단일 분자 형광 제자리에서 교 잡 실험에 대 한 개별 대장균 세포에 성적표를 라벨에 대 한 방법

요약

이 원고 붙일 표시 된 DNA 프로브, 대장균에 있는 단일 분자 형광 제자리에서 교 잡 (smFISH) 실험에 사용 하기 위해 개별 메신저 RNA (mRNA) 성적표를 라벨에 대 한 방법을 설명 합니다. smFISH 동시 탐지, 지역화, 고 고정된 개별 셀에 단일 mRNA 분자의 정량화를 허용 하는 시각화 방법입니다.

초록

고정된 박테리아 대장균에 있는 단일 분자 형광 제자리에서 교 잡 (smFISH) 실험에 사용 하기 위해 성적 증명서 개별 메신저 RNA (mRNA)를 라벨에 대 한 방법을 설명 합니다. smFISH는 성적 증명서의 subcellular 위치 뿐 아니라 관심의 유전자의 mRNA 사본 수에 셀 다양성의 측정을 허용 한다. 주요 단계는 세균성 세포 배양의 고정, 세포 막의 permeabilization 및 상업적으로 사용 가능한 짧은 붙일 레이블 oligonucleotide 조사 세트와 함께 대상 증명서의 교 잡. smFISH는 다른 형광 마커 사이의 스펙트럼 중복에 의해 부과 된 제한 같은 셀에 여러 유전자의 성적 이미지를 허용할 수 있습니다. 아래 설명 하는 프로토콜의 완료, 다음 셀 수 있을 쉽게 몇 군데 낮은 강도의 형광을 위해 적당 한 카메라와 함께 결합 하는 현미경을 사용 하 여. 셀 윤곽선 세분화 단계 대비 프레임, 또는 세포 막 얼룩에서 함께 이러한 이미지 오픈 소스 또는 사용자 작성 소프트웨어를 사용 하 여 셀의 샘플의 mRNA 사본 숫자 분포의 계산을 허용 한다. 여기 설명 하는 표기 방법은 확률적 광학 재건 현미경 (스톰)와 성적 증명서 이미지에 적용할 수 있습니다.

서문

Stochasticity는 유전자 발현의 근본적이 고 피할 수 없는 측면 이며 셀 셀이¹, 성적 및 단백질^2,3의 수준에서 모두 증가 제공 합니다. 잘 정의 된 조건 하에서 세포 사이 가변성을 측정 독특한 창 유전자 발현 및 그것의 규칙의 기반이 되는 기본 프로세스에 제공 합니다. 셀이 박테리아에의 한 중요 한 소스는 transcriptional 수준에서 일어난다. 사본 숫자 규정 등 post-transcriptional 프로세스 뿐만 아니라 전사의 stochasticity 때문에 뿐만 아니라 작은 RNAs 및 RNAases²마다 다릅니다. 양적 패션에서이 성분에 직접 액세스 하는 한 가지 방법은 붙일 smFISH에 주어진된 유전자의 개별 성적표를 태그입니다. 이 방법론 검색 및 특정 RNA 분자의 subcellular 지 방화, 개별 박테리아 세포⁴고정 수 있습니다. mRNAs는 붙일 표시 된 관심^5,6의 성적표에 선택적으로 바인딩할 디자인 된 ~ 20 자료-긴 oligonucleotides의 세트로 때 교배. 여러 라벨 배경 형광, 위에 검출 및 개별 mRNA 분자 형광 현미경⁷ (참조 그림 1) 회절 제한 된 반점으로 나타납니다. MRNA 분자, 상호 보완적인 올리고 머 프로브 보조 붙일 레이블 기자 기법⁸을 사용 하 여 검색 된 활용된 haptens (예를 들어, biotin 또는 digoxigenin)를가지고 라벨에 대 한 다른 접근이 있다.

