-free 10X PBS	Life Technologies/Ambion	AM9625
TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) BioUltra, for molecular biology	Sigma-Aldrich	93283
nuclease-free water	Thermo Fisher Scientific	10977035
Formaldehyde solution for molecular biology, 36.5-38% in water	Sigma-Aldrich	F8775
Deionized formamide, nuclease free	Thermo Fisher Scientific/Ambion	AM9342
E. coli tRNA (ribonucleic acid, transfer type xx from escherichia)	Sigma-Aldrich	R1753-500UN
UltraPure BSA (50mg/ml)	Thermo Fisher Scientific/Ambion	AM2616
Vanadyl-ribonucleoside complex,VRC, 200 mM	New England Biolab	S1402S
Poly-L-Lysine	Sigma	P4707
Cysteamine and oxygen	Sigma-Aldrich	30070
Glucose Oxidase from Aspergillus niger, Type VII, 50KU	Sigma-Aldrich	G2133
Catalase	Sigma-Aldrich	C40
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270
D-fucose	Sigma-Aldrich	F8150
Vybrant DiO Cell-Labeling Solution	Life Technologies	V2286
Agarose,low melting reagent	Sigma-Aldrich	A9414
Adhesive silicone isolator 24-2mm Dia. X 1.8 mm depth JTR24R-A2-2.0	Grace Bio-Labs	JTR24R-A2-2.0 666208
poly-D-lysine-coated glass bottom Glass Bottom Culture Dishes	MatTek Corporation	P35GC-1.5-14-C
Super life nitrile powder free examination gloves	Supermax	TC-N-9889
Brand sterilization incubator tape	Sigma-Aldrich	BR61750
Microcentrifuge tubes (1.8 ml)	Axygen - Corning Life Sciences	MCT-175C
Falcon round-bottom polypropylene tubes (14 ml)	BD Biosciences	352059
Conical-bottom centrifuge polypropylene tubes (50 ml)	Corning	430828
Serological pipettes (Corning 5 ml)	Corning Life Sciences	4051
Serological pipettes (Corning 10 ml)	Corning Life Sciences	4488
Serological pipettes (Corning 25 ml)	Corning Life Sciences	4251
Spectrophotometer cuvettes	Sarstedt	67.742
RNase-free pipette tips 0.2 - 20 μl	FroggaBio	FT20
RNase-free pipette tips 10 - 200 μl	Axigene/corning	TF-200
RNase-free pipette tips 100 - 1000 μl	FroggaBio	FT1000
RNase-free pipette tips 100 - 1000 μl	Sorenson	14200
Syringe disposile 10 mL needle G-21	Becton Dickinson, Biosciences	BD-309643
Minisart 0.2 um Syringe Filter	Sartorius	16534 K
Nikon instruments microscope type A immersion oil A, 8cc	Nikon	MXA20233
Microscope slides 76 x26, 3"x1"x1mm	Thermo Fisher Scientific	421-004ET
#0 coverslip slide 24x60	Thermo Fisher Scientific/Menzel	BNBB024060A0
Orbital shaker	M.R.C	TOU-50
Hot block	M.R.C
Vortex	Fried Electric Company	G-560-E
Microcentrifuge	Eppendorf	5427R
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Portable Pipet-Aid XP2, Pipette Controller	Drummond Scientific Company	4-000-501-I
OD600 Spectrophotometer for Bacterial Growth Rates DiluPhotometer	Midsci	OD600-10
iXon X3 EMCCD camera	Andor	DU-897E-CS0-#BV
Eclipse Ti microscope	Nikon	MEA53100
CFI plan apochromat DM 100X oil objective lambda PH-3 N.A 1.45 WD 0.13	Nikon	MRD31905
Filter set (TRITC/CY3): EX - ET545/30X; EM - ET620/60M; BS - T570LP	Nikon	49005
Filter set (CY5): EX - ET640/30X; EM - ET690/50M; BS - T660P	Nikon	49009
Nis-elements AR auto reaserch software	Nikon	MQS31000
STORM microscope	Vutara	SR-200
NA 1.2 water immersion objective	Olympus
SRX image acquisition and analysis software	Vutara
Evolve 512 EMCCD camera	Photometrics
Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with CAL Fluor® Red 590 Dye	Biosearch Technologies Inc	SMF-1083-5
Probe Sequence for galK mRNA:
gtgttttttctttcagactc
tagccaaatgcgttggcaaa
ctgaatggtgtgagtggcag
caccaatcaaattcacgcgg
acgaaaccgtcgttgtagtc
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Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with Quaser Fluor® Red 670 Dye	Biosearch Technologies Inc	SMF-1083-5
Probe Sequence for sodB mRNA:
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