SmFISH 이외에 성적에 대 한 정량적 인 정보를 제공 하는 다른 방법이 있다. 북부 등 일부 오 점 또는 양이 많은 PCR 일괄 프로브 따라서 mRNA 사본의 수 없으며 개별 셀에서 그들의 위치를 측정할 수 있습니다. 따라서 이러한 방법은 셀 변화 척도를 적합 하지 않습니다. 최근 이미지 기반 기술은 모두 세포 내 RNAs의 복사본 수로 라는 그들의 세포내 위치의 정량화 다중화 오류 강력한 형광 제자리에서 교 잡 (MERFISH)에 대 한 수 있도록 개발 되었습니다. MERFISH 고정된 개수의 붙일 레이블 oligonucleotide 조사에서 정의 된 조합으로 구성 된 고유 바코드의 할당을 기반으로 합니다. 이러한 바코드는 smFISH 측정의 순차적 라운드에서 밖으로 읽힌다, photobleaching와 함께 다음 각 교 잡, 두 배나^9,10처리량 증가의. 이 기술은 시스템 및 프로브 세트의 적절 한 디자인 처리는 자동화 된 유체를 필요로 합니다.

해상도에 ten-fold 증가 있습니다 여러 형광 라벨 확률적 광학 재건 현미경 (폭풍)¹¹, 같은 소설 슈퍼 해상도 기술 함께 개별 성적표의의 subcellular 국산화 성적 증명서 폭풍, 형광 프로브 및 이미징 버퍼의 적당 한 조합 당 (깜박이) 프로브 분자 형광 방출의 여러 사이클에 대 한 수 있습니다. 폭풍은 대장균 transcriptome 이미지 및 관심¹²의 동시에 모든 성적 증명서를 라벨에 의해 RNA의 게놈 넓은 공간 조직 관찰에 사용할 수 있습니다.

위에 검토 하는 모든 단일 셀 방법 고정된 셀에 녹취 록을 이미징 기반으로 합니다. 따라서, 그들은 세포 내에서 성적 운동 속성에 관한 모든 정보를 제공 하지 않습니다. 라이브 셀¹³에서 성적에 따라, mRNAs 사이트 바인딩 배열에 관심사의 유전자의 융합에 의해 표시 수 있습니다. 이 후자는 다음에 의해 인식 같은 살 균 소 MS2 외 투 단백질, 녹색 형광 단백질 (GFP)^10,,1415등 형광 단백질을 융합 한 RNA 의무적인 단백질.

여기는 특히 대장균에 놓여있는지 표시 된 DNA 프로브, smFISH 실험에 사용 하기 위해 집합으로 개별 mRNAs를 라벨에 대 한 방법에 설명 합니다. 또한, 우리는 동일한 라벨 체계 사소한 수정 폭풍 측정을 위해 사용 될 수 있습니다 보여줍니다.

프로토콜

1. 조사 설계

참고:이 프로토콜 이미 fluorophores 태그로 상용 oligonucleotide 프로브를 사용 합니다. 프로브는 특정 시퀀스를 대상으로 보완 집합의 구성 mRNA, 단 하나 형광 성 분자를 활용 되 고 각 프로브. 또는,^5,16설명 되어 있는 대로 프로브를 형광 마커를 연결 가능 하다.

1. 디자인 smFISH 프로브 Arjun Raj (밴 Oudenaarden 연구소, 매사 추세 츠 공대);에 의해 개발 된 프로브 디자이너¹⁶ 알고리즘을 사용 하 시퀀스 smFISH 프로브이 원고에 사용 되는 재료의 테이블에 나열 됩니다.
   참고: 최소 감지 신호에 대 한 집합에 프로브 수 ~ 30입니다. 정확한 숫자는 매우 짧은 성적 측정 하는 경우에 특히 관심의 유전자에 따라 달라질 수 있습니다.
2. 광 설치에 맞는 염료를 선택 (재료의 표 참조).
   참고: Cy3 염료 또는 사진 표백 낮은 민감도와 광학 동일한 염료가 좋습니다. 듀얼 라벨에 대 한 후보는 Cy5 또는 광학 동일한 염료 (재료의 표 참조). 레이블이 지정 된 mRNA의 폭풍 이미징에 대 한 적합 한 염료 형광 방출의 여러 사이클에 대 한 그들의 능력에 의해 특징. 일부 smFISH 염료를 사용할 수 있는 스톰 이미징 (재료의 표 참조). 두 가지 (또는 그 이상) 성적표 같은 셀에 서로 다른 유전자에 해당 이미지를 하나 그 스펙트럼이 거의 없거나 전혀 없는 중복 염료를 활용 하는 oligonucleotide 프로브를 선택 해야 합니다.

2. 시 약 준비

참고: 필터링 된 피 펫 팁 등 튜브, RNase 무료 소모품을 사용 하 여 샘플 RNAse 무료를 유지 하 고 모든 작업 환경을 깨끗 하 게 유지 하는 것이 중요입니다. 대상 성적 저하를 방지 하려면 셀 고정 다음 사용 하는 모든 시 약 nuclease 무료 되어야 합니다 (재료의 표 참조) 또는 diethylpyrocarbonate (DEPC)-치료 및 살 균.

1. SmFISH에 대 한 버퍼
   1. 1 x PBS RNase 무료 (버퍼링 인산 염, 인산 염 버퍼 농도 0.01 M의와 염화 나트륨 농도 0.154 m, (pH 7.4) 솔루션)을 준비 합니다. 10 x PBS RNase 무료 희석 (재료의 표 참조) nuclease 무료 물 (재료의 표 참조)에 1시 10분 v/v 비율.
      1. DEPC 처리 1을 준비 또는 PBS x.
   2. RNase 무료 준비 2 x SSC (염 분 나트륨 구 연산 염 버퍼, 0.03 M 나트륨 시트르산, (pH 7.0)에 0.3 M NaCl). RNase 무료 희석 20 x SSC (재료의 표 참조) nuclease 무료 물 1:10 v/v 비율.
      1. DEPC 처리 2를 준비 하는 또는 x SSC.
2. Oligonucleotide 조사 재고 솔루션입니다.
   1. 다시 25 µ M. 프로브 재고를 만들려고 테 버퍼 (10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)의 200 µ L에 말린된 oligonucleotide 조사 조화 분해를 위아래로 pipetting 다음 소용돌이 그리고 짧게 원심 분리기에 의해 잘 믹스.
   2. 동결 및 재고 솔루션 튜브의 해빙을 방지 하려면 단일 실험 실행에 사용 될 것으로 예상 하는 금액을 해당 재고 솔루션의 여러 aliquots를 확인 합니다. -20 ° C에 또는 아래 재고 솔루션을 저장 하 고 빛 으로부터 보호.
      참고: 5 nmol의 프로브 세트 최대 250 교 잡 반응을 제공할 수 있습니다.
3. 교 잡 버퍼 (다음 스키 너 외. ⁷ ):
   1. 50ml 폴 리 프로필 렌 원뿔 하단 튜브를 nuclease 무료 물 5 mL를 추가 합니다. 물 1 g dextran 황산의 추가 하 고 활발 한 vortexing에 의해 해산. 거품 (~ 30 분) 사라질 때까지 궤도 셰이 커에 내용을 혼합.
   2. 20x SSC의 1 mL, 200mm vanadyl ribonucleoside 복합물의 100 µ L, 50 mg/mL BSA의 40 µ L 이온된 formamide, 대장균 tRNA의 10 mg의 솔루션 3,530 µ L를 추가 합니다. 최종 볼륨을 가져올 10 mL DEPC 처리 물 또는 nuclease 무료 물, 그리고 소용돌이의 추가 의해 솔루션 동 질 때까지.
      참고: 동결과 솔루션의 해빙을 방지 하려면 단일 실험 실행에 사용 될 것으로 예상 하는 금액을 해당 재고 솔루션의 여러 aliquots 확인 합니다. -20 ° c.에 재고 솔루션 저장 병을 열기 전에 formamide 실내 온도에 온난 하 게 해야 합니다. 백그라운드를 줄이기 위해, 그것은 최적의 formamide 농도 (10-40 %v / v 비율)을 보정 하기 위해 좋습니다.
      주의: 경고! Formamide은 매우 독성이 고 알려진된 기형 발생 물질. 눈 또는 피부, 흡입 또는 섭취와 접촉을 하지 마십시오. 연기 후드 랩 코트와 보호 장갑을 착용 하는 동안 처리 합니다.
   3. 0.22 μ m 필터를 통해 그것을 전달 하 여 솔루션을 소독. Aliquots에서 유지 하 고 1 년에-20 ° C에서 저장.
4. 1 x PBS를 37% 포름알데히드 (v/v)을 추가 하 여 고정 버퍼 (1 x PBS에 4.6% 포름알데히드) 준비 (2.1.1 참조)는 1:8 비율 v/v와 소용돌이에.
   주의: 경고! 포름알데히드는 매우 독성이 고 알려진된 발암 물질. 연기 후드 랩 코트와 보호 장갑을 착용 하는 동안 처리 합니다.
5. SmFISH 워시 버퍼 준비 (2에서 20% formamide x SSC) 2 하 이온된 formamide를 추가 하 여 x SSC (2.1.2 참조) 1:4 비율 v/v 및 소용돌이.
6. 5mm 시스테 및 산소 청소부 (7 µ M 포도 당 산화 효소, 56 nM catalase 및 10% 포도 당 (w/v)) 워시 버퍼를 추가 하 여 이미지 버퍼 smFISH에 대 한 준비 (2에서 20% formamide x SSC)
7. 폭풍에 대 한 버퍼
   1. 50 mM Tris HCl과 10 mM NaCl nuclease 무료 물에 추가 하 여 버퍼 A를 준비 합니다.
      참고: 저장소 년 RT에서.
   2. Nuclease 무료 물 포도 당 50 mM Tris HCl, 10 mM NaCl, 그리고 10 %w / v를 추가 하 여 버퍼 B을 준비 합니다.
      참고: 저장소 최대 1 년에 4 ° C에서.
   3. 77 mg 시스테 버퍼 A (은 1 M 솔루션)의 1 mL에 용 해 하 여 MEA 버퍼를 준비 합니다.
      참고: 그것은 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 1 개월.
   4. Gloxy 버퍼 8,440 AU (임의의 단위) 포도 당 산화 효소를 추가 하 여 준비 하 고 1 ml 70,200 AU catalase 버퍼 a.
      참고: 재고 솔루션 x 50은 1 개월 4 ° C에서 저장 될 수 있다.
   5. 50mm MEA 버퍼와 버퍼를 버퍼 B에 Gloxy x 1을 추가 하 여 이미지 버퍼 폭풍우를 위한 준비
      참고: 폭풍에 대 한 이미징 버퍼 5mm 시스테, 10 mm NaCl, 50 mm Tris 산소 청소부 (7 µ M 포도 당 산화 효소와 56 nM catalase) 및 10% 포도 당 pH 8.0에서 구성 됩니다. 바로 영상 전에 준비, 저장 고 약 2 시간에 대 한 RT에 사용 될 수 있습니다.

3. 샘플 고정

1. 세균성 세포 (예를들면, E. 성장

대장균 MG1655) 선택 (예를 들어, 파운드 매체) 하룻밤 inan 궤도 흔드는 260 rpm 및 37 ° c.의 성장 매체에
참고: 확인 하려면 조사의 일반적인 바인딩 인해 배경에 있는 관심사의 유전자 삭제 된 스트레인 측정 실시 해야, (Δgalk 에 그림 1 과 ΔsodB 에서 참조 하는 동일한 절차에 따라 그림 2)입니다.

신선한 매체에 하룻밤 문화 1: 100 희석 하 고 그것의 광학 밀도 (OD₆₀₀) 분 광 광도 계는 0.2-까지 모든 ~ 1 h에서 측정 0.4; 4 mL 문화 충분 해야 한다입니다.
참고: 선택한 현미경 단계 대조 또는 차동 간섭 콘트라스트 기능 없는 경우 대장균 외부 막 수 표시 2 μ M 닥터지 형광 표시와 함께 (재료의 표 참조)에 추가 해야 하는 세균 현 탁 액 고정¹⁷전에 20 분. 고정 및 추가 치료는 아래 설명 된 대로 수행 됩니다. 형광 마커 표시 프로브 세트와 스펙트럼 중복을 최소화 하기 위해 다른 방출 스펙트럼을 데 주의 해야 합니다.

4 ° c.에 4, 500 g에 5 분 동안 원심 분리 하 여 펠 릿 셀 모든 튜브에서에서 상쾌한을 제거 합니다.

각 관 1 x PBS의 1 mL을 추가 하 고 셀 셀 집계를 최소화 하기 위해 펠 렛 resuspend. 부드럽게 고정 버퍼와 소용돌이의 4 mL를 추가 합니다.

24 ° c.에 30 분 동안 260 rpm에서 궤도 통에 샘플을 품 어

10 분, 1000 g, 4 ° c.에 대 한 원심 분리 하 여 펠 릿 셀 상쾌한을 제거 합니다. 1 mL 1 x PBS를 추가 합니다.

1.8 µ L 원뿔 아래쪽 마이크로 원심 관 (재료의 표 참조)에 정지를 전송 하 고 단계 3.6를 두 번 반복 합니다.

4. 샘플 Permeabilization

1. 매우 신중 하 게 상쾌한을 제거 합니다. 작은 볼륨 펫을 사용 하 여 펠 릿 밖에 서 모든 액체를 제거 하는 데 필요한 경우.
2. 300 µ L DEPC 처리 물 또는 nuclease 무료 물 resuspend. 350 µ L 고급 절대 에탄올 (99%)를 추가 하 고 부드럽게 튜브를 거꾸로 하 여 혼합. 에탄올과 혼합 다시, 70% (v/v 비율)의 최종 에탄올 농도 도달의 또 다른 350 µ L를 추가 합니다.
   주의: 경고! 에탄올은 가연성 이다.
3. (RT), 실 온에서 1 h 20 rpm에서 튜브 회전자와 함께 샘플을 회전 또는 4 ° C에서 하룻밤. 샘플 4 ° C에서 1 주일에 저장할 수 있습니다.

5입니다. 교 잡

1. 7 분, 750 x g, 4 ° c.에 대 한 원심 분리 하 여 펠 릿 셀 상쾌한을 제거 합니다.
2. 1 mL 20% 샘플에 버퍼를 세척 하 고 두고 서 몇 분, 또는 펠 릿을 완전히 해산 피 펫에 대 한 추가 합니다.
3. 750 x g, 4 ° c.에 7 분 동안 원심 분리 하 여 펠 릿 셀
4. 매우 부드럽게 pipetting 여는 상쾌한을 제거 합니다. 작은 볼륨 펫을 사용 하 여 펠 릿 밖에 서 모든 액체를 제거 하는 데 필요한 경우.
5. Oligonucleotide 조사 최종 oligonucleotide 농도 250 교 잡 버퍼 약 수를 재고 솔루션 설정 추가 nM; 소용돌이 적극적으로.
   참고: 하나의 동일한 셀에 한 번에 두 개 이상의 다른 대상 mRNAs 레이블을 수 있습니다. 교 잡 버퍼를 두 대상의 프로브 세트를 추가 합니다. 염료 (예를 들어, Cy3와 Cy5) 스펙트럼 오버랩을 최소화 하기 위해 다른 방출 스펙트럼을가지고 선택할 수 주의 해야 합니다. 폭풍 이미징을 위한 샘플 스톰 (예를 들면, 자료의 테이블에서)에 대 한 적합 한 염료와 활용을 설정 하는 oligonucleotide 프로브 때 교배는 다는 것을 확인 하십시오.
6. 거품 (솔루션은 아주 점성)의 생성을 피하는 동안 oligonucleotide 조사를 포함 하는 50 µ L 교 잡 버퍼에 샘플 (단계 5.4 참조)를 일시 중단 합니다.
7. 어둠 속에서 30 ° C에서 뜨거운 블록에 샘플을 하룻밤 둡니다.
   참고:이 다음 샘플 저장 될 수 있습니다 4 ° c.에서 최대 6 개월까지

6입니다. 세척

1. 1 새로운 microcentrifuge 튜브를 사용 하 여 이미지에 각 샘플에 대 한. 1 mL 워시 버퍼를 추가 합니다.
2. 워시 버퍼와 혼합/소용돌이 포함 하는 새 튜브를 교배 시킨된 견본에서 10-15 µ L를 추가 합니다.
3. 7 분 동안 원심 분리, 4 ° c.에 750 x g 펠 릿 셀 상쾌한을 제거 합니다.
   참고: 배경을 줄이기 위해, 품 어 1 h 30 ° c.에 대 한
4. 두 번 더 세척 (1 mL 워시 버퍼에서 resuspend, 원심 및 펠 릿을 제거).
5. 25 µ L 워시 버퍼에 resuspend.
   참고: 사진 표백 한 줄이기 위해 추가할 수 워시 버퍼에 단일 분자 형광 실험⁶염료 안정성 향상을 위해 시스템 (2.6) 청소는 산소.

7입니다. 영상에 대 한 샘플의 준비

참고: 셀 형광 및 위상 대비 현미경 적절 한 이미징 할 수 있도록 움직일 필요가 있다. 다음 방법 다른 초점 비행기에서 보기의 다른 분야 수 군데 샘플 준비를 사용할 수 있습니다.

1. Agarose 젤 준비
   1. 10 mL 2 x SSC 버퍼에 150mg agarose를 추가 합니다. 2를 추가 하지 마십시오 x SSC agarose, 아니면 그것을 제대로 분해 되지 것입니다.
   2. 10-15 s 큰 거품 형태로 시작 될 때까지 각 시간에 대 한 전자 렌지. 몇 분 동안 냉각을 정해.
   3. 슬라이드의 센터 노출 되도록 슬라이드에 분리 실리콘 프레임을 놓습니다.
   4. 슬라이드의 중심에서 10 m m 와이드 (1-2 m m 두께) 엄밀한 반지를 놓고 씰링에, 젤의 작은 금액을 입금 합니다. 강화에 그것에 대 일 분 정도 기다립니다.
   5. 높은 돔 모양 형성 될 때까지 더 많은 젤을 추가 합니다. 강화 하 고, 그것을 위해 10 분을 기다려 하 고 (를 사용 하 여 정밀한 핀셋 또는 다른 방법) 반지를 제거.
   6. 젤에 #0 coverslip 슬라이드 인감 (6.5 참조) 씻어 세균 세포의 ~ 10 μ를 입금.
2. SmFISH에 대 한 챔버 샘플 준비
   1. 또는 (단계로 7.1) immobilizing 씻어 세균 세포 (6.5 참조) 폴 리 D-라이 신-코팅 유리 하단 일회용 플라스틱 접시에 의해 이미징에 대 한 샘플을 준비.
   2. 어둠 속에서, 실내 온도에, 하룻밤 시각화 표면에 세포의 접착을 허용 하기 전에 샘플을 품 어. 시각화 하기 전에 세척 한 번 워시 버퍼 (. 5); 예제 smFISH (2.6)에 대 한 세척 buffer(2.5) 또는 이미징 버퍼와 젖은 유지.
3. 폭풍에 대 한 챔버 샘플 준비
   1. 폴 리 D-라이 신-코팅 유리 하단 일회용 플라스틱 접시에 이미징에 대 한 폭풍에 대 한 샘플을 준비 합니다.
   2. 하룻밤에 RT, 어둠 속에서 샘플을 품 어. 워시 버퍼 smFISH (2.5);에 대 한 시각화 세척 한 번 하기 전에 고 스톰 (2.7.5)에 대 한 이미징 버퍼를 추가 합니다.

8입니다.대 본 시각화

1. 전동된 스테이지를 갖춘 넓은 필드 형광 현미경으로 세포를 이미지 (자료의 표 참조).
   참고: 폭풍 수정에 대 한 염료 형광 방출의 여러 사이클의 가능으로 표시 하는 셀을 사용 합니다. 3D 슈퍼 해상도 이미징 시스템을 사용 하 여 샘플 이미지 (예를 들어, 재료의 표 참조).
2. 사용 (권장)를 한다 x 60-100 > 1.3 기름 침수 단계 대비 목표 렌즈는 강한 광원, 수은 또는 금속 할로겐 램프; 광원 LED 기반은 또한 것이 좋습니다.
3. 사용 표준 냉각 CCD 카메라, 이상적으로 낮은 조명 수평 영상 보다는 속도 (우리 16 µ m 픽셀 크기와 카메라를 사용)에 대 한 최적화 (재료의 표 참조).
   참고: 사용 냉각된 EMCCD (전자 멀티 충전 결합 장치)의 카메라 CCD 카메라는 특히 단일 분자의 검출을 방지 하는 열 잡음을 줄이기 위해 필요 하다.
4. 사용 필터 설정 선택한 fluorophores에 적합 합니다.
5. 셀 경계를 제대로 확인 하려면 각 샘플 단계 대조 광학, 또는 라벨 붙일 외부 세포 막에서에서 보기의 다른 분야의 이미지를 취득 합니다. 모든 채널에 대 한 서로 다른 초점 평면 (z-스택)에서 이미지 (보통 13 조각 구분 기준: 250 nm 촬영).
   참고: 필터 집합 및 현미경의 전동된 스테이지 상업에 의해 제어 해야한다 (재료의 표 참조) 또는 사내 소프트웨어를 순서 대로 스택 이미지를 캡처할 수 있습니다.

9. 데이터 분석

1. 이미지 스택 데이터 분석에 대 한 적합 한 형식으로 변환 합니다.
2. 대상의 복사본 수를 추정 mRNA 아닌 셀에 형광 foci의 총 강도에서 다른 현재 사용할 수 있는 프로토콜에서 이산 '관광 명소' 세.
3. 오픈 소스 소프트웨어¹⁸ 또는 사용자 프로그램 이미지 분석을 실시 합니다. 자세한 내용은 데이터의 이미징 및 분석 참조 스키 너 외. ⁷

결과

우리는 대장균 세포에 galK 및 sodB 내용은의 smFISH 측정에 실시 한다. 녹취 록은 특정 시퀀스 단 하나 형광 성 분자를 활용 되 고 각 조사 대상 시퀀스를 보완의 세트로 때 교배 (재료의 표 참조). 형광 및 위상 대비 MG1655 야생-타입의 이미지 E. 콜라이 긴장 (WT) 또는 JW0740 (게이오 컬렉션)¹⁹ galK 삭제 긴장 (ΔgalK) 2 m m D-fucose 그...

토론

우리 smFISH 방법²를 사용 하 여 대장균 세포에 다른 유전자의 사본 수 우리의 실험실에서 측정 했습니다. 간단히,이 절차는 다음 단계로 구성 됩니다: 셀 고정, 프로브 삽입을 허용 하는 세포 막의 permeabilization 교 잡, 프로브 및 영상 표준 형광 현미경을 사용 하 여 샘플. 이 절차는 일부 수정^6,,716게시 했?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextran sulfate sodium salt	Sigma-Aldrich	D8906
Pure Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute	Mallinckrodt Baker - Avantor	8025.25
Diethylpyrocarbonate (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758
RNase-free 20X SSC	Life Technologies/Ambion	AM9763
RNase-free 10X PBS	Life Technologies/Ambion	AM9625
TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) BioUltra, for molecular biology	Sigma-Aldrich	93283
nuclease-free water	Thermo Fisher Scientific	10977035
Formaldehyde solution for molecular biology, 36.5-38% in water	Sigma-Aldrich	F8775
Deionized formamide, nuclease free	Thermo Fisher Scientific/Ambion	AM9342
E. coli tRNA (ribonucleic acid, transfer type xx from escherichia)	Sigma-Aldrich	R1753-500UN
UltraPure BSA (50mg/ml)	Thermo Fisher Scientific/Ambion	AM2616
Vanadyl-ribonucleoside complex,VRC, 200 mM	New England Biolab	S1402S
Poly-L-Lysine	Sigma	P4707
Cysteamine and oxygen	Sigma-Aldrich	30070
Glucose Oxidase from Aspergillus niger, Type VII, 50KU	Sigma-Aldrich	G2133
Catalase	Sigma-Aldrich	C40
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270
D-fucose	Sigma-Aldrich	F8150
Vybrant DiO Cell-Labeling Solution	Life Technologies	V2286
Agarose,low melting reagent	Sigma-Aldrich	A9414
Adhesive silicone isolator 24-2mm Dia. X 1.8 mm depth JTR24R-A2-2.0	Grace Bio-Labs	JTR24R-A2-2.0 666208
poly-D-lysine-coated glass bottom Glass Bottom Culture Dishes	MatTek Corporation	P35GC-1.5-14-C
Super life nitrile powder free examination gloves	Supermax	TC-N-9889
Brand sterilization incubator tape	Sigma-Aldrich	BR61750
Microcentrifuge tubes (1.8 ml)	Axygen - Corning Life Sciences	MCT-175C
Falcon round-bottom polypropylene tubes (14 ml)	BD Biosciences	352059
Conical-bottom centrifuge polypropylene tubes (50 ml)	Corning	430828
Serological pipettes (Corning 5 ml)	Corning Life Sciences	4051
Serological pipettes (Corning 10 ml)	Corning Life Sciences	4488
Serological pipettes (Corning 25 ml)	Corning Life Sciences	4251
Spectrophotometer cuvettes	Sarstedt	67.742
RNase-free pipette tips 0.2 - 20 μl	FroggaBio	FT20
RNase-free pipette tips 10 - 200 μl	Axigene/corning	TF-200
RNase-free pipette tips 100 - 1000 μl	FroggaBio	FT1000
RNase-free pipette tips 100 - 1000 μl	Sorenson	14200
Syringe disposile 10 mL needle G-21	Becton Dickinson, Biosciences	BD-309643
Minisart 0.2 um Syringe Filter	Sartorius	16534 K
Nikon instruments microscope type A immersion oil A, 8cc	Nikon	MXA20233
Microscope slides 76 x26, 3"x1"x1mm	Thermo Fisher Scientific	421-004ET
#0 coverslip slide 24x60	Thermo Fisher Scientific/Menzel	BNBB024060A0
Orbital shaker	M.R.C	TOU-50
Hot block	M.R.C
Vortex	Fried Electric Company	G-560-E
Microcentrifuge	Eppendorf	5427R
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Portable Pipet-Aid XP2, Pipette Controller	Drummond Scientific Company	4-000-501-I
OD600 Spectrophotometer for Bacterial Growth Rates DiluPhotometer	Midsci	OD600-10
iXon X3 EMCCD camera	Andor	DU-897E-CS0-#BV
Eclipse Ti microscope	Nikon	MEA53100
CFI plan apochromat DM 100X oil objective lambda PH-3 N.A 1.45 WD 0.13	Nikon	MRD31905
Filter set (TRITC/CY3): EX - ET545/30X; EM - ET620/60M; BS - T570LP	Nikon	49005
Filter set (CY5): EX - ET640/30X; EM - ET690/50M; BS - T660P	Nikon	49009
Nis-elements AR auto reaserch software	Nikon	MQS31000
STORM microscope	Vutara	SR-200
NA 1.2 water immersion objective	Olympus
SRX image acquisition and analysis software	Vutara
Evolve 512 EMCCD camera	Photometrics
Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with CAL Fluor® Red 590 Dye	Biosearch Technologies Inc	SMF-1083-5
Probe Sequence for galK mRNA:
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Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with Quaser Fluor® Red 670 Dye	Biosearch Technologies Inc	SMF-1083-5
Probe Sequence for sodB mRNA:
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